本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，具體涉及一種從青稞谷粒中提取和純化β-葡聚糖的方法。

背景技術(shù)：

β-葡聚糖(β-glucan)是一種線性無(wú)分支粘性多糖，其異碳頭糖苷鍵連接方式為β型，通過(guò)β-(1→3)和β-(1→4)糖苷鍵把β-D-吡喃葡萄糖單位連接而成，廣泛分布于動(dòng)植物及微生物界。谷物中的β-葡聚糖化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，但分子中β-(1→3)和β-(1→4)糖苷鍵所占比率存在差異。β-葡聚糖的水溶性與這兩種糖苷鍵的比例有關(guān)。一般而言，水溶性β-葡聚糖中β-(1→4)糖苷鍵與β-(1→3)糖苷鍵的比例是2.3:1，而非水溶性β-葡聚糖中這一比例較高。根據(jù)報(bào)道，β-葡聚糖具有：1)降低血清膽固醇，預(yù)防心血管疾病；2)調(diào)節(jié)血糖水平，預(yù)防糖尿病；3)促進(jìn)腸道益生菌增殖，預(yù)防腸癌；4)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等功效，應(yīng)用前景廣泛。

青稞生長(zhǎng)在嚴(yán)寒缺氧的高原地帶，是藏族人民每日飲食當(dāng)中最主要的碳水化合物來(lái)源，具有突出的醫(yī)療保健功效，被認(rèn)為是藏族人民長(zhǎng)壽的重要因素之一。嚴(yán)寒、缺氧、干燥、強(qiáng)光照射等特殊環(huán)境使得青稞獲得了極強(qiáng)的抗逆性，產(chǎn)生了十分豐富的次生代謝產(chǎn)物。青稞也因其營(yíng)養(yǎng)組成全面且獨(dú)特、食療價(jià)值高而越來(lái)越受到民眾青睞。

有學(xué)者指出，青稞中的β-葡聚糖含量普遍高于世界其它地區(qū)種植的大麥品種。因此β-葡聚糖也被認(rèn)為是青稞中與人體健康和長(zhǎng)壽關(guān)系最為密切的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。關(guān)于β-葡聚糖的提取，報(bào)道的提取溶劑有熱水、冷水、酸、堿、二甲亞砜等，提取溫度從室溫到100℃不等，料水比(m/V)在1:10到1:50之間，提取時(shí)間30min到22h不等。借鑒專(zhuān)家學(xué)者對(duì)谷物中β-葡聚糖的研究方法，我們優(yōu)化提取方法及其工藝，成功從青稞谷粒中分離純化得到高純度的β-葡聚糖。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從青稞谷粒中提取和純化β-葡聚糖的方法。以青稞谷粒為原料，經(jīng)過(guò)研磨、過(guò)篩、酶解、醇沉、真空冷凍干燥、脫 脂得到粗制樣品，其溶解后再依次經(jīng)由填料cellulose DE-32和S-400洗脫得到純化樣品。所述方法能有效從青稞谷粒中分離得到高純度的β-葡聚糖，可用于其結(jié)構(gòu)解析、理化性質(zhì)鑒定及生物活性研究等。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下方案：

本發(fā)明涉及一種從青稞谷粒中提取和純化β-葡聚糖的方法，包括以下步驟：

A1、原料預(yù)處理：將選出的青稞谷粒研磨后過(guò)0.4mm篩網(wǎng)，即得粉末樣品；

A2、酶解：將粉末樣品加蒸餾水溶解，依次加入耐高溫α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、糖化酶進(jìn)行酶解，將酶解液離心，得上清液a；

