本發(fā)明屬于中藥有效成分的高效制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種丹酚酸A的制備方法。

背景技術(shù)：

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰等功效。用于胸痹心痛，脘腹脅痛，癥瘕積聚，熱痹疼痛，心煩不眠，月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)經(jīng)閉，瘡瘍腫痛等癥。近些年來，研究發(fā)現(xiàn)丹參具有擴張冠脈，抗血小板聚集，改善血液循環(huán)，防止血栓形成及動脈粥樣硬化斑塊形成，促進病理變化恢復(fù)等功效，而被廣泛的應(yīng)用于質(zhì)量心腦血管等缺血性疾病。目前丹參已成為我國用量最大、銷售額最高、制劑生產(chǎn)廠家最多的中藥，臨床使用的丹參制劑主要包括：復(fù)方丹參滴丸、復(fù)方丹參注射液、復(fù)方丹參片、丹參多酚酸鹽注射劑等。丹參中化學(xué)成分主要分為兩大類：水溶性成分，即酚酸類化合物；脂溶性成分，即二萜醌類化合物。60年代末至今，研究人員對丹參水溶性成分進行了深入研究，證明其主要有效成分是酚酸類化合物。最早報道的丹參水溶性成分為原兒茶醛，后來報道丹參素是各種丹酚酸化合物的基本結(jié)構(gòu)。之后分離得到一系列丹酚酸類化合物，如丹酚酸A～K、迷迭香酸、紫草酸等，它們都具有抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基作用，其中丹酚酸A(Salvianolic acid A)活性最強。

現(xiàn)有關(guān)于丹酚酸A的制備方法有直接制備法和間接轉(zhuǎn)化法。直接制備法分為兩種，一種為直接合成法(如專利CN201410216134.7)，采用丹酚酸A合成前體經(jīng)過脫甲基反應(yīng)制備丹酚酸A，再經(jīng)制備型HPLC純化，純度可提高到97％；一種為直接分離法，(如專利CN201010541651.3)，以丹參藥材為原料，經(jīng)提取、粗分、脫色、純化等方法，得到高純度丹酚酸A單體。間接轉(zhuǎn)化法(如專利CN201310487751.6)為將丹參或者丹酚酸B經(jīng)加熱，調(diào)酸堿反應(yīng)若干小時，將丹酚酸B轉(zhuǎn)化為丹酚酸A，再經(jīng)制備分離得到高純度丹酚酸A。直接制備法和間接轉(zhuǎn)化法都存在著制備效率低，轉(zhuǎn)化速度慢等缺點，同時得到富含丹酚酸A的組分需結(jié)合聚酰胺色譜、大孔樹脂、硅膠柱色譜及制備型液相色譜進行分離，費時費力、污染環(huán)境、樣品純度低，而且反復(fù)柱層析對樣品有不可逆性吸附作用，分離得到丹酚酸A單體制備效率低、成本較高，難以發(fā)展成為制備量大的分離技術(shù)。

將水加熱至沸點以上，臨界點以下，并控制系統(tǒng)壓力使水保持為液態(tài)，這種狀態(tài)的水被稱為亞臨界水。通常條件下，水是極性化合物，在505kPa壓力下，隨溫度升高(50～300℃)，其介電常數(shù)由70減小至1，也就是說其性質(zhì)由強極性漸變?yōu)榉菢O性，可將溶質(zhì)按極性由高到低萃取出來。在溫度和壓力都較高的條件下、水的極性降低，可以萃取非極性化合物；溫度和壓力都較低的條件下，水的極性提高，可以萃取極性化合物。由于是不使用酸、堿和催化劑的水在高熱高壓下的處理技術(shù)，因此亞臨界水的提取方法被稱之為“綠色的處理法”。此外，提取可以在數(shù)秒鐘到數(shù)分鐘的短時間內(nèi)完成，具有可以進行連續(xù)處理的優(yōu)點。同時亞臨界水具有“強烈的溶解有機物在水中”和“強烈的分解力”等同普通水不同的性質(zhì)。利用這一性質(zhì)，亞臨界水被利用來提取有用成分(包括提取隨著分解反應(yīng)產(chǎn)生的分解物)。亞臨界水解技術(shù)是近年來天然產(chǎn)物提取和轉(zhuǎn)化研究領(lǐng)域的熱點。其用于天然產(chǎn)物提取轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)速率快、無溶劑污染、前期和后處理步驟簡單、收率高、能耗低等獨特的優(yōu)點。

