本發(fā)明涉及一種生物法生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法，尤其涉及一種通過在工程菌中共表達(dá)賴氨酸專一性透性酶基因lysP和4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911，提高工程菌催化L-賴氨酸加速生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法。

背景技術(shù)：

5-氨基戊酸是一種重要的C5類平臺化合物，在藥物和化工合成領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。它可以用于生產(chǎn)1,5-戊二醇、戊二酸、5-羥基戊酸等一系列化合物【1】，也可以作為原料通過自身聚合或者和其他氨基酸類化合物聚合生成包括尼龍-5和尼龍5,5在內(nèi)的多種聚酰胺(尼龍)類材料。

文獻(xiàn)【1】和【2】分別報(bào)道了采用工程改造的大腸桿菌以葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)5-氨基戊酸，但是產(chǎn)量非常低。目前，L-賴氨酸的年產(chǎn)量達(dá)到220萬噸。由于L-賴氨酸的產(chǎn)能過剩而導(dǎo)致其價(jià)格下降【3】，這使得以L-賴氨酸作為原料“綠色生產(chǎn)”5-氨基戊酸具備了經(jīng)濟(jì)可行性。已有研究者進(jìn)行了催化L-賴氨酸生產(chǎn)5-氨基戊酸的研究，主要包括游離酶催化法和全細(xì)胞催化法。文獻(xiàn)【4】實(shí)現(xiàn)了采用固定化的L-賴氨酸α-氧化酶催化L-賴氨酸生產(chǎn)5-氨基戊酸。文獻(xiàn)【5】通過采用純化的L-賴氨酸-2-單加氧酶(DavB)和δ-氨基戊酰胺水解酶(DavA)，實(shí)現(xiàn)了游離酶催化L-賴氨酸生成5-氨基戊酸。文獻(xiàn)【6】報(bào)道了共表達(dá)L-賴氨酸-2-單加氧酶基因davB和δ-氨基戊酰胺水解酶基因davA的工程改造大腸桿菌W3110，通過不斷流加L-賴氨酸、葡萄糖和MgSO₄混合液的方法實(shí)現(xiàn)了全細(xì)胞催化L-賴氨酸生產(chǎn)5-氨基戊酸。

相對于游離酶催化，全細(xì)胞催化劑由于有細(xì)胞膜的保護(hù)而更加穩(wěn)定，因而也更具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。但是，細(xì)胞膜也會阻礙底物和酶的接觸，從而減緩了催化速率；另一方面，催化產(chǎn)物的積累也會對酶的催化作用產(chǎn)生抑制。因此，通過過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提高5-氨基戊酸的生產(chǎn)效率在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中意義重大。

經(jīng)檢索，通過過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)加速5-氨基戊酸生物法生產(chǎn)的方法尚未有報(bào)道。

參考文獻(xiàn)：

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中全細(xì)胞催化5-氨基戊酸生產(chǎn)過程中由于底物和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)受阻而導(dǎo)致的產(chǎn)量和得率低的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種通過在工程菌中共表達(dá)賴氨酸專一性透性酶基因lysP和4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911，提高工程菌加速催化L-賴氨酸生產(chǎn)5-氨基戊酸的方法。

本發(fā)明所述加速5-氨基戊酸生物法生產(chǎn)的方法，步驟是：

(1)構(gòu)建共表達(dá)賴氨酸專一性透性酶基因lysP和4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911的基因工程大腸桿菌，以其作為全細(xì)胞催化劑用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)5-氨基戊酸；

(2)全細(xì)胞催化劑的培養(yǎng)和收集；

(3)利用生物催化劑轉(zhuǎn)化制備含5-氨基戊酸的轉(zhuǎn)化液；

其特征在于：

步驟(1)所述的基因工程大腸桿菌命名為大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911，該菌含有的4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，含有的賴氨酸專一性透性酶基因lysP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，含有L-賴氨酸-2-單加氧酶的基因davB和δ-氨基戊酰胺水解酶基因davA的核苷酸片段davAB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其構(gòu)建方法如下:

(a)從惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)KT2440基因組中通過PCR方法擴(kuò)增獲得含有L-賴氨酸-2-單加氧酶基因davB和δ-氨基戊酰胺水解酶基因davA的核苷酸片段davAB，并將davAB連接到質(zhì)粒pETDuet-1的多克隆位點(diǎn)1(MCS1)上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pETDuet-DavAB；

