本申請(qǐng)要求2008年11月11日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)61/113,545和2009年6月19日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)61/218,802的優(yōu)先權(quán)，所述臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖艘胱鳛閰⒖?。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供改造的蛋白酶變體。具體而言，該蛋白酶變體包含在選定的表面位置處的可組合突變，所述突變影響酶的電荷和/或疏水性以增強(qiáng)得到的變體酶在選擇性應(yīng)用中的至少一種需要的特性。也提供了包含蛋白酶變體的組合物，以及使用該組合物的方法。發(fā)明背景絲氨酸蛋白酶是羰基水解酶的亞類(lèi)，所述羰基水解酶包含多種具有廣泛的特異性和生物學(xué)功能的酶類(lèi)。在枯草桿菌蛋白酶上已經(jīng)進(jìn)行了許多研究，主要是由于它們?cè)谇鍧嵑臀癸晳?yīng)用中的有用性。其他研究集中于可能減少這些酶在多種應(yīng)用中的功能性的不利環(huán)境條件上(例如，暴露于氧化劑、螫合劑、極端的溫度和/或pH)。然而，本領(lǐng)域仍需要能抵抗這些不利條件并保留本領(lǐng)域目前已知的那些酶系統(tǒng)的活性或者具有改善的活性的酶系統(tǒng)的需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供改造的蛋白酶變體。具體而言，該蛋白酶變體包含在選定的表面位置處的可組合突變，所述突變影響酶的電荷和/或疏水性以增強(qiáng)得到的變體酶在選擇性應(yīng)用中的至少一種需要的特性。也提供了包含蛋白酶變體的組合物，以及使用該組合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬(Bacillus)枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個(gè)或多個(gè)位置的替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個(gè)或多個(gè)位置的替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其具有大于或等于0.5的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平性能指數(shù)(TCAPI)和/或去污活性性能指數(shù)(BMIPI)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其具有大于或等于0.5的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平性能指數(shù)(TCAPI)和/或去污活性性能指數(shù)(BMIPI)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其具有大于或等于0.5的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平性能指數(shù)(TCAPI)和/或去污活性性能指數(shù)(BMIPI)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S101Q-G118Q-T213Q，G118Q-T213Q，S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101Q-GI18Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L，S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q，和S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E的組合替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含替換T213Q，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并(包含)選自S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，N109Q-N118Q-K213Q，N118Q-K213Q，S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L，S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q和S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E的組合替換，其中所述位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：1的BPN’枯草桿菌蛋白酶的位置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含替代K213Q，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼上述任意一種蛋白酶變體的分離的核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼上述任意一種蛋白酶變體的分離的核酸的表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其相應(yīng)地包含了編碼上述任意一種蛋白酶變體的分離的核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一種蛋白酶變體的清潔組合物，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個(gè)或多個(gè)位置的替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑(drylaundry)。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個(gè)或多個(gè)位置的替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào),并且其具有大于或等于0.5的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平性能指數(shù)(TCAPI)和/或去污活性性能指數(shù)(BMIPI)。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其具有大于或等于0.5的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平性能指數(shù)(TCAPI)和/或去污活性性能指數(shù)(BMIPI)。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其具有大于或等于0.5的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平性能指數(shù)(TCAPI)和/或去污活性性能指數(shù)(BMIPI)。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S101Q-G118Q-T213Q，G118Q-T213Q，S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L，S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q和S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E的組合替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含替換T213Q，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一種蛋白酶變體的清潔組合物，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q-A45QS101Q-N109Q-N118Q-K213Q，A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，N109Q-N118Q-K213Q，N118Q-K213Q，S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L，S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q，和S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E的組合替換，其中所述位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：1的BPN’枯草桿菌蛋白酶的位置。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。