高速逆流色譜(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是近30年發(fā)展起來的一種連續(xù)的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術(shù)，它避免了固態(tài)支持體或載體帶來的樣品易被死吸附、損耗和變性等各種問題。pH-區(qū)帶精制逆流色譜(pH-Zone-Refining Countercurrent Chromatography)則是在普通的高速逆流色譜儀器的基礎(chǔ)上，通過對分離樣品所用的溶劑系統(tǒng)的組成的調(diào)配，采用化學(xué)的手段，使樣品組分的色譜分離過程增添了按pH區(qū)帶聚集的特征，同時，使組分的洗脫過程表現(xiàn)為類似置換(頂替)色譜(Displacement Chromatography)的洗脫過程，因此，它的色譜圖不再是高斯分布的色譜峰形系列，而成為按pH值的大小排列的邊界陡削的矩形區(qū)帶系列，其結(jié)果是能把相同容積的逆流色譜儀器的分離制備量提高數(shù)倍乃至十倍。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種丹酚酸A的制備方法。

一種丹酚酸A的制備方法，步驟如下：

(1)將丹酚酸B用pH為3.5-4.5(優(yōu)選4.0)的NaOH或NaHCO₃(NaHCO₃優(yōu)點：堿性較弱，反應(yīng)較溫和)水配制成35-45mg/mL(優(yōu)選：40mg/mL)的溶液，置于亞臨界水不銹鋼反應(yīng)釜中，加熱爐達到170℃-190℃(優(yōu)選：180℃)并穩(wěn)定后，將反應(yīng)釜放入加熱爐，50min-70min(優(yōu)選60min)后迅速取出反應(yīng)釜并放入冰水浴或冷水沖(優(yōu)點：快速降溫，防止在冷卻的過程中繼續(xù)反應(yīng))中冷卻，將液體取出，冷凍干燥，得富含丹酚酸A粗品；

(2)應(yīng)用高速逆流色譜分離純化丹酚酸A：溶劑系統(tǒng)為石油醚：乙酸乙酯：正丁醇：水＝2:3:1:9，上相加10mM三氟乙酸為固定相，下相為10mM氨水為流動相，高速逆流色譜儀柱體積為200-400(優(yōu)選300)mL，上樣量1.0-1.2g(優(yōu)選1.2g)，轉(zhuǎn)速600-1000rpm(優(yōu)選：800rpm)，上相為固定相，下相為流動相，流速1-4mL/min(優(yōu)選：2.0mL/min)，固定相保留率57％，檢測波長280nm。

一種具有擴張冠脈、抗血小板聚集、改善血液循環(huán)、防止血栓形成、動脈粥樣硬化斑塊形成、促進病理變化恢復(fù)的藥物的制備方法，具有上述丹酚酸A制備方法的步驟。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明的制備方法利用超臨界水轉(zhuǎn)化將丹酚酸B轉(zhuǎn)化為丹酚酸A粗品，最后經(jīng)過高速逆流色譜分離純化丹酚酸A，成本低于現(xiàn)有技術(shù)，操作簡便，效率高，可以較大批量將丹酚酸粗提物進行轉(zhuǎn)化，分離制備出純度大于98％的丹酚酸A單體化合物。