(b)從大腸桿菌K12(MG1655)基因組中通過PCR方法擴(kuò)增獲得賴氨酸專一性透性酶基因lysP，并將lysP連接到步驟(a)構(gòu)建的質(zhì)粒pETDuet-DavAB的多克隆位點(diǎn)2(MCS2)上，獲得重組質(zhì)粒pETDuet-DavAB-LysP；

(c)從惡臭假單胞菌KT2440基因組中通過PCR方法擴(kuò)增獲得4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911，并將pp2911連接到質(zhì)粒pACYCDuet-1的多克隆位點(diǎn)1(MCS1)上，獲得重組質(zhì)粒pACYCDuet-PP2911；

(d)將步驟(b)構(gòu)建的質(zhì)粒pETDuet-DavAB-LysP和步驟(c)構(gòu)建的質(zhì)粒pACYCDuet-PP2911都轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到宿主大腸桿菌BL21(DE3)中，篩選獲得基因工程大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911；

步驟(2)所述全細(xì)胞催化劑的培養(yǎng)和收集方法是：

在無菌條件下，將基因工程大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911菌液接種到含有100μg/mL的氨芐青霉素和40μg/mL的氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37±1℃培養(yǎng)2～4小時(shí)使其OD_600nm＝0.6～0.8，然后加入終濃度為1mM的IPTG，25℃誘導(dǎo)10～12小時(shí)；其中所述LB培養(yǎng)基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L，pH 7.0；115℃滅菌20分鐘；

將培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物以6,000±500轉(zhuǎn)/分鐘離心8～10分鐘，收集菌體并用pH 7.4、1/15M的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體2～3遍，然后將菌體置于4℃的冰箱中冷凍保存，即獲得全細(xì)胞催化劑；

步驟(3)所述利用生物催化劑轉(zhuǎn)化制備含5-氨基戊酸的轉(zhuǎn)化液的方法是：

以細(xì)胞濃度為OD_600nm＝15～75的全細(xì)胞催化劑，在20～50℃、pH 7.0條件下轉(zhuǎn)化濃度為10～60g/L的L-賴氨酸，經(jīng)120±10轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)24～48小時(shí)后，得到含5-氨基戊酸的轉(zhuǎn)化液。

將制得的轉(zhuǎn)化液，以13,000±500轉(zhuǎn)/分鐘離心10～15分鐘，去除所加入的生物催化劑，使用PITC衍生后高效液相色譜分析測定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中L-賴氨酸和5-氨基戊酸的濃度。

上述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測方法：

PITC衍生：將樣品煮沸10min，14680轉(zhuǎn)/分鐘離心15min；取400μL樣品上清、200μL PITC-乙腈溶液(0.1mol/L)和200μL三乙胺-乙腈溶液(1mol/L)混勻，室溫靜置衍生1h；然后加入800μL正己烷，渦旋振蕩1min，靜置萃取10min；用1mL注射器吸取下層溶液，0.22μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測分析。

HPLC檢測：所用高效液相色譜儀的型號是Agilent 1100Hewlett-Packard，配備UV-Vis檢測器，檢測波長為254nm。色譜柱為ZORBAX SB-C18(5μm，4.6mm×150mm)，柱溫38℃。檢測時(shí)間為40min，流動相A：0.1mol/L pH 6.5的乙酸銨-乙腈(v/v，97:3)溶液，B：乙腈。流速0.6mL/min，進(jìn)樣量10μL。線性梯度洗脫：0～20min內(nèi)流動相A的比例由82％降至70％，在隨后的20min維持70％。

上述加速5-氨基戊酸生物法生產(chǎn)的方法中：步驟(3)所述全細(xì)胞催化劑的細(xì)胞濃度優(yōu)選為OD_600nm＝60。

上述加速5-氨基戊酸生物法生產(chǎn)的方法中：步驟(3)所述轉(zhuǎn)化底物L(fēng)-賴氨酸的濃度優(yōu)選為40g/L。

上述加速5-氨基戊酸生物法生產(chǎn)的方法中：步驟(3)所述轉(zhuǎn)化條件優(yōu)選是：30℃、pH 7.0條件，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)48小時(shí)。