又在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含替換K213Q，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個(gè)或多個(gè)位置的替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、纖維素酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過(guò)水解酶(perhydrolases)、角質(zhì)酶(cutinase)、果膠酶、果膠酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質(zhì)素酶(ligninase)、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶或它們的混合物。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個(gè)或多個(gè)位置的替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其具有大于或等于0.5的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平性能指數(shù)(TCAPI)和/或去污活性性能指數(shù)(BMIPI)，并且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過(guò)水解酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶或它們的混合物。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過(guò)水解酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶或它們的混合物。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其具有大于或等于0.5的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平性能指數(shù)(TCAPI)和/或去污活性性能指數(shù)(BMIPI)，并且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過(guò)水解酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶或它們的混合物。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其具有大于或等于0.5的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平性能指數(shù)(TCAPI)和/或去污活性性能指數(shù)(BMIPI)，并且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過(guò)水解酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶或它們的混合物。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S101Q-G118Q-T213Q，G118Q-T213Q，S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L，S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q和S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E的組合替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過(guò)水解酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶或它們的混合物。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含替換T213Q，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過(guò)水解酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶或它們的混合物。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另外的實(shí)施方案中，清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，N109Q-N118Q-K213Q，N118Q-K213Q，S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L，S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q，和S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E，的組合替換，其中所述位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：1的BPN’枯草桿菌蛋白酶的位置，并且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過(guò)水解酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶或它們的混合物。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含替換K213Q，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其還包含一種或多種其他的酶或酶衍生物。其他酶或酶衍生物選自半纖維素酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、過(guò)水解酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶或它們的混合物。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物是洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，該洗滌劑是餐具洗滌劑。在其他實(shí)施方案中，該洗滌劑是衣物洗滌劑例如強(qiáng)效液體洗滌劑或干洗洗滌劑。在備選的實(shí)施方案中，該清潔組合物還包含至少一種穩(wěn)定劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個(gè)或多個(gè)位置的替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自24、45、101、109、118、213和217位置的兩個(gè)或多個(gè)位置的替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其具有大于或等于0.5的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平性能指數(shù)(TCAPI)和/或去污活性性能指數(shù)(BMIPI)。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、R45Q、R45E、R45L、S101Q、S101E、S101L、S101R、Q109E、Q109L、Q109R、G118Q、G118E、G118L、G118R、T213Q、T213L、T213R、T213E、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其具有大于或等于0.5的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平性能指數(shù)(TCAPI)和/或去污活性性能指數(shù)(BMIPI)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體的清潔組合物，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO:1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q、S24E、S24L、S24R、A45Q、A45E、A45L、A45R、S101Q、S101E、S101L、S101R、N109Q、N109E、N109L、N109R、K213Q、K213E、K213L、K213R、L217Q和L217E的兩個(gè)或多個(gè)位置的兩個(gè)或多個(gè)替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)，并且其具有大于或等于0.5的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平性能指數(shù)(TCAPI)和/或去污活性性能指數(shù)(BMIPI)。