本發(fā)明涉及酶的分離提純方法，具體涉及DON降解酶的提取分離純化方法。

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背景技術(shù)：
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脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素(deoxynivalennol,DON)，又稱嘔吐毒素，是一種單端孢霉烯族化合物，其主要來源為鐮刀菌屬，其中禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌是主要的產(chǎn)毒菌株。DON毒素對糧食的污染情況非常嚴(yán)重，諸如小麥、玉米、燕麥和大麥都會受到DON毒素的污染。其中，小麥被污染后容易引發(fā)小麥赤霉病，導(dǎo)致谷物的活力及其農(nóng)產(chǎn)品的營養(yǎng)價值很大程度上得到降低，農(nóng)業(yè)經(jīng)濟遭受嚴(yán)重的損失。此外，一些畜禽攝入DON量過高，會表現(xiàn)為拒食、嘔吐、免疫力下降、母畜不孕或流產(chǎn)死亡等，慢性蓄積則會導(dǎo)致畜禽食欲減弱、生長緩慢、營養(yǎng)不良、神經(jīng)內(nèi)分泌發(fā)生改變、免疫力遭到抑制等。特別是因DON非中毒劑量的長期攝入引起的畜禽免疫抑制，會導(dǎo)致畜牧業(yè)經(jīng)濟每年蒙受巨大的損失。因此，對DON降解的研究具有非常重要的意義。

DON毒素結(jié)構(gòu)性質(zhì)非常穩(wěn)定，其結(jié)構(gòu)中12,13-環(huán)氧鍵是主要的致毒基團(tuán)，若能將DON結(jié)構(gòu)當(dāng)中的環(huán)氧結(jié)構(gòu)破壞，對DON的解毒具有明顯作用。一般的食品、飼料生產(chǎn)加工過程很難破壞其毒性，現(xiàn)在較為普遍的去除DON毒素的方法主要有物理吸附、化學(xué)處理和生物轉(zhuǎn)化。物理吸附主要是吸附一些有極性的真菌毒素；化學(xué)處理能夠破壞大多數(shù)真菌毒素，但是很容易破壞食品、飼料的營養(yǎng)成分和帶來新的化學(xué)污染。而生物轉(zhuǎn)化或酶降解作用由于其有效性、針對性和環(huán)境友好性，將是未來真菌毒素脫毒的一種趨勢。目前，利用生物轉(zhuǎn)化的方法降解DON已有一定的報道研究；但是通過從微生物中篩選DON降解酶產(chǎn)生菌的報道很少。此外，通過從篩選的微生物中分離純化該功能酶并用于降解DON效果的研究，尚未見報道。

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技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是彌補現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種能夠從微生物中篩選DON降解酶產(chǎn)生菌方法并對DON降解酶的提取分離純化方法。

該方法包括如下步驟：

a.利用DON作為唯一碳源初篩能夠利用DON的菌株，

b.以環(huán)氧化合物為底物，篩選步驟a所得菌株的發(fā)酵液、菌懸液和胞內(nèi)液產(chǎn)還氧化合物降解酶中酶活力最強的菌種，

c.將步驟b所得菌種進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，從菌種中分離出DON降解酶，

d.純化DON降解酶。

該方法還具有如下優(yōu)化工藝步驟：

步驟a中的菌株來自于長期堆放塑料橡膠區(qū)域土壤、環(huán)氧樹脂跑道下層土壤、汽油站廢棄汽油區(qū)域土壤以及食堂下水道土壤。

步驟b中采用苯基環(huán)氧乙烷作為底物。

步驟c中，DON降解酶的分離采用硫酸銨分級分離的方法，先以30％飽和度的硫酸銨沉淀出雜蛋白并除去，再以80％飽和度的硫酸銨沉降粗蛋白沉淀，最后將粗蛋白溶解進(jìn)行透析除去硫酸鹽。

步驟d中，DON降解酶的純化分別經(jīng)DEAE-52纖維素離子交換柱層析，Sephadex G-100凝膠過濾層析，洗脫緩沖液中含0-1.0mol/L不同梯度濃度的NaCl溶液，使不同的蛋白洗脫出來，測定洗脫得到的蛋白的酶活力和蛋白含量，確定酶活力和蛋白含量較高的位置，合并酶活峰，透析除鹽，冷凍干燥，得到純化的DON降解酶。

本發(fā)明通過從篩選的微生物中分離純化DON的降解酶，能夠用于降解DON。相比于其他去除DON毒素的方法，利用DON的降解酶來降解DON，能夠用于食物、飼料的加工和生產(chǎn)。因此，該提取分離純化方法為食物、飼料的加工和生產(chǎn)過程中DON的去除提供了新的思路，具有廣闊的前景。

[具體實施方式]

以下結(jié)合實施例對于本發(fā)明做進(jìn)一步說明，實施例僅用于解釋說明而不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

(1)菌種初篩：利用DON作為唯一碳源初篩能夠利用DON的菌株，步驟如下：

采集長期堆放塑料橡膠區(qū)域土樣(塑料橡膠有腐蝕跡象區(qū)域的土樣為最佳)、環(huán)氧樹脂跑道下層土樣、汽油站附近有廢棄汽油區(qū)域的土樣、食堂下水道附近土樣，稱取1g土樣溶于100ml的無菌水中，充分震蕩后靜置10min，移取上層1mL懸濁液轉(zhuǎn)移至30ml富集培養(yǎng)基中，混合均勻。于30℃，200r/min振蕩培養(yǎng)48h，中間補給一次DON溶液，之后取1mL培養(yǎng)液至新鮮的富集培養(yǎng)基中，按上述方法再培養(yǎng)48h后，吸取少量經(jīng)過無菌水稀釋的培養(yǎng)液在表面涂有一定量DON的平板培養(yǎng)基上涂布，然后倒置平板，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至長出菌落后挑取單一菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，在相同條件下培養(yǎng)72h后置于4℃冰箱中。