本發(fā)明公開了一種加速5-氨基戊酸生物法生產(chǎn)的方法，該方法是通過構(gòu)建工程菌并在該菌中過表達(dá)賴氨酸專一性透性酶基因lysP和4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911，提高工程菌催化L-賴氨酸生產(chǎn)5-氨基戊酸的生產(chǎn)速率和得率。從L-賴氨酸生物法生產(chǎn)5-氨基戊酸是通過在大腸桿菌中共表達(dá)L-賴氨酸-2-單加氧酶基因davB和δ-氨基戊酰胺水解酶基因davA實(shí)現(xiàn)的。該方法涉及的催化機(jī)理如圖1所示。

本發(fā)明方法具有如下顯著特點(diǎn)：

(1)通過使用基因工程大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911作為生物催化劑催化L-賴氨酸生物法生產(chǎn)5-氨基戊酸，其中通過共表達(dá)L-賴氨酸2-單加氧酶基因davB和δ-氨基戊酰胺水解酶基因davA使得工程菌具備了催化L-賴氨酸生物法生產(chǎn)5-氨基戊酸的能力。

(2)通過過表達(dá)4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911，提高基因工程菌對催化產(chǎn)物5-氨基戊酸的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，降低由于5-氨基戊酸的積累而導(dǎo)致的催化速率和得率的下降。

(3)構(gòu)建的工程菌株中賴氨酸專一性透性酶基因lysP和4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911負(fù)責(zé)底物和產(chǎn)物跨膜定向轉(zhuǎn)運(yùn)，提高5-氨基戊酸的生產(chǎn)速率和得率。

(4)相比只表達(dá)L-賴氨酸-2-單加氧酶基因davB和δ-氨基戊酰胺水解酶基因davA的重組菌，過表達(dá)4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911和賴氨酸專一性透性酶基因lysP使得工程菌中5-氨基戊酸的產(chǎn)量提高了67.3％，轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.94mol/mol。

(5)利用本發(fā)明構(gòu)建的生物催化劑催化L-賴氨酸生產(chǎn)5-氨基戊酸，產(chǎn)物分離純化操作簡單，耗費(fèi)較低。

附圖說明

圖1：利用基因工程大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911催化L-賴氨酸生產(chǎn)5-氨基戊酸作用機(jī)理示意圖。

圖2：基因工程大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911構(gòu)建過程中涉及的質(zhì)粒構(gòu)建過程示意圖。

其中：A，pETDuet-1；B，pETDuet-DavAB；C，pETDuet-DavAB-LysP；D，pACYCDuet-1；E，pACYCDuet-PP2911。

圖3：重組大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911催化L-賴氨酸生產(chǎn)5-氨基戊酸過程曲線。

圖4：3株重組大腸桿菌催化L-賴氨酸消耗和5-氨基戊酸生產(chǎn)過程曲線。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例中所采用的惡臭假單胞菌KT2440購自美國ATCC生物資源中心，菌株編號為：ATCC 47054；所采用的大腸桿菌K12(MG1655)購自美國ATCC生物資源中心，菌種編號為：ATCC 700926。本發(fā)明中所采用的蛋白表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)購買于美國Novagen公司。

本發(fā)明實(shí)施例中所采用的質(zhì)粒pETDuet-1和pACYCDuet-1購買于美國Novagen公司，所采用的pEASY-Blunt載體購買于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

LB培養(yǎng)基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L，pH 7.0；115℃滅菌20分鐘。

實(shí)施例1：共表達(dá)4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911和賴氨酸專一性透性酶基因lysP的5-氨基戊酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建

(1)基因davAB的克?。翰捎贸Ｒ?guī)的方法制備菌株惡臭假單胞菌KT2440的基因組DNA，該過程參考科學(xué)出版社出版的《精編分子生物學(xué)指南》中基因組的小量制備的方法。使用合成的引物從惡臭假單胞菌KT2440的基因組DNA中PCR擴(kuò)增獲得基因davAB；

惡臭假單胞菌KT2440作為davAB基因的來源菌，根據(jù)已測序的該菌的基因組序列，設(shè)計(jì)引物，引入能插入質(zhì)粒pETDute-1多克隆位點(diǎn)1(MCS1)的BamHI和HindIII限制性酶切位點(diǎn)，其中所述引物序列如下：