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種蛋白酶變體，所述蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式并包含選自S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S101Q-G118Q-T213Q，G118Q-T213Q，S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q，S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L，S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101Q-G118Q-T213Q，S24R-S101R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q，S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R，S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E，S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q，和S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E的組合替換，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶GG36的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含替換T213Q，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含選自S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，N109Q-N118Q-K213Q，N118Q-K213Q，S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q，S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L，S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q，S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R，S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E，S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q，和S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E的組合替換，其中所述位置對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：1的BPN’枯草桿菌蛋白酶的位置。在另外的實(shí)施方案中，該清潔組合物包含至少0.0001重量百分比的至少一種枯草桿菌蛋白酶變體，所述枯草桿菌蛋白酶變體是具有蛋白水解活性的芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶FNA的分離的枯草桿菌蛋白酶變體的成熟形式，并包含替換K213Q，其中所述位置通過(guò)對(duì)應(yīng)于如SEQIDNO：1所述的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列而進(jìn)行編號(hào)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了清潔的方法，包括將表面和/或包含織物的物品與所述的任意一種清潔組合物接觸，并任選地洗滌和/或漂洗所述表面或物品。附圖簡(jiǎn)述圖1提供了親本蛋白酶GG36(SEQID：4)和FNA(SEQIDNO：7)與BPN’(SEQIDNO：1)成熟形式的比對(duì)。除非另外說(shuō)明，替換位置以相對(duì)于BPN’位置的方式給出。圖2提供了表示氨基酸殘基替換在pH8.6的電荷改變之電荷改變真值表?？梢匀菀椎貜脑撜嬷当碇写_定與親本酶相比，變體酶的凈電荷改變。圖3提供了表示氨基酸殘基替換的親水性改變的Kyte-Doolittle親水性改變真值表?？梢匀菀椎貜脑撜嬷当碇写_定與親本酶相比，變體酶的凈親水性改變。圖4提供了pAC-GG36ci的圖譜。圖5提供了pAC-FNAre的圖譜。發(fā)明詳述本發(fā)明提供改造的蛋白酶變體。具體而言，該蛋白酶變體包含在選定的表面位置處的可組合突變，所述突變影響酶的電荷和/或疏水性以增強(qiáng)得到的變體酶在選擇性應(yīng)用中的至少一種需要的特性。也提供了包含蛋白酶變體的組合物，以及使用該組合物的方法。如本文中所指，引入的替換影響了枯草桿菌蛋白酶的電荷和/或疏水性，得到了包含至少一種可組合突變的酶，以提供當(dāng)與親本酶比較時(shí)，具有至少一種目的特性的性能指數(shù)>0.5的性能指數(shù)的變體蛋白酶。可組合突變可以用于在多種應(yīng)用中增強(qiáng)至少一種需要的酶特性的性能指數(shù)。目的特性包括但不限于電荷、疏水性、可溶性、清潔性能例如從織物和/或硬表面去污、熱穩(wěn)定性、儲(chǔ)藏穩(wěn)定性、去垢劑穩(wěn)定性、底物結(jié)合、酶抑制、表達(dá)水平、反應(yīng)速率和底物降解。在一些實(shí)施方案中，目的特性是選自電荷、疏水性、表達(dá)水平(TCAPI)和清潔性能例如去污性能(BMIPI)的一種或多種特性。盡管在本文中以蛋白酶和血漬、乳漬和墨漬(BMI)的關(guān)系的方式進(jìn)行描述，但是應(yīng)當(dāng)考慮，本發(fā)明的蛋白酶變體對(duì)于在由應(yīng)用例如清潔應(yīng)用指定的任意多種反應(yīng)介質(zhì)中的任一酶-底物相互作用是最優(yōu)的。在此之前，研發(fā)優(yōu)良的蛋白質(zhì)的嘗試集中于最小化酶與表面的結(jié)合。例如，一些方法涉及改變枯草桿菌蛋白酶序列以獲得具有降低對(duì)不可溶性底物吸附的變體酶(參見(jiàn)如，WO95/07991)。在另外的方法中，改變了枯草桿菌蛋白酶的pI以獲得在定義的pH具有凈電荷為零的變體酶(參見(jiàn)如，WO91/00345)。然而，正如在本發(fā)明的研發(fā)期間所測(cè)定，這些方法并非總是成功的。在本發(fā)明的研發(fā)期間，測(cè)定出酶的表面特性一般具有由以表面電荷和/或疏水性的方式改變的函數(shù)確定的最佳值。甚至對(duì)于通常非?；钴S的酶，在一些條件下和與一些底物反應(yīng)時(shí)，表面特性也可以造成整個(gè)反應(yīng)比在其他條件下和/或與其他底物反應(yīng)時(shí)更慢。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含修飾了表面特性的變體蛋白酶，其通過(guò)改變酶表面上一個(gè)或多個(gè)氨基酸的性質(zhì)獲得。當(dāng)在表面上并不與任一其他氨基酸相互作用且對(duì)于酶功能并非必需的位置處產(chǎn)生這些改變時(shí)，基于如本文中所述那些位置處替換的氨基酸的特性，可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的特性。從結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)可以容易地鑒定位置；備選地，可使用同源序列比對(duì)、位點(diǎn)評(píng)價(jià)文庫(kù)數(shù)據(jù)和/或它們的任一組合?？梢詫被岬梅终嬷当?aminoacidscoringmatrices)(例如圖1)和/或疏水性尺度(scales)(例如圖2)用于指導(dǎo)氨基酸替換并用于鑒定與替換的氨基酸的特性相關(guān)的蛋白質(zhì)的那些物理特性。定義除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)施包括屬于本領(lǐng)域技術(shù)的普遍用于分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并記載于許多本領(lǐng)域熟知的文章和參考著作中。此處提及的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、文章和出版物，包括上文中和下文中的，都明確引入本申請(qǐng)作為參考。除非另外定義，此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所一般理解的含義相同的含義。雖然與此處描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本發(fā)明的實(shí)施或檢測(cè)，還是在本文中描述了一些優(yōu)選的方法和材料。因此，通過(guò)整體參考說(shuō)明書(shū)而更加完全地描述下面定義的術(shù)語(yǔ)。同時(shí)，如本文中所用，單數(shù)“一個(gè)”、“一”和“所述”包括其復(fù)數(shù)指代，除非另外清楚指明。數(shù)值范圍包括限定范圍的端點(diǎn)數(shù)值。除非另外說(shuō)明，核酸以5'至3'的方向從左向右書(shū)寫(xiě)，而氨基酸序列以氨基端到羧基端的方向從左向右書(shū)寫(xiě)。應(yīng)理解本發(fā)明不限于所描述的特定方法學(xué)、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)使用它們的背景而對(duì)其進(jìn)行改變。預(yù)期通篇說(shuō)明書(shū)中給定的每個(gè)上限值意欲包括每個(gè)較小的數(shù)值限制，相當(dāng)于這樣的較小數(shù)值限制明確記載于本文中。通篇說(shuō)明書(shū)中給定的每個(gè)下限值意欲包括每個(gè)較大的數(shù)值限制，相當(dāng)于這樣的更大數(shù)值限制明確記載于本文中。