2、目前有使用亞臨界水提取中藥丹參中脂溶性成分等的方法，但是這些方法都是利用了亞臨界水在溫度和壓力都較高的條件下、水的極性降低，萃取非極性化合物的作用，而本發(fā)明充分利用亞臨界水對丹參中水溶性成分溶解度高，不僅可用于相關(guān)成分的提取，同時還可利用高溫高壓的特點，將丹酚酸B轉(zhuǎn)化為生物活性更高的丹酚酸A。

3、將丹酚酸B用pH為4.0的NaHCO₃水配制成40mg/mL的溶液目的：經(jīng)實驗證明，在丹酚酸B中添加酸或堿，均可加速丹酚酸B的轉(zhuǎn)化速率，但是只有在pH為4.0左右的時候，最有利于丹酚酸B向丹酚酸A的方向轉(zhuǎn)化，使丹酚酸A的產(chǎn)量最高。優(yōu)點：既可以提高丹酚酸A的產(chǎn)量，又可加快丹酚酸B的轉(zhuǎn)化速率。

4、加熱爐達到180℃并穩(wěn)定后，將反應(yīng)釜放入加熱爐，60min后的目的：加熱爐反應(yīng)前達到穩(wěn)定狀態(tài)，有利于對整個反應(yīng)在時間和溫度上進行把控，使反應(yīng)的重現(xiàn)性得到提高。優(yōu)點：節(jié)能高效、轉(zhuǎn)化完全。

附圖說明

圖1為實施例1的工藝流程圖；

圖2為實施例1富含丹酚酸A粗品分離的區(qū)帶逆流色譜圖，a：丹參素；b：丹酚酸D；c：丹酚酸A；d：原兒茶醛；

圖3為實施例1丹酚酸B樣品的高效液相色譜圖；

圖4為實施例1富含丹酚酸A粗品的高效液相色譜圖；

圖5為實施例1丹參素單體的高效液相色譜圖；

圖6為實施例1丹酚酸D單體的高效液相色譜圖；

圖7為實施例1丹酚酸A單體的高效液相色譜圖；

圖8為實施例1原兒茶醛單體的高效液相色譜圖；

圖9為對比例1的的區(qū)帶逆流色譜圖；

圖10為對比例2的的區(qū)帶逆流色譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖與實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

如圖1丹酚酸A單體制備流程圖所示。

將丹酚酸B(圖3)用pH為4.0的NaHCO₃水配制成40mg/mL的丹酚酸B溶液，取40mL上述溶液置于50mL亞臨界水不銹鋼反應(yīng)釜中，加熱爐達到180℃并穩(wěn)定后，將反應(yīng)釜放入加熱爐，開始計時。60min后迅速取出反應(yīng)器并放入冰水浴中冷卻，將液體取出，冷凍干燥，得富含丹酚酸A粗品(圖4)。

2.應(yīng)用高速逆流色譜分離純化丹酚酸A

溶劑系統(tǒng)為石油醚：乙酸乙酯：正丁醇：水＝2:3:1:9，上相加10Mm三氟乙酸為固定相，下相為10mM氨水為流動相，高速逆流色譜儀柱體積為300mL，上樣量1.2g，轉(zhuǎn)速800rpm，上相為固定相，下相為流動相，流速2.0mL/min，固定相保留率57％，檢測波長280nm。

具體的操作步驟是：按上述溶劑比例配制溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時間后將上下兩相分開，上相加10mM三氟乙酸為固定相，下相為10Mm氨水為流動相，取1.2g富含丹酚酸A粗品，溶解于5mL加10mM三氟乙酸的上相和5mL不加氨水的下相中待用。采用上海同田公司研制的半制備型高速逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進樣閥、紫外檢測儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為300mL)等組成，首先使進樣閥處于進樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離柱，停泵。開啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達800rpm時，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進入色譜分離柱。設(shè)置流動相流速為2.0mL/min，開始泵流動相，然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖(圖2)接收目標(biāo)成分，得丹參素(38.9mg，圖5)，丹酚酸D(9.5mg，圖6)，丹酚酸A(227.3mg，圖7)和原兒茶醛(32.8mg，圖8)，HPLC分析純度均為98％以上。