上游引物：5’-GGATCCGATGAACAAGAAGAACCGCCAC-3’，攜帶一個(gè)BamHI位點(diǎn)；

下游引物：5’-AAGCTTTCAGCCTTTACGCAGGTG-3’，攜帶一個(gè)HindIII位點(diǎn)。

將步驟(1)PCR擴(kuò)增獲得的片段和pETDuet-1質(zhì)粒經(jīng)BamHI、HindIII雙酶切，回收片段davAB和pETDuet-1，使用T4DNA連接酶連接，獲得重組質(zhì)粒pETDuet-DavAB。質(zhì)粒構(gòu)建過程如圖2所示。

(2)基因lysP的克?。翰捎貌襟E(1)公開的方法制備大腸桿菌K12(MG1655)的基因組DNA，使用合成的引物從該基因組中PCR擴(kuò)增獲得賴氨酸專一性透性酶基因lysP；

大腸桿菌K12(MG1655)作為lysP基因的來源菌，根據(jù)已測序的該菌基因組序列，設(shè)計(jì)引物，引入能夠插入到pETDuet-DavAB(步驟1)多克隆位點(diǎn)2(MCS2)的NdeI、KpnI限制性酶切位點(diǎn)，其中所述引物序列如下：

上游引物5’-CATATGATGGTTTCCGAAACTAAAAC-3’，攜帶一個(gè)NdeI位點(diǎn)；

下游引物5’-GGTACCTTATTTCTTATCGTTCTGCGG-3’，攜帶一個(gè)KpnI位點(diǎn)。

將步驟(2)PCR擴(kuò)增獲得的片段和pEASY-Blunt載體連接獲得重組質(zhì)粒pEASY-Blunt-LysP。將質(zhì)粒pEASY-Blunt-LysP和pETDuet-DavAB使用NdeI和KpnI雙酶切，回收片段lysP和pETDuet-DavAB，連接，得到重組質(zhì)粒pETDuet-DavAB-LysP。質(zhì)粒構(gòu)建過程如圖2所示。

(3)基因pp2911的克?。翰捎貌襟E(1)中公開的方法制備惡臭假單胞菌KT2440的基因組DNA，使用合成的引物PCR擴(kuò)增獲得4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911；

引物設(shè)計(jì)時(shí)，引入能夠插入到質(zhì)粒pACYCDuet-1的BamHI和HindIII限制性酶切位點(diǎn)，其中所述引物序列如下：

上游引物5’-GGATCCGATGCAAACCCACAAGAACAAT-3’，攜帶一個(gè)BamHI位點(diǎn)；

下游引物5’-AAGCTTTCAGGCGCCCTGCCCTA-3’，攜帶一個(gè)HindIII位點(diǎn)。

將上述PCR擴(kuò)增片段和pACYCDuet-1使用BamHI、HindIII雙酶切，回收片段pp2911和pACYCDuet-1，連接，獲得重組質(zhì)粒pACYCDuet-PP2911。質(zhì)粒構(gòu)建過程如圖2所示。

(4)將步驟(3)構(gòu)建的質(zhì)粒pACYCDuet-PP2911轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到宿主大腸桿菌BL21(DE3)中，采用含有40μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基篩選獲得重組大腸桿菌BL21/pACYCDuet-PP2911；將步驟(2)構(gòu)建的質(zhì)粒pETDuet-DavAB-LysP轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到宿主大腸桿菌BL21/pACYCDuet-PP2911中，采用含有100μg/mL的氨芐青霉素和40μg/mL的氯霉素的LB培養(yǎng)基篩選獲得基因工程大腸桿菌，該菌命名為大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911。其中，所述菌中含有的4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911的基因序列長度為1392個(gè)堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；賴氨酸專一性透性酶基因lysP的基因序列長度為1470個(gè)堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；含有L-賴氨酸-2-單加氧酶的基因davB和δ-氨基戊酰胺水解酶基因davA的核酸序列davAB長度為2492個(gè)堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述獲得的基因工程大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911為革蘭氏陰性菌，需氧或兼性厭氧生長，較佳的培養(yǎng)溫度為37±1℃，可以在含有100μg/mL的氨芐青霉素和40μg/mL的氯霉素的LB培養(yǎng)基中生長。

實(shí)施例2：全細(xì)胞催化劑的制備

(1)平板培養(yǎng)：將大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911劃線到含有質(zhì)量體積比為1.5～1.8％瓊脂并含有100μg/mL氨芐青霉素和40μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12小時(shí)；