整個(gè)說(shuō)明書(shū)中每個(gè)數(shù)值范圍包括落入該較寬數(shù)值范圍的每個(gè)較窄數(shù)值范圍，相當(dāng)于這樣的較窄數(shù)值范圍全部明確記載于本文中。此外，此處提供的標(biāo)題不是本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方式或方面的限制，該各個(gè)實(shí)施方式或方面可以通過(guò)整體參考說(shuō)明書(shū)而獲得。因此，如上所述，通過(guò)整體引用說(shuō)明書(shū)而更加完全地描述下面定義的術(shù)語(yǔ)。盡管如此，為了方便本發(fā)明的理解，將許多術(shù)語(yǔ)定義如下。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“性能指數(shù)(PI)”指在給定的測(cè)定中，變體酶的性能相對(duì)于親本酶或參考酶的性能的比率。清潔性能的PI在本文中提供為去除血漬、乳漬和墨漬(BMI)的性能，并提供為BMIPI值。用于表達(dá)水平性能的PI在本文中提供為由通過(guò)三氯乙酸(TCA)沉淀法測(cè)量的產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的水平，并提供為T(mén)CAPI值。如本文中所用，“可組合的突變”是對(duì)于包含具有至少一種特性的性能指數(shù)(PI)值>0.5的突變的變體而言的那些突變?？山M合的突變是可以聯(lián)合的突變，以賦予蛋白質(zhì)一種或多種需要特性的合適性能指標(biāo)(PerformanceIndice)，并給予電荷和/或疏水性的改變。發(fā)生突變的位置如下分類(lèi)：對(duì)于至少一種特性，非限制性位置具有＝20％的中性突變；和對(duì)于活性和穩(wěn)定性，限制性位置具有<20％的中性突變。術(shù)語(yǔ)“分離的”和“純化的”指從其來(lái)源環(huán)境(例如，天然環(huán)境，如果其是天然發(fā)生的)中分離的物質(zhì)。例如，當(dāng)其在特定的組合物中以比天然發(fā)生的或野生型生物中存在的濃度更高或更低的濃度存在時(shí)或者以與并非通常存在于天然存在的或野生型生物中表達(dá)的組分組合的方式存在時(shí)，稱(chēng)該物質(zhì)為“純化的”。例如，存在于活的動(dòng)物中的天然發(fā)生的多核苷酸或者多肽不是分離的，但是分離自天然系統(tǒng)中的一些或者所有共存物質(zhì)的相同的核苷酸或多肽是分離的。在一些實(shí)施方案中，此類(lèi)多核苷酸是載體的一部分，和/或此類(lèi)多核苷酸或多肽是組合物的一部分，并且仍然是分離的，因?yàn)榇祟?lèi)載體或組合物并不是其天然環(huán)境的一部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，稱(chēng)核苷酸或蛋白質(zhì)為純化的，例如，如果其在電泳凝膠或印跡中產(chǎn)生基本上一條帶時(shí)。術(shù)語(yǔ)“分離的”，當(dāng)用于指DNA序列時(shí)，指已經(jīng)從其天然遺傳環(huán)境中分離的DNA序列，并因此沒(méi)有其他無(wú)關(guān)的或不需要的編碼序列，并且為適合于在遺傳改造的蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)中使用的形式。此類(lèi)分離的分子是那些分離自它們的天然環(huán)境的分子并包括cDNA和基因克隆。本發(fā)明的分離的DNA分子沒(méi)有與它們通常相關(guān)的其他基因，但是可以包括天然存在的5'和3'非翻譯區(qū)例如啟動(dòng)子和終止子。相關(guān)區(qū)域的鑒定對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的(參見(jiàn)例如，Dynan和Tijan，Nature316：774-78[1985])。術(shù)語(yǔ)“分離的DNA序列”備選地稱(chēng)為“克隆的DNA序列”。術(shù)語(yǔ)“分離的”，當(dāng)用于指蛋白質(zhì)時(shí)，指在除其天然環(huán)境外的條件中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的形式中，分離的蛋白質(zhì)基本上沒(méi)有其他蛋白質(zhì)，特別是其他同源的蛋白質(zhì)。分離的蛋白質(zhì)具有由SDS-PAGE測(cè)定的大于約10％的純度，優(yōu)選地大于約20％，和甚至更優(yōu)選地大于約30％的純度。本發(fā)明另外的方面包括由SDS-PAGE測(cè)定的高純化形式(即，大于約40％的純度，大于約60％的純度，大于約70％的純度，大于約80％的純度，大于約90％的純度，大于約95％的純度，大于約97％的純度和甚至大于約99％的純度)的蛋白質(zhì)。如本文中所用，“親本”蛋白質(zhì)指例如通過(guò)引入一種或多種氨基酸替換修飾，以產(chǎn)生親本蛋白質(zhì)的一種或多種變體的蛋白質(zhì)。因此，術(shù)語(yǔ)“蛋白酶變體”和“變體蛋白酶”用于指與變體蛋白酶類(lèi)似，特別是與它們的功能類(lèi)似的親本蛋白酶的變體，但是在它們的氨基酸序列中的突變使得它們從1個(gè)至20個(gè)氨基酸位置與親本蛋白酶的序列不同。示例性親本蛋白酶的成熟區(qū)域的氨基酸序列顯示于圖1的比對(duì)結(jié)果中。FNA(SEQIDNO:7)和GG36(SEQIDNO:4)是已得到修飾并含有一個(gè)或多個(gè)可組合的替換的成熟親本蛋白酶，所述可組合的替換產(chǎn)生本發(fā)明的變體蛋白酶。GG36是野生型遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)的蛋白酶，而FNA是含有Y217L替換的解淀粉芽孢桿菌的BPN’蛋白酶。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“蛋白酶”和“蛋白水解活性”指顯示出水解肽或具有肽鍵的底物的能力的蛋白質(zhì)或肽。存在許多熟知的方法來(lái)測(cè)量蛋白水解活性((Kalisz,“MicrobialProteinases”出自Fiechter(編著),AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,[1988])。例如，蛋白水解活性可以通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，該實(shí)驗(yàn)分析了各種蛋白酶水解商業(yè)底物的能力。用于這種蛋白酶或蛋白水解活性分析的示例性底物包括但不限于，二甲基酪蛋白(SigmaC-9801)，牛膠原(SigmaC-9879)，牛彈性蛋白(SigmaE-1625)和牛角蛋白(ICNBiomedical902111)。使用這些底物的比色法為本領(lǐng)域所熟知，參見(jiàn)，例如WO99/34011和美國(guó)專(zhuān)利6,376,450，所述兩專(zhuān)利在本文中引入作為參考。pNA測(cè)定(參見(jiàn)，例如DelMar等人,Anal.Biochem.,99:316-320[1979])也可以用于測(cè)定在梯度洗脫期間收集的組分的活性酶濃度。該測(cè)定測(cè)量當(dāng)酶水解可溶性合成底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對(duì)-硝基苯胺(sucAAPF-pNA)時(shí)的對(duì)硝基苯胺釋放率。用分光光度計(jì)在410nm處測(cè)量從水解反應(yīng)中產(chǎn)生的黃色的速率，其與活性酶濃度成比例。此外，在280nm的吸光度測(cè)量可以用于測(cè)定總蛋白質(zhì)的濃度?；钚悦?總蛋白質(zhì)比率給出了酶純度。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“枯草桿菌蛋白酶”指如在MEROPS-ThePeptidaseDatabase中所述的S8絲氨酸蛋白酶家族的任一成員(Rawlings等人，MEROPS：thepeptidasedatabase，NucleicAcidsRes，第34數(shù)據(jù)庫(kù)專(zhuān)輯，D270-272，2006，在merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/merops.cgi？id＝s08；action＝：網(wǎng)站)。以下信息來(lái)源于到2008年11月6日為止的MEROPS-ThePeptidase數(shù)據(jù)庫(kù)，“肽酶家族S8含有絲氨酸內(nèi)肽酶枯草桿菌蛋白酶及其同源物(PeptidasefamilyS8containstheserineendopeptidasesubtilisinanditshomologues)”(BiochemJ，290：205-218，1993)。S8家族，也已知為枯草桿菌酶，是絲氨酸肽酶的第二大家族，并可以分為兩個(gè)亞族，S8A亞族的示例類(lèi)型為枯草桿菌蛋白酶(S08.001)和S8B亞族的示例類(lèi)型為枯草溶菌酶(kexin)(S08.070)。以前認(rèn)為三肽基-肽酶II(TPP-II；S08.090)是第三亞族的示例類(lèi)型，但是已經(jīng)確定為錯(cuò)誤分類(lèi)。S8家族的成員具有Asp、His和Ser序列順序的催化三分子，其與S1、S9和S10家族的序列順序不同。