利用高效液相色譜分析分離物，液相條件：Kromasil 100-5C₁₈柱(4.6×250mm)，紫外檢測波長286nm，柱溫：25℃，流速：1.0mL/min，進樣量：10μL，流動相采用乙腈(A)和0.2％甲酸水溶液(B)梯度洗脫，梯度條件如下：0-9min，10％-22％A；9-19min，22％-24％A；19-35min，24％A；35-43min，24％-36％A；43-48min，36％-100％A；48-50min，100％A。

結(jié)構(gòu)鑒定：對分離得到的生物堿應(yīng)用Agilent 5973N質(zhì)譜儀和Varian 600MHz核磁共振波譜儀分別進行MS，¹HNMR譜的測定，所得數(shù)據(jù)如下：

丹參素：ESI-MS,m/z,197[M-H]^-,395[2M-H]^-,135[M-H-H₂O-CO₂]^-.¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ:2.51(1H,dd,J＝5.6,9.2Hz,H-7),2.85(1H,dd,J＝2.4,9.2Hz,H-7),3.90(1H,dd,J＝2.5,5.6Hz,H-8),6.45(1H,dd,J＝1.3,5.3Hz,H-6),6.61(1H,d,J＝5.3Hz,H-5),6.65(1H,s,H-2).¹³C-NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ:49.1(C-7),72.6(C-8),115.7(C-5),117.5(C-2),120.5(C-6),130.5(C-1),143.9(C-3),145.2(C-4),177.1(C-9).

丹酚酸D：ESI-MS,m/z,417[M-H]^-,373[M-H-CO₂]^-,197[C₉H₁₀O₅-H]^-,175[M-H-CO₂-C₉H₁₀O₅]^-.¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ:2.96(2H,m,H-7″),4.85(1H,dd,J＝8.1,8.5Hz,H-8″),3.58(2H,s,Ar-CH₂),6.24(1H,d,J＝16.0Hz,H-8),7.86(1H,d,J＝16.0,H-7),6.47-7.07(5H,Ar-H).¹³C-NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ:37.5(C-2′),49.1(C-7″),75.0(C-8″),114.1(C-5),115.8(C-3″),116.1(C-5″),117.4(C-8),118.6(C-6),119.9(C-2),124.44(C-6″),125.8(C-1),128.9(C-1″),143.3(C-4″),144.0(C-7),144.4(C-4),145,7(C-3″),149.1(C-3),166.3(C-9),172.0(C-9″),175.5(C-1′).

丹酚酸A：ESI-MS,m/z,494[M-H]^-,295[M-H-C₉H₁₀O₅]^-.¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ:2.75(1H,dd,J＝14.3,8.5Hz,H-7′),2.98(1H,dd,J＝14.4/4.5Hz,H-7′),4.90(1H,dd,J＝8.5,6.0Hz,H-8′),6.26(1H,d,J＝16.0Hz,H-8),6.45(1H,dd,J＝8.3,2.0Hz,H-6″),6.54(1H,d,J＝8.5Hz,H-5′),6.53(1H,d,J＝16.0Hz,H-7″),6.63(1H,d,J＝2.0Hz,H-2′),6.72(1H,d,J＝8.7Hz,H-5),7.12(1H,d,J＝8.6Hz,H-6),6.77(1H,d,J＝8.0Hz,H-5″),6.86(1H,dd,J＝8.3,2.0Hz,H-6″),7.04(1H,d,J＝2.0Hz,H-2″),7.13(1H,d,J＝16.0Hz,H-8″).¹³C-NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ:36.8(C-7′),75.0(C-8′),112.8(C-2″),114.3(C-5),115.3(C-8),115.7(C-5′),116.4(C-5″),118.6(C-2′),119.0(C-8″),119.1(C-6),119.8(C-6″),123.7(C-6′),126.5(C-1),129.0(C-2),134.2(C-1′),135.3(C-3),143.6(C-7″),144.8(C-1″),145.6(C-4′),145.6(C-3′),145.6(C-3″),145.7(C-4″),147.1(C-7),148.4(C-4),166.2(C-9),171.8(C-9′)..