(2)一級種子：在無菌的條件下，用無菌的牙簽挑取步驟(1)平板上的一個(gè)單菌落，然后接種到5mL含有100μg/mL氨芐青霉素和40μg/mL氯霉素的的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)12小時(shí)；

(3)二級種子：在無菌條件下，取步驟(2)所培養(yǎng)的菌液以體積比為1％的接種量，接種到100mL的含有100μg/mL氨芐青霉素和40μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)12小時(shí)；

(4)搖瓶培養(yǎng)：在無菌條件下，取步驟(3)所得的菌液以體積比為20％的接種量接種到1L的含有100μg/mL氨芐青霉素和40μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)約2小時(shí)使其OD_600nm＝0.6～0.8，加入終濃度為1mM的IPTG，25℃誘導(dǎo)10～12小時(shí)；

(5)收集菌體：將步驟(4)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物以6,000±500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；并用pH 7.4、1/15M的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體2～3遍，然后將菌體置于4℃的冰箱中冷凍保存，即獲得全細(xì)胞催化劑，待用。

實(shí)施例3：利用實(shí)施例2得到的生物催化劑制備5-氨基戊酸

轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：以細(xì)胞濃度為OD_600nm＝60的全細(xì)胞催化劑，在30℃、pH 7.0條件下轉(zhuǎn)化濃度為40g/L的L-賴氨酸，經(jīng)120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)48小時(shí)后，得到含5-氨基戊酸的轉(zhuǎn)化液。

反應(yīng)結(jié)束時(shí)收集轉(zhuǎn)化液，以13,000±500轉(zhuǎn)/分種離心10～15分鐘，去除所加入的生物催化劑，上清采用PITC法衍生，測定轉(zhuǎn)化液中L-賴氨酸和5-氨基戊酸的濃度。

轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖3所示：最終消耗L-賴氨酸38.6g/L，產(chǎn)生5-氨基戊酸29.6g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.96mol/mol。

實(shí)施例4：驗(yàn)證4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PP2911和賴氨酸專一性透性酶LysP在加速5-氨基戊酸生物法生產(chǎn)中的作用

將實(shí)施例1步驟(1)中構(gòu)建的質(zhì)粒pETDuet-DavAB轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中獲得重組菌株大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB；將實(shí)施例1步驟(3)中構(gòu)建的質(zhì)粒pACYCDuet-PP2911轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB中獲得重組菌株大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB/pACYCDuet-PP2911。

以實(shí)施例2公開的方法分別制備大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB、大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB/pACYCDuet-PP2911和大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911作為生物催化劑。其中在培養(yǎng)大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB時(shí)采用LB培養(yǎng)基添加100μg/mL的氨芐青霉素。

分別使用上述制得的生物催化劑，其中催化劑的細(xì)胞濃度為OD_600nm＝30，在30℃，pH 7.0條件下轉(zhuǎn)化濃度為20g/L的L-賴氨酸；經(jīng)120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)24小時(shí)后，得到含5-氨基戊酸的轉(zhuǎn)化液。

反應(yīng)結(jié)束時(shí)收集轉(zhuǎn)化液，以13,000±500轉(zhuǎn)/分鐘離心10～15分鐘，去除所加入的生物催化劑，上清采用PITC法衍生，測定轉(zhuǎn)化液中L-賴氨酸和5-氨基戊酸的濃度。

轉(zhuǎn)化結(jié)果如表1所示。

表1：過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對5-氨基戊酸生產(chǎn)及得率影響

結(jié)果顯示：與只表達(dá)L-賴氨酸2-單加氧酶DavB和δ-氨基戊酰胺水解酶DavA的重組菌株相比，過表達(dá)4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PP2911的工程菌株的5-氨基戊酸產(chǎn)量提升60.4％，轉(zhuǎn)化率由0.86mol/mol升高到0.90mol/mol。采用共表達(dá)賴氨酸專一性透性酶基因lysP和4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911的工程菌株大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911，使得5-氨基戊酸的產(chǎn)量、生產(chǎn)速率、得率都有進(jìn)一步的提高。

3株重組菌催化L-賴氨酸生產(chǎn)5-氨基戊酸過程曲線如圖4所示。