A3、醇沉：在上清液a中滴加無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜后離心，得醇沉沉淀物；

A4、真空冷凍干燥：醇沉沉淀物用蒸餾水復(fù)溶，60～90℃水浴蒸發(fā)濃縮，所得濃縮液-20℃下冷凍后，真空冷凍干燥24～48h，得固體粉末；

A5、脫脂：將固體粉末在60～90℃水浴條件下反復(fù)抽提6～8h；然后30～50℃下烘干即得粗制樣品；

A6、洗脫：取粗制樣品加蒸餾水溶解后離心，得上清液b，將上清液b先經(jīng)DE-32洗脫，再經(jīng)S-400洗脫后即可得到高純度β-葡聚糖。

優(yōu)選地，步驟A2中，所述酶解的具體采用以下方法：在溶解后的粉末樣品中加入耐高溫α-淀粉酶，80～100℃水浴1～2h；水浴溫度調(diào)至60～80℃，加入木瓜蛋白酶，水浴1～2h；100℃水浴滅酶10～20min，冷卻后加入糖化酶，60～80℃水浴1～2h；100℃水浴滅酶10～20min，冷卻后60～90℃水浴2～4h，得酶解液。

優(yōu)選地，所述固體樣品以10g計(jì)，耐高溫α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、糖化酶的加入量分別為50～100μL、10～20mg、100～500μL。

優(yōu)選地，步驟A3中，所述上清液a與無(wú)水乙醇的體積比為1：2～3。

優(yōu)選地，所述離心的條件均為：轉(zhuǎn)速3000rmp、離心15min。

優(yōu)選地，步驟A5中，所述抽提的溶劑為正己烷。

優(yōu)選地，所述經(jīng)DE-32洗脫時(shí)，流速為0.1～1.0mL/min，流動(dòng)相為蒸餾水；層析柱的規(guī)格為：2.6cm x 30cm。

優(yōu)選地，所述經(jīng)S-400洗脫時(shí)，流速為0.1～1.0mL/min，流動(dòng)相為蒸餾水；層析柱的規(guī)格為：1.6cm x 100cm。

優(yōu)選地，所述上清液b經(jīng)S-400洗脫后分開(kāi)收集單一糖分的濾液，將含β-葡聚糖的濾液經(jīng)60～90℃水浴蒸發(fā)濃縮至約5mL；-20℃冷凍后，真空冷凍干燥24～48h即得 純化的β-葡聚糖。

優(yōu)選地，所述單一糖分的濾液的糖分純度采用高效液相色譜儀測(cè)定，采用的糖柱型號(hào)為SUGAR KS-805檢測(cè)器溫度為30℃，柱溫為30～60℃；流動(dòng)相為蒸餾水，流速為0.5～1.0mL/min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

1.酶解階段充分去除淀粉、蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)，分離除去水不溶性非淀粉多糖而保留水溶性非淀粉多糖成分，極大地提高了β-葡聚糖的純度和提取率；

2.脫脂步驟置于酶解步驟之后，極大地提高脫脂效率并節(jié)約時(shí)間、減少物力消耗；

3.采用離子交換纖維素DE-32去除色素等小分子物質(zhì)、葡萄糖樹(shù)脂S-400分離不同分子量的未知多糖組分，效率高、效果好。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：

圖1為分離純化青稞谷粒中β-葡聚糖的流程圖；

圖2為實(shí)施例1測(cè)定β-葡聚糖濾液中單糖組成的氣相色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例提供了一種從青稞谷粒中提取和純化β-葡聚糖的方法，流程如圖1所示，具體步驟如下：

分選若干無(wú)病變等正常青稞谷粒，研磨、過(guò)0.4mm篩網(wǎng)；稱(chēng)取10g粉末狀樣品加90mL蒸餾水溶解，加入50μL耐高溫α-淀粉酶，80℃水浴1h；水浴溫度調(diào)至60℃，加入15mg木瓜蛋白酶，水浴1h；100℃水浴滅酶10min，冷卻后加入400μL糖化酶，60℃水浴1h；100℃水浴滅酶10min，冷卻后86℃水浴4h；酶解液3000轉(zhuǎn)離心15min， 沉淀物留存，上清液備用。

上清液在磁力攪拌的條件下緩慢滴加3倍體積無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜；3000轉(zhuǎn)離心15min，醇沉液棄去，沉淀物用適量蒸餾水復(fù)溶，90℃水浴蒸發(fā)濃縮至約10mL；-20℃冷凍，真空冷凍干燥24h,將得到的固體粉末置于索氏提取裝置中，用正己烷作溶劑，90℃水浴條件下反復(fù)抽提6-8h；40℃低溫烘干即得粗制樣品，即酶解后處理得到的粗多糖粉末。

