本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種生物轉(zhuǎn)化纖維素水解液生產(chǎn)D-1,2,4-丁三醇的方法。

背景技術(shù)：

D-1,2,4-丁三醇是一種重要的非天然多元醇，是許多天然產(chǎn)物合成中的重要底物，也是許多手性化合物的合成前體。在軍事上，D-1,2,4-丁三醇可以用來合成作為火箭推進(jìn)劑的丁三醇三硝酸酯(BTTN)。在醫(yī)藥方面，D-1,2,4-丁三醇可以用來制備降膽固醇類藥Movinolin、抗癌藥物compatin、治療皮膚病藥物羥基二十碳四烯酸(12-HETE)及艾滋病藥物3-羥基-四氫呋喃等。

目前1,2,4-丁三醇的商業(yè)生產(chǎn)多采用化學(xué)合成法，如Adkins 等報(bào)道利用蘋果酸還原的方法，使用不同的催化劑(Cu-Cr, Cu-Al, Ru-Re)，在2900-5000 psi 的H2壓力下和60-160 oC的條件下，可將蘋果酸以60%-80%的轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇。該方法存在反應(yīng)條件苛刻，環(huán)境污染嚴(yán)重，生產(chǎn)危險(xiǎn)性大，副產(chǎn)物多等弊端。近年來，以生物法合成丁三醇的研究受到廣泛關(guān)注。

生物丁三醇傳統(tǒng)生產(chǎn)方法會(huì)消耗大量農(nóng)產(chǎn)品，為此研究利用多種生物基廢料生產(chǎn)丁醇的新技術(shù)，解決與人爭(zhēng)糧的問題，以非糧作物為原材料生產(chǎn)生物丁三醇是未來發(fā)展的方向。木質(zhì)纖維素原料充足而廉價(jià)，如果能將之利用，不僅改善了農(nóng)作物廢物燃燒對(duì)大氣的環(huán)境污染，也提高了廢棄物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)為能源緊缺提供一條可持續(xù)發(fā)展道路。

目前國(guó)內(nèi)外丁三醇發(fā)酵方面的研究多集中在直接以木糖為原料上，且產(chǎn)量不高，一般在0.88-3.96g/L，以纖維素為原料的還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種生物轉(zhuǎn)化纖維素水解液生產(chǎn)D-1,2,4-丁三醇的方法，降低了生產(chǎn)成本的同時(shí)提高了1,2,4-丁三醇的產(chǎn)量。

為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案：

一種生物轉(zhuǎn)化纖維素水解液生產(chǎn)D-1,2,4-丁三醇的方法，構(gòu)建克隆表達(dá)2-酮酸脫羧酶和D-木糖脫氫酶，木糖酸脫水酶和醇脫氫酶的基因，并將構(gòu)建好的基因轉(zhuǎn)入敲除木糖異構(gòu)酶的宿主菌的細(xì)胞內(nèi)得基因工程菌，培養(yǎng)基因工程菌并接種至纖維素水解液中發(fā)酵生產(chǎn)D-1,2,4-丁三醇。

作為優(yōu)選的是，所述的2-酮酸脫羧酶（mdlC）,GenBank: AY143338.1 ；D-木糖脫氫酶（xylB）,Gene ID: 7329904；木糖酸脫水酶（yjhG）,Gene ID: 946829；醇脫氫酶（adhP）,Gene ID:00 946036；木糖異構(gòu)酶（xylA）,Gene ID: 948141。

作為優(yōu)選的是，所述的宿主菌為大腸桿菌BL21（DE3）。

作為上述方法優(yōu)選的是，具體包括以下步驟：

步驟1，構(gòu)建克隆表達(dá)2-酮酸脫羧酶（mdlC）,D-木糖脫氫酶（xylB）,木糖酸脫水酶（yjhG）和醇脫氫酶（adhP）,敲除宿主菌木糖利用和D-BT 合成中間代謝物分解途徑中木糖異構(gòu)酶（xylA）的基因，得基因工程菌；

步驟2，木質(zhì)纖維素的水解及預(yù)處理

將稀硫酸與玉米芯混合后的懸浮水解液經(jīng)高溫滅菌后，加入Ca(OH)₂溶液調(diào)節(jié)pH至7.2，過濾后向?yàn)V液中加入活性炭，再過濾得玉米芯水解液；

步驟3，發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

每升玉米芯水解液中加入10g/L Nacl, 5g/L酵母粉和10g/L蛋白胨，滅菌備用；

步驟4，將基因工程菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵得產(chǎn)物D-1,2,4-丁三醇。

作為步驟2優(yōu)選是，所述步驟2中稀硫酸的體積分?jǐn)?shù)為2%，玉米芯與稀硫酸的質(zhì)量體積比為1:5，活性炭與濾液的質(zhì)量體積比為2%。