在S8A亞族中，活性部位殘基一般存在于Asp-Thr/Ser-Gly(其與在AA系中的天冬氨酸內(nèi)肽酶家族中的序列基序類(lèi)似)、His-Gly-Thr-His和Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro基序中。在S8B亞族中，催化殘基一般存在于Asp-Asp-Gly、His-Gly-Thr-Arg和Gly-Thr-Ser-Ala/Val-Ala/Ser-Pro基序中。大多數(shù)S8家族的成員是內(nèi)肽酶，并且在中性-微堿性pH時(shí)具有活性。該家族中的許多肽酶是熱穩(wěn)定的。通常將酪蛋白用作為蛋白質(zhì)底物，并且一般的合成底物是suc-AAPF。該家族的大多數(shù)成員是非特異性肽酶，具有優(yōu)先在疏水殘基后的剪切。然而，S8B的成員，例如枯草溶菌酶(S08.070)和弗林蛋白酶(S08.071)，在氨基二羧酸后剪切。一般絲氨酸肽酶抑制物例如DFP和PMSF可以抑制S8家族的大多數(shù)成員。因?yàn)榧易宓脑S多成員都與鈣結(jié)合以穩(wěn)定，用EDTA和EGTA可以觀察到抑制，所以通常認(rèn)為其是金屬蛋白酶的特異抑制物。蛋白質(zhì)抑制物包括火雞卵類(lèi)粘蛋白第三結(jié)構(gòu)域(I01.003)、鏈霉菌屬(Streptomyces)(I16.003)枯草桿菌蛋白酶抑制劑和I13家族的成員例如水蛭蛋白酶抑制劑C(I13.001)和大麥(棒ley)抑制劑CI-1A(I13.005)，它們中的許多也抑制胰凝乳蛋白酶(S01.001)?？莶輻U菌蛋白酶前肽是其自身的抑制物，并且來(lái)自酵母屬的同源蛋白酶B抑制物抑制塞里維辛(cerevisin)(S08.052)。目前已測(cè)定S8家族的幾個(gè)成員的三級(jí)結(jié)構(gòu)。典型的S8蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由具有在兩層螺旋之間的7鏈β折疊夾層的三層組成?？莶輻U菌蛋白酶(S08.001)是SB系類(lèi)型結(jié)構(gòu)(SB)。盡管具有不同的結(jié)構(gòu)，枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(S01.001)的活性部位是可以疊加的，表明相似性是趨同而非趨異進(jìn)化的結(jié)果。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“桿菌”和“桿菌屬”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知桿菌屬的所有成員，包括但不限于枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、B.halodurans、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、燦爛芽孢桿菌(B.lautus)和蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)。應(yīng)承認(rèn)，桿菌屬還在持續(xù)進(jìn)行分類(lèi)學(xué)上的重新組織。所以，桿菌屬包括那些已經(jīng)重新分類(lèi)的物種，包括但不限于例如嗜熱脂肪芽孢桿菌(現(xiàn)在命名為Geobacillusstearothermophilus)等微生物。氧氣存在下抵抗性的內(nèi)生孢子被認(rèn)為是桿菌屬的定義性特征，雖然該特征也適用于現(xiàn)在命名的環(huán)脂芽孢桿菌(Alicyclobacillus)、兼性芽孢桿菌(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢桿菌(Aneurinibacillus)、厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus)、短芽孢桿菌(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢桿菌(Gracilibacillus)、喜鹽芽孢桿菌(Halobacillus)、類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus)、需鹽芽孢桿菌(Salibacillus)、耐熱芽孢桿菌(Thermobacillus)、Ureibacillus和枝芽孢桿菌(Virgibacillus)。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可互換地使用。與IUPAC-IUBJointCommissiononBiochemicalNomenclature(JCBN)一致定義的氨基酸的3字母密碼用于本公開(kāi)中。應(yīng)當(dāng)理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，多肽可以由一種以上的核苷酸序列編碼。“前序列”是蛋白酶的信號(hào)肽和成熟區(qū)之間的氨基酸序列。在成熟過(guò)程期間剪切前序列，導(dǎo)致產(chǎn)生蛋白酶的活性成熟形式。術(shù)語(yǔ)“信號(hào)序列”或“信號(hào)肽”指參與成熟或前體形式的蛋白質(zhì)分泌的任一核苷酸和/或氨基酸序列。該信號(hào)序列的定義是功能性定義，意圖包括由蛋白質(zhì)基因的氨基端部分編碼的所有氨基酸序列，其參與蛋白質(zhì)分泌的實(shí)施。它們通常，但并非普遍地與蛋白質(zhì)的氨基端部分或與前體蛋白質(zhì)的氨基端部分結(jié)合。信號(hào)序列可以是內(nèi)源的或者外源的。信號(hào)序列通?？梢允桥c蛋白質(zhì)(例如，蛋白酶)相關(guān)的，或者可以來(lái)自編碼其他分泌蛋白質(zhì)的基因。一種示例性外源信號(hào)序列包含與來(lái)自遲緩芽孢桿菌(ATCC21536)的枯草桿菌蛋白酶的信號(hào)序列的剩余部分融合的枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的信號(hào)序列的前七個(gè)氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)“雜合信號(hào)序列”指信號(hào)序列中的一部分是獲自與待表達(dá)的基因的信號(hào)序列融合的表達(dá)宿主的信號(hào)序列。在一些實(shí)施方案中，使用合成的序列。術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)或肽的“成熟”形式指蛋白質(zhì)或肽的最終功能性形式。作為示例,本文中提供的FNA蛋白酶的成熟形式包括SEQIDNO:7的氨基酸序列，而GG36的成熟形式包括SEQIDNO:4的氨基酸序列。本文中的術(shù)語(yǔ)“前體”指具有與成熟蛋白質(zhì)的氨基端或羧基端有效連接的前序列的蛋白質(zhì)或肽形式。作為示例，成熟GG36(SEQIDNO:4)和FNA(SEQIDNO:7)的前體的序列分別為SEQIDNOS:3和SEQIDNOS:6。前體也可以具有與前序列的氨基端有效連接的“信號(hào)”序列。前體也可以具有涉及翻譯后活性的其他多核苷酸(例如，從其剪切以釋放成熟形式的蛋白質(zhì)或肽的多核苷酸)。“天然存在的酶”和“天然存在的蛋白質(zhì)”指具有與見(jiàn)于天然界的氨基酸序列相同的非修飾的氨基酸序列的酶或蛋白質(zhì)。天然存在的酶包括天然酶，那些酶天然表達(dá)于或見(jiàn)于特定的微生物中。術(shù)語(yǔ)“源自”和“獲自”不僅指由所討論的生物的菌株產(chǎn)生的或可產(chǎn)生的酶，例如蛋白酶，也指由分離自此種菌株的DNA序列編碼的和在含有此種DNA序列的宿主生物中產(chǎn)生的酶。此外，該術(shù)語(yǔ)指由合成的和/或cDNA來(lái)源的DNA序列編碼的酶，并且該酶具有所討論酶的相同的特征。本定義范圍內(nèi)的“衍生物”通常保留了在野生型、天然或親本形式中觀察到的特征性蛋白水解活性，以使衍生物可以用于野生型、天然或親本形式類(lèi)似的目的。功能性酶衍生物包括天然發(fā)生的、合成或重組產(chǎn)生的具有親本酶的一般特征的肽或肽片段。如本文中所用，“對(duì)應(yīng)于”指在蛋白質(zhì)或肽中所列舉的位置處的殘基。如本文中所用，“替換的”和“替換”指取代親本序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基或核酸堿基。在一些實(shí)施方案中，該替換涉及取代天然存在的殘基或堿基。在一些實(shí)施方案中，替換兩個(gè)或多個(gè)氨基酸以產(chǎn)生包含組合氨基酸替換的變體蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，組合替換通過(guò)進(jìn)行了替換的位置處的氨基酸表示。例如，由E6A-E30G表示的組合意為用丙氨酸(A)替換了位置6處的谷氨酸(E)，并且用甘氨酸(G)替換了位置30處的谷氨酸(E)。給出的氨基酸位置對(duì)應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的成熟區(qū)域(SEQODNO:1)中的編號(hào)位置。本文中的短語(yǔ)“在兩個(gè)或多個(gè)位置處的替換”指在同一蛋白質(zhì)中進(jìn)行兩個(gè)或多個(gè)替換的組合。因此，“在兩個(gè)或多個(gè)位置處的替換”指2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)和7個(gè)氨基酸替換的組合的任意一種。