原兒茶醛：ESI-MS,m/z,137[M-H]^-,109[M-H-CO]^-.¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ:9.69(1H,s,H-7),7.27(1H,dd,J＝1.3/5.4Hz,H-6),7.23(1H,d,J＝1.2Hz,H-2),6.89(1H,d,J＝5.4Hz,H-5).¹³C-NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ:114.7(C-5),115.9(C-2),125.1(C-6),129.1(C-1),146.4(C-3),153.0(C-4),191.3(-CHO).

實施例2

將丹酚酸B用pH為3.5的NaHCO₃水配制成45mg/mL的丹酚酸B溶液，取40mL上述溶液置于50mL亞臨界水不銹鋼反應(yīng)釜中，加熱爐達到182℃并穩(wěn)定后，將反應(yīng)釜放入加熱爐，開始計時。55min后迅速取出反應(yīng)器并放入冰水浴中冷卻，將液體取出，冷凍干燥，得富含丹酚酸A粗品。

應(yīng)用高速逆流色譜分離純化丹酚酸A

溶劑系統(tǒng)為石油醚：乙酸乙酯：正丁醇：水＝2:3:1:9，上相加10mM三氟乙酸為固定相，下相為10mM氨水為流動相，高速逆流色譜儀柱體積為300mL，上樣量1.0g，轉(zhuǎn)速750rpm，上相為固定相，下相為流動相，流速2.0mL/min，固定相保留率55％，檢測波長280nm。

具體的操作步驟是：按上述溶劑比例配制溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時間后將上下兩相分開，上相加10mM三氟乙酸為固定相，下相為10mM氨水為流動相，取1.2g富含丹酚酸A粗品，溶解于5mL加10Mm三氟乙酸的上相和5mL不加氨水的下相中待用。采用上海同田公司研制的半制備型高速逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進樣閥、紫外檢測儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為300mL)等組成，首先使進樣閥處于進樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離柱，停泵。開啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達800rpm時，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進入色譜分離柱。設(shè)置流動相流速為2.0mL/min，開始泵流動相，然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖接收目標(biāo)成分，得丹參素(36.7mg)，丹酚酸D(9.2mg)，丹酚酸A(219.6mg)和原兒茶醛(32.1mg)，HPLC分析純度均為98％以上。

對比例1：

條件：石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:3:3:9)，上相10mM三氟乙酸，下相10mM氨水，流速：2mL min^-1，進樣量：1000mg，固定相保留：52％，轉(zhuǎn)速：800rpm，其他條件與操作都與實施例1中的一樣。分離結(jié)果：出峰時間太快，化合物未得到分離，如附圖9。

對比例2：

條件：石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:3:1:9)，上相10mM三氟乙酸，下相10mM氨水，流速：2mL min^-1，進樣量：900mg，固定相保留：56％，轉(zhuǎn)速：800rpm，其他條件與操作都與實施例1中的一樣。分離結(jié)果：分離條件有所改善，丹酚酸A得到部分純品，但是大部分與其它化合物混合在一起，仍未得到有效分離，如附圖10。

由圖9和圖10可以看出，對比例1與實施例1是在溶劑系統(tǒng)中將正丁醇換成了甲醇，并且將溶劑系統(tǒng)的比例發(fā)生了改變，就導(dǎo)致出峰時間太快，化合物未得到分離，對比例2僅僅是在溶劑系統(tǒng)中將正丁醇換成了甲醇，溶劑系統(tǒng)的比例都沒有改變，同樣導(dǎo)致了未得到有效分離。

上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。