作為步驟4優(yōu)選的是，發(fā)酵72h。

有益效果

本發(fā)明以纖維素為原料，通過構(gòu)建基因工程菌的方法來生產(chǎn)D-1,2,4-丁三醇，減少了支路途徑，提高了1，2，4-丁三醇的產(chǎn)率，同時(shí)節(jié)約了成本，提高了產(chǎn)物的純度，可大規(guī)模生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為培養(yǎng)溫度對(duì)以玉米芯水解液為底物生產(chǎn)丁三醇的影響；

圖2為培養(yǎng)溫度37℃加入緩沖液后以玉米芯水解液為底物生產(chǎn)丁三醇。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例可使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1 構(gòu)建基因工程菌

構(gòu)建克隆表達(dá)2-酮酸脫羧酶（mdlC）,D-木糖脫氫酶（xylB）,木糖酸脫水酶（yjhG）和醇脫氫酶（adhP）,敲除宿主菌木糖利用和D-BT 合成中間代謝物分解途徑中木糖異構(gòu)酶（xylA）的基因，得基因工程菌，其中，2-酮酸脫羧酶（mdlC）,GenBank: AY143338.1 ；D-木糖脫氫酶（xylB）,Gene ID: 7329904；木糖酸脫水酶（yjhG）,Gene ID: 946829；醇脫氫酶（adhP）,Gene ID:00 946036；木糖異構(gòu)酶（xylA）,Gene ID: 948141。

實(shí)施例2 不同的發(fā)酵溫度對(duì)以玉米芯水解液為底物生產(chǎn)丁三醇的影響

2%（v/v）的硫酸與玉米芯水解液比例為1:5（w/v）混合后的懸浮水解液，在高壓滅菌鍋121℃滅菌20min。加入堿性試劑Ca(OH)₂中和硫酸，加入的Ca(OH)₂的濃度等于相同硫酸濃度的摩爾數(shù)，再加入NaOH調(diào)節(jié)PH至7.2。最后用濾紙過濾掉玉米芯水解液預(yù)處理方法中的固體物質(zhì)，再分別加入2%（w/v）活性炭至玉米芯水解液中，50℃加熱30分鐘，再用濾紙過濾掉活性炭，得到澄清的玉米芯水解液。得到的玉米芯水解液中木糖的濃度為44g/L，每升玉米芯水解液中加入10g/L Nacl, 5g/L酵母粉和10g/L蛋白胨，滅菌，作為發(fā)酵培養(yǎng)基。以5%接種量接入重組菌種子液，培養(yǎng)溫度25℃,30℃,34℃,37℃,40℃作為對(duì)比，200rmp發(fā)酵72h，得到產(chǎn)物D-1,2,4-丁三醇。

實(shí)施例3 緩沖液對(duì)以玉米芯水解液為底物生產(chǎn)丁三醇的影響

2%（v/v）的硫酸與玉米芯水解液比例為1:5（w/v）混合后的懸浮水解液，在高壓滅菌鍋121℃滅菌20min。加入堿性試劑Ca(OH)₂中和硫酸，加入的Ca(OH)₂的濃度等于相同硫酸濃度的摩爾數(shù)，再加入NaOH調(diào)節(jié)PH至7.2。最后用濾紙過濾掉玉米芯水解液中的固體物質(zhì)，再加入2%（w/v）活性炭至玉米芯水解液中，50℃加熱30分鐘，再用濾紙過濾掉活性炭，得到澄清的玉米芯水解液。測(cè)得澄清玉米芯水解液中木糖的濃度為44g/L，每升玉米芯水解液中加入10g/L Nacl, 5g/L酵母粉和10g/L蛋白胨，滅菌，作為發(fā)酵培養(yǎng)基。以5%接種量接入重組菌種子液，加入10g/L的CaCO₃調(diào)節(jié)PH，37℃200rmp發(fā)酵72h，得到4.52g/L的D-1,2,4-丁三醇。

檢測(cè)結(jié)果

D-1,2,4-丁三醇的高效液相色譜檢測(cè)方法：

D-1,2,4-丁三醇的檢測(cè)條件為：Agilent 1200 高效液相色譜；Biorad HPX-87H 有機(jī)酸分析柱；流動(dòng)相為 0.005 M 硫酸；柱溫為 60℃；流速 0.6 mL/min；示差檢測(cè)器。

將實(shí)施例2和實(shí)施例3的發(fā)酵產(chǎn)物按照上述方法檢測(cè)，結(jié)果分別如圖1和圖2所示，其中，發(fā)酵溫度為37℃時(shí)產(chǎn)量最高，另外，緩沖液的加入提高了D-1,2,4-丁三醇的產(chǎn)量，同等條件下D-1,2,4-丁三醇的量為4.52g/L。