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”和“表達(dá)載體”指重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其具有一系列允許特定的核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的特定核酸元件。該重組表達(dá)盒可以摻入到質(zhì)粒、染色體、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或核酸片段中。一般地，除其他序列外，表達(dá)載體的重組表達(dá)盒部分包括待轉(zhuǎn)錄的核酸序列和啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)載體具有在宿主細(xì)胞中摻入并表達(dá)異源DNA片段的能力。許多原核的和真核的表達(dá)載體是商業(yè)可獲得的。選擇合適的表達(dá)載體是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)的。在本文中，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”與“DNA構(gòu)建體”和它們的語(yǔ)法等同形式可以互換地使用。選擇合適的表達(dá)載體是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)的。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“載體”指設(shè)計(jì)用于將核酸導(dǎo)入一種或多種細(xì)胞類(lèi)型的多核苷酸構(gòu)建體。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、盒等。在一些實(shí)施方案中，該多核苷酸構(gòu)建體包含編碼蛋白酶(例如，前體或成熟蛋白酶)的DNA序列，所述DNA序列與能在合適的宿主中影響該DNA表達(dá)的合適的前序列(例如，分泌的序列等)有效連接。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！敝赣米鳛榭寺≥d體的環(huán)狀雙鏈(ds)DNA構(gòu)建體，并且其在一些真核生物或原核生物中形成了染色體外的自我復(fù)制遺傳元件或者整合到宿主染色體中。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”指用于包含根據(jù)本發(fā)明的DNA的表達(dá)載體的合適宿主。如本文中所用，“清潔組合物”和“清潔制劑”指用于從待清潔的物品除去不需要的化合物的組合物，所述物品例如織物、餐具、隱形眼鏡、其他固體底物、頭發(fā)(洗發(fā)劑)、皮膚(肥皂和乳膏)、牙齒(漱口劑、牙膏)等。該術(shù)語(yǔ)包括選擇用于特定類(lèi)型的所希望的清潔組合物的任一物質(zhì)/化合物以及在該組合物中使用的產(chǎn)品的形式(例如，液體、凝膠、顆粒、粉末或噴霧組合物)。通過(guò)考慮待清潔的表面、物品或織物以及在使用期間用于清潔條件的組合物的希望形式，可以容易地進(jìn)行清潔組合物材料的特定選擇。該術(shù)語(yǔ)也指適合于清潔、漂白、消毒和/或殺菌任意物體和/或表面的任一組合物。該術(shù)語(yǔ)意圖包括但不限于洗滌劑組合物(例如，液體和/或固體洗衣劑和精細(xì)織物洗滌劑；硬表面清潔制劑，例如用于玻璃、木材、陶瓷的和金屬的臺(tái)面和窗戶的清潔制劑；地毯清潔劑；烤箱清潔劑；織物增鮮劑；織物軟化劑；和紡織品和衣物預(yù)去斑劑，以及餐具洗滌劑)。事實(shí)上，除非另外指明，本文中所用的術(shù)語(yǔ)“清潔組合物”包括，干的例如顆?；蚍勰┬问降娜Щ驈?qiáng)效洗滌劑，特別是清潔洗滌劑；液體的、凝膠的或者膏狀形式的全效洗滌劑，特別是所謂的強(qiáng)效液體(HDL)型；液體精細(xì)織物洗滌劑；手洗餐具洗滌劑或輕漬餐具洗滌劑，特別是那些高發(fā)泡型(high-foamingtype)；家用和公用的機(jī)洗餐具洗滌劑，包括多種片劑、顆粒、液體和助漂洗類(lèi)型；液體清潔和消毒劑，包括抗菌型手洗洗滌類(lèi)型、清潔棒、漱口劑、假牙清潔劑、汽車(chē)和地毯洗滌劑、衛(wèi)浴清潔劑；洗發(fā)劑和護(hù)發(fā)素；沐浴凝膠和泡沫浴和金屬清潔劑；以及清潔助劑例如漂白添加劑和“染色棒(stain-stick)”或預(yù)處理類(lèi)型。如在本文中所用，“織物清潔組合物”包括手洗和機(jī)洗衣物洗滌劑組合物，包括衣物添加組合物和適合于在浸泡和/或預(yù)處理污垢織物(例如，衣物，日用織品和其他紡織材料)中使用的組合物。如本文中所用，“非織物清潔組合物”包括非紡織的(即，織物的)表面清潔組合物，包括但不限于餐具清洗洗滌劑組合物、口腔清潔組合物、假牙清潔組合物和個(gè)人清潔組合物。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“洗滌劑組合物”和“洗滌劑制劑”用于指意圖在用于清潔臟物體的洗滌介質(zhì)中使用的混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)用于指用于清潔餐具、刀叉餐具等(例如“餐具洗滌劑”或“餐具清潔洗滌劑”)的洗滌劑。并不意圖使本發(fā)明限于任一具體的洗滌劑制劑或組合物。事實(shí)上，除含有本發(fā)明的至少一種蛋白酶的洗滌劑外，該術(shù)語(yǔ)還包括含有表面活性劑、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、氧化還原酶、助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、上藍(lán)劑和熒光染料、抗結(jié)塊劑、掩蔽劑、酶活化劑、抗氧化劑和助溶劑的洗滌劑。如本文中所用，“餐具洗滌組合物”指用于清潔餐具包括刀叉餐具的組合物的所有形式，包括但不限于顆粒和液體形式。并不意圖使本發(fā)明限于任一具體類(lèi)型餐具組合物。事實(shí)上，本發(fā)明用于清潔任意材料的餐具(例如，餐具，包括但不限于盤(pán)子、杯子、玻璃杯、碗等)和刀叉餐具(例如，器具，包括但不限于匙、刀、叉、餐點(diǎn)器具等)，所述材料包括但不限于陶瓷、塑料、金屬、瓷器、玻璃、丙烯酸脂類(lèi)等。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“餐具”指餐具和刀叉餐具二者。如本文中所用，“無(wú)磷酸鹽餐具洗滌劑”是含有不多于0.5％的磷(即，磷是痕量元素)的洗滌劑。如本文中所用，變體蛋白酶的“洗滌性能”或“清潔性能”指當(dāng)與不存在蛋白酶變體的情況下獲得的清潔能力比較時(shí)，變體蛋白酶對(duì)清潔組合物的清潔能力所起的作用。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“相關(guān)洗滌條件”指餐具或衣物洗滌劑細(xì)分市場(chǎng)中在家庭中實(shí)際使用的條件，特別是洗滌溫度、時(shí)間、洗滌機(jī)械、肥皂液濃度、洗滌劑類(lèi)型和水硬度。術(shù)語(yǔ)“改善的洗滌性能”用于指在相關(guān)洗滌條件下在去污中獲得的更好的最終結(jié)果，或者指相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型或起始親本蛋白酶獲得相同的最終結(jié)果所需的在重量方面更少的變體蛋白酶。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“消毒”指從表面去除污垢，以及抑制或者殺滅物品表面的微生物。并不意圖使本發(fā)明限于任一具體的表面、物品或者待除去的污垢或微生物。如本文中所用，“酶的有效量”指為達(dá)到具體應(yīng)用(例如，個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、清潔組合物等)中所需的酶活性所需的酶的量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地確定該有效量，并且其基于許多因素，例如所用的具體的酶變體、清潔應(yīng)用、清潔組合物的具體成分，以及需要的是液體組合物還是干(例如，顆粒、棒料)組合物，等。本文中清潔組合物的“緊湊型”形式通過(guò)密度得到最好反映，并且就組合物而言，由無(wú)機(jī)填料鹽的量得到最好反映。無(wú)機(jī)填料鹽是粉末形式洗滌劑組合物的常規(guī)成分。在常規(guī)洗滌劑組合物中，該填充鹽以基本量存在，一般占總組合物重量的約17％至約35％。相比之下，在緊湊型組合物中，該填充鹽以不超出總組合物的約15％的量存在。在一些實(shí)施方案中，該填充鹽按組合物的重量以不超過(guò)約10％，或者更優(yōu)選地約5％的量存在。在一些實(shí)施方案中，該無(wú)機(jī)填料選自堿金屬和堿土金屬的硫酸鹽和鹽酸鹽。優(yōu)選的填料鹽是硫酸鈉。如本文中所用，“輔助成分”或“輔助材料”指清潔材料，包括但不限于表面活性劑、助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、漂白催化劑、其他酶、酶穩(wěn)定系統(tǒng)、螯合劑、熒光增白劑、污物釋放聚合物、染料傳遞劑、分散劑、抑泡劑、染料、香料、著色劑、填充鹽、水溶增溶劑、光漂劑、熒光增白劑、織物調(diào)節(jié)劑、水解表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑、抗縮劑、抗皺劑、殺菌劑、殺真菌劑、色斑、silvercare、防晦暗劑和/或防腐蝕劑、堿度來(lái)源、增溶劑、載體、加工助劑、色素和pH控制劑(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，所述全部專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖颂幰胱鳛閰⒖?。