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      一種加速5?氨基戊酸生物法生產(chǎn)的方法與流程

      文檔序號:11936792閱讀:來源:國知局

      技術(shù)特征:

      1.一種加速5-氨基戊酸生物法生產(chǎn)的方法,步驟是:

      (1)構(gòu)建共表達(dá)賴氨酸專一性透性酶基因lysP和4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911的基因工程大腸桿菌,以其作為全細(xì)胞催化劑用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)5-氨基戊酸;

      (2)全細(xì)胞催化劑的培養(yǎng)和收集;

      (3)利用生物催化劑轉(zhuǎn)化制備含5-氨基戊酸的轉(zhuǎn)化液;

      其特征在于:

      步驟(1)所述的基因工程大腸桿菌命名為大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911,該菌株含有的4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,含有的賴氨酸專一性透性酶基因lysP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,含有L-賴氨酸-2-單加氧酶的基因davB和δ-氨基戊酰胺水解酶基因davA的核苷酸片段davAB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;其構(gòu)建方法如下:

      (a)從惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)KT2440基因組中通過PCR方法擴(kuò)增獲得含有L-賴氨酸-2-單加氧酶基因davB和δ-氨基戊酰胺水解酶基因davA的核苷酸片段davAB,并將davAB連接到質(zhì)粒pETDuet-1的多克隆位點1(MCS1)上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pETDuet-DavAB;

      (b)從大腸桿菌K12(MG1655)基因組中通過PCR方法擴(kuò)增獲得賴氨酸專一性透性酶基因lysP,并將lysP連接到步驟(a)構(gòu)建的質(zhì)粒pETDuet-DavAB的多克隆位點2(MCS2)上,獲得重組質(zhì)粒pETDuet-DavAB-LysP;

      (c)從惡臭假單胞菌KT2440基因組中通過PCR方法擴(kuò)增獲得4-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因pp2911,并將pp2911連接到質(zhì)粒pACYCDuet-1的多克隆位點1(MCS1)上,獲得重組質(zhì)粒pACYCDuet-PP2911;

      (d)將步驟(b)構(gòu)建的質(zhì)粒pETDuet-DavAB-LysP和步驟(c)構(gòu)建的質(zhì)粒pACYCDuet-PP2911轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到宿主大腸桿菌BL21(DE3)中,篩選獲得基因工程大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911;

      步驟(2)所述全細(xì)胞催化劑的培養(yǎng)和收集方法是:

      在無菌條件下,將基因工程大腸桿菌BL21/pETDuet-DavAB-LysP/pACYCDuet-PP2911菌液接種到含有100μg/mL氨芐青霉素和40μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37±1℃培養(yǎng)2~4小時使其OD600nm=0.6~0.8,然后加入終濃度為1mM的IPTG,25℃誘導(dǎo)10~12小時;

      將培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物以6,000±500轉(zhuǎn)/分鐘離心8~10分鐘,收集菌體并用pH 7.4、1/15M的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體2~3遍,然后將菌體置于4℃的冰箱中冷凍保存,即獲得全細(xì)胞催化劑;

      步驟(3)所述利用生物催化劑轉(zhuǎn)化制備含5-氨基戊酸的轉(zhuǎn)化液的方法是:

      以細(xì)胞濃度為OD600nm=15~75的全細(xì)胞催化劑,在20~50℃、pH 7.0條件下轉(zhuǎn)化濃度為10~60g/L的L-賴氨酸,經(jīng)120±10轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)24~48小時后,得到含5-氨基戊酸的轉(zhuǎn)化液。

      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述加速5-氨基戊酸生物法生產(chǎn)的方法,其特征在于:步驟(3)所述全細(xì)胞催化劑的細(xì)胞濃度為OD600nm=60。

      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述加速5-氨基戊酸生物法生產(chǎn)的方法,其特征在于:步驟(3)所述轉(zhuǎn)化底物L(fēng)-賴氨酸的濃度為40g/L。

      4.根據(jù)權(quán)利要求1所述加速5-氨基戊酸生物法生產(chǎn)的方法,其特征在于:步驟(3)所述轉(zhuǎn)化條件是:30℃、pH 7.0條件,120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)48小時。

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