取0.5g粗制樣品加蒸餾水溶解，3000轉(zhuǎn)離心15min；上清液經(jīng)由DE-32洗脫，流動(dòng)相為蒸餾水在流速0.2mL/min條件下按3mL/管收集100管；苯酚—硫酸法遴選有糖試管，合并濾液；90℃水浴蒸發(fā)濃縮至約2mL。

濃縮液再由S-400洗脫，流動(dòng)相為蒸餾水，在流速0.2mL/min條件下按3mL/管收集100管；苯酚—硫酸法遴選有糖試管，采用氣相色譜儀測(cè)定各有糖試管種綠葉的糖分組成，采用高效液相色譜儀(配備示差檢測(cè)器Waters 2414，糖柱SUGAR KS-805 檢測(cè)條件：檢測(cè)器溫度30℃、柱溫35℃，流動(dòng)相為蒸餾水，流速為1mL/min)依次測(cè)定各有糖試管中濾液的糖分純度，合并單一糖分相同且純度>90％的濾液，并按單一糖分不同分開(kāi)收集；所得的β-葡聚糖濾液，然后經(jīng)90℃水浴蒸發(fā)濃縮至約5mL；-20℃冷凍，真空冷凍干燥24h即得純化的β-葡聚糖。

根據(jù)氣相色譜儀測(cè)定β-葡聚糖濾液的糖分組成如圖2所示，該濾液中含有大量的葡萄糖。進(jìn)一步的，采用β-1,3葡聚糖檢測(cè)試劑盒對(duì)葡萄糖進(jìn)行鑒定，其結(jié)果表明該濾液中的葡萄糖為β-葡聚糖。根據(jù)液相色譜檢測(cè)結(jié)果可知β-葡聚糖的純度為98.68％，酶解后得到的粗制樣品經(jīng)洗脫后得到的β-葡聚糖的提取率為31.1％。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例提供了一種從青稞谷粒中提取和純化β-葡聚糖的方法，與實(shí)施例1的方法基本相同，區(qū)別僅在于DE-32和S-400的洗脫流速不同，即實(shí)施例2中DE-32和S-400的洗脫流速均為0.5mL/min。

本實(shí)施例收集的β-葡聚糖濾液根據(jù)氣相色譜儀測(cè)定其的糖分組成可知，該濾液中含有大量的葡萄糖。進(jìn)一步的，采用β-1,3葡聚糖檢測(cè)試劑盒對(duì)葡萄糖進(jìn)行鑒定，其結(jié)果表明該濾液中的葡萄糖為β-葡聚糖。根據(jù)液相色譜檢測(cè)結(jié)果可知本實(shí)施例制備的β-葡聚糖純度為97.63％，酶解后得到的粗制樣品經(jīng)洗脫后得到的β-葡聚糖的提取率為11.6％。與實(shí)施例1相比，本實(shí)施例的純度與實(shí)施例1相當(dāng)，但粗制樣品經(jīng)洗脫后得到的β-葡聚糖的提取率下降，這是由于洗脫流速慢的時(shí)候，各組分未知多糖按 分子量的大小緩緩經(jīng)由洗脫流出，這時(shí)的分離效果比較好；洗脫速度快的時(shí)候，各組分未知多糖洗脫流出出現(xiàn)重疊，分離效果變差，提取率也自然降低。

對(duì)比例1：

對(duì)比例1和實(shí)施例1的區(qū)別在于：DE-32和S-400的洗脫順序不同，即對(duì)比例1中先用S-400洗脫再用DE-32洗脫。其它操作同實(shí)施例1。

采用該對(duì)比例的方法不能分離出單一組分的糖，即本發(fā)明制備的多糖為混合多糖，不能分離純化出β-葡聚糖。粗制樣品經(jīng)洗脫后所得的混合多糖的提取率為27.6％。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。