如本文中所用，“餐具洗滌組合物”指用于清潔餐具的組合物的所有形式，包括但不限于顆粒和液體形式。如本文中所用，“織物清潔組合物”指用于清潔織物的洗滌劑組合物的所有形式，包括但不限于顆粒、液體和棒狀形式。如本文中所用，“織物”包括任一織造材料。因此，該術(shù)語(yǔ)意圖包括衣服，以及織品、紗、纖維、非織造材料、天然材料、合成材料和任一其他織造材料。如本文中所用，“紡織品”指織造的織物，以及適合于轉(zhuǎn)變成或者用作紗的短纖維和長(zhǎng)絲、織造物、針織品和非織造織物。該術(shù)語(yǔ)包括天然，以及合成的(例如，制造的)纖維制造的紗。如本文中所用，“紡織材料”是用于纖維、紗中間產(chǎn)品、紗、織物和由織物制造的產(chǎn)品(例如，衣服和其他物品)的常用術(shù)語(yǔ)。目前用于在工業(yè)、消費(fèi)或藥物應(yīng)用中改善蛋白質(zhì)性能的大多數(shù)策略都集中于在酶活性部位或者在酶活性部位附近的氨基酸替換，以增加催化效率。然而，在本發(fā)明的研發(fā)期間，測(cè)定到除可能由于催化效率改善而增加的酶性能之外，在酶表面上其他位置的突變顯著地增加了酶性能。基本上，由酶介導(dǎo)的控制底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的反應(yīng)速率僅部分地通過(guò)單獨(dú)的化學(xué)催化轉(zhuǎn)變步驟的速率控制。在酶和底物結(jié)合為酶-底物ES復(fù)合物之前，以及在從化學(xué)轉(zhuǎn)變后形成的酶-產(chǎn)物EP復(fù)合物解離期間，酶和底物作為膠體相互作用。即使該反應(yīng)步驟以快速率進(jìn)行，酶也可以非常慢地靠近底物(例如，擴(kuò)散限制)，如同經(jīng)歷靜電排斥力的相同指標(biāo)的膠體的情況一樣。此外，酶從酶-產(chǎn)物EP復(fù)合物中釋放可以非常地慢(例如，擴(kuò)散限制)，如同經(jīng)歷短程疏水引力和分散力的膠體的情況一樣。與化學(xué)轉(zhuǎn)變比較，兩種條件都增加了酶轉(zhuǎn)換底物為產(chǎn)物的時(shí)間，并成為限速步驟。盡管可以假設(shè)，相反電荷的膠體可以事實(shí)上地加速ES復(fù)合物的形成(例如，在擴(kuò)散極限以上)，但是隨后的EP復(fù)合物的解離會(huì)相當(dāng)?shù)穆?假定沒(méi)有電荷產(chǎn)生或者丟失)并可能降低總體反應(yīng)速率。因此，開(kāi)發(fā)了不對(duì)稱(chēng)的成對(duì)相互作用勢(shì)能(thepair-wiseinteractionpotential)以確保最小化ES復(fù)合物和EP復(fù)合物二者的轉(zhuǎn)換時(shí)間。這在工業(yè)生物技術(shù)中特別重要，因?yàn)槠淦谕谕ǔ５拿赶拗菩詶l件下以盡可能最短的時(shí)間將所有的底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物。歷史上，蛋白質(zhì)工程師側(cè)重于化學(xué)轉(zhuǎn)變步驟的特定酶-底物相互作用，并沒(méi)有意識(shí)到由膠體分子間力和表面力產(chǎn)生的短期和長(zhǎng)期非特異性相互作用二者的作用，所述相互作用控制結(jié)合和解離步驟。本發(fā)明的目的是提供了通過(guò)改變酶表面上一個(gè)或多個(gè)氨基酸的性質(zhì)獲得的具有改變的表面特性的蛋白酶變體，其優(yōu)化了分子間作用力，使得化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟成為限速步驟。表面特性的修飾通過(guò)使用本文中所述的方法引入改變酶的電荷和/或疏水性的氨基酸替換達(dá)到。一旦該化學(xué)轉(zhuǎn)變步驟成為了限速步驟，那么可以通過(guò)改變酶活性部位來(lái)達(dá)到變體酶性能的進(jìn)一步改善。無(wú)論底物是溶液中的小肽還是不溶性宏觀底物，該目的都是適用的。然而，涉及的機(jī)制知識(shí)對(duì)于制備和使用本發(fā)明并非必需。并不意圖使本發(fā)明限于任一具體的機(jī)制。簡(jiǎn)而言之，用于產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白酶變體的方法包括(I)測(cè)定跨度物理特性范圍的探針蛋白質(zhì)；(II)測(cè)定給定的所要結(jié)果的物理特性最佳值；和(III)提供具有物理特性最佳值的變體蛋白質(zhì)。I.測(cè)定探針蛋白質(zhì)測(cè)定探針蛋白質(zhì)涉及在合適的測(cè)定中檢測(cè)覆蓋目的物理特性(即“目的特性”)范圍的多個(gè)探針蛋白質(zhì)(即“探針蛋白質(zhì)折疊”)。探針蛋白質(zhì)包括蛋白質(zhì)和/或其變體的有限集。在一些示例性實(shí)施方案中，測(cè)試了至少一種絲氨酸蛋白酶的一種或多種優(yōu)點(diǎn)。例如，提供了相對(duì)于親本酶的變體(兩種絲氨酸蛋白酶，GG36和FNA)的凈電荷的改變。在本文中描述了GG36和FNA變體的凈電荷改變，與各自的親本酶比較，跨越了-7至0的相對(duì)靜電荷改變范圍。II.測(cè)定物理特性最佳值測(cè)定物理特性最佳值即測(cè)定目的特性的最佳值，涉及鑒定所要結(jié)果的物理特性最佳值或其范圍。在一些示例性實(shí)施方案中，測(cè)量了FNA和GG36蛋白酶變體的清潔性能指數(shù)，在本文中提供為BMIPI。在其他實(shí)施方案中，測(cè)量了FNA和GG36蛋白酶變體的表達(dá)水平，在本文中提供為T(mén)CAPI。在本實(shí)施方案中，當(dāng)比較用具有相同折疊模式的蛋白質(zhì)即絲氨酸蛋白酶獲得的優(yōu)點(diǎn)時(shí)，使用了相對(duì)比較(例如，相對(duì)于野生型或親本蛋白質(zhì)的靜電荷差異)。備選地，當(dāng)比較用具有不同折疊模式的蛋白質(zhì)，例如絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶獲得的優(yōu)點(diǎn)時(shí)，使用了常見(jiàn)的物理特性尺度(例如，報(bào)道為ζ電勢(shì)的蛋白質(zhì)電荷)。使用跨越寬物理特性范圍的探針蛋白質(zhì)，以增加定義物理特性的最佳值的可能性。一旦通過(guò)測(cè)定探針蛋白質(zhì)建立了目的優(yōu)點(diǎn)的最佳值或最佳值范圍，那么就可以預(yù)測(cè)將較差的性能(performer)(例如，處于最佳值范圍的外面)轉(zhuǎn)變成較高性能(performer)(例如，在最佳值范圍內(nèi))可能所需的改變的總趨勢(shì)和強(qiáng)度二者?？紤]使用一種以上的探針蛋白質(zhì)系列，以允許鑒定目的優(yōu)點(diǎn)的不同物理特性最優(yōu)條件。例如在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)了相對(duì)于洗滌劑蛋白酶GG36和FNA的親本酶的凈電荷和疏水性二者的改變?cè)谘?、乳、墨測(cè)定中的清潔性能。在一些例子中，認(rèn)為相同的物理特性對(duì)于不同優(yōu)點(diǎn)會(huì)顯示出不同的最佳值。例如，存在FNA的清潔性能(BMIPI)的最佳蛋白酶電荷，其與表達(dá)水平(TCAPI)的最佳蛋白酶電荷不同。在一些實(shí)施方案中，在測(cè)量的ζ電勢(shì)、凈電荷、電荷密度和/或可離子化基團(tuán)的表面計(jì)數(shù)方面比較了親本蛋白質(zhì)和變體蛋白質(zhì)之間與電荷相關(guān)的物理特性?？偠灾瑴y(cè)定蛋白質(zhì)電荷的任一方法(滴定法或者電泳測(cè)量法)都適合于比較不同的蛋白質(zhì)折疊模式。當(dāng)具備時(shí)，通過(guò)計(jì)算基于蛋白質(zhì)一級(jí)、二級(jí)和/或三級(jí)序列信息的一個(gè)或多個(gè)上述值來(lái)比較不同蛋白質(zhì)變體。用于此類(lèi)目的的一般生物信息學(xué)工具包括使用Henderson-Hesselbach等式(例如，EuropeanMolecularBiologyLaboratory)的等電點(diǎn)計(jì)算器或者Poisson-Boltzmann靜電解算機(jī)(例如，DelPhi，MOE)。III.提供具有物理特性最佳值的變體蛋白質(zhì)一旦在以上步驟中確定了最佳值和范圍，那么將提供滿足目的物理特性的多個(gè)候選蛋白質(zhì)。用于提供候選蛋白質(zhì)的合適方法包括但不限于，通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生人工酶變體，以及通過(guò)層析法純化天然酶變體(例如，同源的)、體外合成糖基化或磷酸化酶變體或者體外產(chǎn)生的酶綴合物。通過(guò)糖基化改變蛋白質(zhì)的疏水性的另一方法是在酶的表面產(chǎn)生新的糖基化部位。在表達(dá)期間將會(huì)體內(nèi)地糖基化這些變體。在一些實(shí)施方案中，就由替換的殘基對(duì)產(chǎn)生的變體相對(duì)于親本酶的疏水性?xún)舾淖兊目傮w貢獻(xiàn)而言，比較了蛋白酶變體間與疏水性相關(guān)的物理性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，使用文獻(xiàn)中可得到的和本領(lǐng)域已知的許多氨基酸疏水尺度的一種或多種來(lái)計(jì)算總體疏水貢獻(xiàn)，其將蛋白質(zhì)一級(jí)、二級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)信息考慮在內(nèi)。