富集培養(yǎng)基配方為：(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 6g，KH₂PO₄ 3g，NaCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂ 0.05g，F(xiàn)eSO₄·7H2O 0.001g，ZnSO₄·7H2O 0.001g，酵母膏0.1g，玉米漿0.1g。蒸餾水定容至lL，調(diào)pH值為6.0，分裝后121℃高壓滅菌20min，再分別加入0.2％(v/v)的DON。

中間補給DON溶液濃度為富集培養(yǎng)液的0.2％(v/v)。

涂在平板培養(yǎng)基上DON溶液質(zhì)量濃度為0.1％。

平板培養(yǎng)基配方為：富集培養(yǎng)基(不加DON)中加入15-20g瓊脂

(2)菌種復(fù)篩：以環(huán)氧化合物為底物，篩選步驟a所得菌株的發(fā)酵液、菌懸液和胞內(nèi)液產(chǎn)還氧化合物降解酶中酶活力最強的菌種。

取單一菌落劃線于平板上，經(jīng)種子培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵后，將發(fā)酵液12000r/min離心，分離發(fā)酵液和菌體。菌體用0.1mol/L、pH＝8.0的PBS緩沖液洗滌兩次，破碎菌體提取菌體胞內(nèi)液，用磷酸鹽緩沖液制成菌懸液。

以苯基環(huán)氧乙烷為底物，用酶標(biāo)儀分別測定發(fā)酵液、菌懸液、菌體胞內(nèi)液所產(chǎn)酶降解環(huán)氧化合物的酶活力，挑選酶活力最高的一株菌種進(jìn)行后續(xù)試驗。酶活力的測定方法為：取135μL菌體懸浮液加至1.5ml離心管中，30℃預(yù)保溫5min，加入15μL苯基環(huán)氧乙烷(0.2mol/L),30℃保溫10min，立即加入150μL丙酮，充分振蕩后，取200μL加至微孔板中，然后加入三甘醇二甲醚、三乙胺、0.23mol/L 4-對硝基芐基吡啶各50μL，于39℃保溫45min后，測定其在580nm處的吸光度。同時以15μL丙酮代替苯基環(huán)氧乙烷溶液作對照。定義在上述條件下，每分鐘水解1μmol苯基環(huán)氧乙烷所需的酶量為一個酶活力單位。

霉菌用種子、發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g，玉米粉20g，NaCl 10g，調(diào)pH為4.0，30ml分裝于250ml錐形瓶中，121℃高壓滅菌20min。

細(xì)菌用種子、發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖10g，牛肉膏10g，NaCl 10g，調(diào)pH為7.0，30ml分裝于250ml錐形瓶中，121℃高壓滅菌20min。

細(xì)胞破碎儀參數(shù)為：輸出功率400w，間隔時間10sec，每次裂解時間30sec，裂解總時間30min。

(3)DON降解酶的分離：將所得菌種進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，從菌種中分離出DON降解酶。

發(fā)酵液12000r/min離心15min去上清液，得菌體，用去離子水洗滌菌體2次再加入一定體積的0.1mol/L、pH＝8.0的PBS緩沖液即得菌懸液，菌懸液經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎儀破碎，再低溫高速離心去上清液，加入硫酸銨為30％飽和度，靜置上清液后12000r/min離心20min，冷凍離心，除去雜蛋白，吸取上清液，加硫酸銨直至80％飽和度，離心收集沉淀，用去離子水溶解蛋白沉淀置于透析袋中透析48小時，收集粗酶液，進(jìn)行冷凍干燥。

細(xì)胞破碎儀參數(shù)為：輸出功率400w，間隔時間10sec，每次裂解時間30sec，裂解總時間30min。

(4)DON降解酶的純化。

純酶凍干后，用5mL 0.05mol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)緩沖液溶解后，上預(yù)先采用0.05mol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)緩沖液進(jìn)行平衡DEAE-52陰離子交換柱(1.8×100cm)，，上樣后使用含有0-1.0mol/L的NaCl的同樣緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為1mL/min，收集60管洗脫液，每管5ml，測定每管的酶活力和蛋白含量，合并酶活峰，用0.05mol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)緩沖液透析24h后，冷凍干燥，備用。

將過DEAE-52陰離子交換柱收集的酶用5mL 0.05mol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)緩沖液溶解，上預(yù)先經(jīng)0.05mol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)緩沖液平衡好的Sephadex G-100層析柱(1.6×80cm)進(jìn)行洗脫，洗脫速度1mL/min，收集60管洗脫液，每管5ml，測定每管的酶活力和蛋白含量，合并酶活峰，用0.05mol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)緩沖液透析24h后，冷凍干燥，得到了純化的酶。

緩沖液中NaCl的濃度分別為0.2mol/L，0.4mol/L，0.6mol/L，0.8mol/L，1.0mol/L。

蛋白濃度的測定方法為Bradford法。