例如就測(cè)量的蛋白質(zhì)在其天然含水環(huán)境和疏水相之間分配而言，比較不同的蛋白質(zhì)折疊模式間與疏水性相關(guān)的物理特性。例子包括但不限于在空氣-水或者庚烷-水界面處的表面張力，以及在水相和含有固體底物相之間的接觸角和潤(rùn)濕測(cè)量?？傊?，適合于表征蛋白質(zhì)在兩種相之間分配的任一方法都適合于在本發(fā)明中使用，包括光學(xué)的(例如，橢圓對(duì)稱(chēng)、表面等離子共振、干涉測(cè)量和/或反射性)測(cè)定法、聲學(xué)的(例如，石英晶體微量天平)測(cè)定法、熒光測(cè)定法、光譜學(xué)(例如，衰減全反射紅外的)測(cè)定法或者濃度(例如，酶活性)測(cè)定法。由于帶電荷殘基增加了親水特性，因此電荷和疏水性尺度并非是相互獨(dú)立的。因此，本發(fā)明的一些實(shí)施方案并不是簡(jiǎn)單的相對(duì)于其他而挑選一個(gè)尺度，而是使用多種不同的尺度(例如，理論或者實(shí)驗(yàn)測(cè)定的尺度)用于鑒定物理特性依從性。最常用的23種疏水性尺度的文獻(xiàn)包括：疏水性(Rao和Argos)：計(jì)算膜埋入的螺旋參數(shù)(Rao和Argos，Biochim.Biophys.Acta869：197-214[1986])；疏水性(Black和Mould)：計(jì)算生理性L-α氨基酸的疏水性(Black和Mould，Anal.Biochem.，193：72-82[1991])；疏水性(Bull和Breese)：計(jì)算疏水性(以kcal/mole表示的轉(zhuǎn)移到表面的自由能)(Bull和Breese，Arch.Biochem.Biophys.161：665-670[1974])；疏水性(Chothia)：計(jì)算95％埋入殘基的比例(在12種蛋白質(zhì)中)(Chothia，J.Mol.Biol.，105：1-14[1976])；疏水性(Kyte和Doolittle)：計(jì)算親水性(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-132[1982])；疏水性(Eisenberg等人)：計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化的共同疏水性尺度(Eisenberg等人，J.Mol.Biol.179：125-142[1984])；疏水性(Fauchere和Pliska)：計(jì)算疏水性尺度(pi-r)(Fauchere和Pliska，Eur.J.Med.Chem.，18：369-375[1983])；疏水性(Guy)：基于轉(zhuǎn)移自由能(kcal/mole)計(jì)算疏水性尺度(Guy，BiophysJ.，47：61-70[1985])；疏水性(Janin)：計(jì)算從球蛋白內(nèi)部轉(zhuǎn)移到外部的自由能(Janin，Nature277：491-492[1979])；疏水性(Abraham和Leo)計(jì)算疏水性(deltaG1/2cal)(Abraham和Leo，Proteins：Structure，F(xiàn)unctionandGenetics2：130-152[1987])；疏水性(Manavalan等人)計(jì)算周?chē)骄氖杷?Manavalan等人，Nature275：673-674[1978])；疏水性(Miyazawa等人)計(jì)算疏水性尺度(基于3D數(shù)據(jù)的接觸能)(Miyazawa等人，Macromolecules18：534-552[1985])；疏水性(Aboderin)計(jì)算氨基酸在層析紙上的遷移率(RF)(Aboderin，Int.J.Biochem.，2：537-544[1971])；疏水性HPLC(Parker等人)基于HPLC肽滯留時(shí)間計(jì)算親水性尺度(Parker等人，Biochem.，25：5425-5431[1986])；Hphob.HPLCpH3.4通過(guò)HPLC測(cè)定計(jì)算ph3.4的疏水性指數(shù)(Cowan和Whittaker，PeptideRes.，3：75-80[1990])；Hphob.HPLCpH7.5通過(guò)HPLC測(cè)定計(jì)算計(jì)算ph7.5的疏水性指數(shù)(Cowan和Whittaker，PeptideRes.，3：75-80[1990])；疏水性(Rose等人)(AA)計(jì)算平均級(jí)分面積損失(f)[埋入的平均面積/標(biāo)準(zhǔn)態(tài)面積](Rose等人，Science229：834-838[1985])；和疏水性(Roseman)計(jì)算疏水性尺度(pi-r)(Roseman，J.Mol.Biol.，200：513-522[1988])。在具有相同的蛋白質(zhì)折疊模式的蛋白酶和其變體之間或者在不同的蛋白質(zhì)折疊模式之間比較的其他物理特性，包括但不限于，可溶性相關(guān)的物理特性、大小相關(guān)的物理特性和蛋白質(zhì)解鏈溫度。比較了不同蛋白質(zhì)折疊模式之間在前述電荷和疏水性尺度二方面的可溶性相關(guān)物理特性。總而言之，任一表征蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)-溶劑相互作用的熱力學(xué)或動(dòng)力學(xué)值都適合于用于本發(fā)明的方法。例如，可以使用反映背離理想混合性質(zhì)的第二維里系數(shù)(參見(jiàn)，Wilson，ActaCrystallographica，D50：361-365[1994])、chi參數(shù)、滲透壓和活性或者逸度系數(shù)(參見(jiàn)例如，Reid等人，“ThePropertiesofGasesandLiquids”，第4版，McGraw-Hill，[1987])。使用適合于測(cè)定蛋白質(zhì)或多聚體維度的任一實(shí)驗(yàn)方法比較不同蛋白質(zhì)折疊模式之間與大小相關(guān)的物理特性。使用蛋白質(zhì)或多聚體構(gòu)象(卷曲的、球狀的、分支的)、它們的分子量和流體動(dòng)力學(xué)半徑或者回轉(zhuǎn)半徑之間的常用相關(guān)性，從分子量推斷大小。用于大小或分子量測(cè)定的合適技術(shù)包括但不限于靜態(tài)光散射和動(dòng)態(tài)光散射、凝膠電泳、質(zhì)譜和層析。備選地，大小可以容易地從實(shí)驗(yàn)測(cè)定的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)的同源模型的信息中估計(jì)。蛋白質(zhì)解鏈溫度(Tm)一般通過(guò)監(jiān)測(cè)溫度范圍內(nèi)的物理指征特性測(cè)定。合適的方法包括但不限于，差示掃描量熱法、圓二色性、動(dòng)態(tài)光散射和紫外可見(jiàn)光譜。絲氨酸蛋白酶類(lèi)的應(yīng)用考慮將構(gòu)建的以產(chǎn)生蛋白酶變體的可組合突變用于增強(qiáng)在多種應(yīng)用中的至少一種需要的酶特性的性能指數(shù)，例如確定性能最佳值。性能/特性最佳值的確定主要受到所使用的介質(zhì)(例如，洗滌劑的配方、pH、離子強(qiáng)度，等)，以及目的酶的氨基酸殘基的凈電荷和電荷分布影響。因此，考慮存在針對(duì)變化的pH、離子強(qiáng)度、表面活性劑類(lèi)型和比率、助洗劑和螯合劑的不同制劑的最佳酶，所有所述因素都影響靜電現(xiàn)象?？紤]使用酶混合物用于生產(chǎn)適合于多種條件(例如，在具有不同的水硬度的不同地區(qū)或場(chǎng)所中出售的洗滌劑制劑中的蛋白酶)的制劑，其中該混合物的每一成員擁有不同的電荷最佳值。也考慮了用于生產(chǎn)適合于清潔多種污跡的制劑的酶混合物的用途，其中該混合物的每一成員擅長(zhǎng)于清潔不同的污跡。此外，考慮了在酶反應(yīng)期間，酶底物自身經(jīng)歷電荷改變的情況下酶混合物的用途，其中該混合物的每一成員擁有不同的電荷最佳值。盡管在本文中以蛋白酶和血漬、乳漬和墨漬的關(guān)系的方式進(jìn)行描述，但是應(yīng)當(dāng)考慮，本發(fā)明的蛋白酶變體對(duì)于在由應(yīng)用例如清潔應(yīng)用指定的任意多種反應(yīng)介質(zhì)(即條件)中的任一酶-底物相互作用是最優(yōu)的。如本文中更詳細(xì)的描述，本發(fā)明的變體蛋白酶具有重要的特性，使得它們非常適合于某些應(yīng)用。例如，在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體蛋白酶與一些目前使用的蛋白酶比較，具有改變的電荷和/或疏水性。因此，這些蛋白酶特別地用于清潔組合物中。事實(shí)上，在某些洗滌條件下，與目前使用的枯草桿菌蛋白酶比較，本發(fā)明的蛋白酶顯示出相當(dāng)?shù)幕蛟鰪?qiáng)的表達(dá)和/或去污活性。因此，應(yīng)當(dāng)考慮將本發(fā)明的清潔和/或酶組合物提供在多種清潔組合物中。因此，本發(fā)明蛋白酶可以用于多種清潔組合物，以及動(dòng)物飼料應(yīng)用、皮革加工(例如，軟化)、蛋白質(zhì)水解和紡織品用途。該鑒定的蛋白酶也可以用于個(gè)人護(hù)理應(yīng)用。事實(shí)上，本發(fā)明的蛋白酶變體可以用于許多工業(yè)應(yīng)用，特別是用于清潔、消毒、動(dòng)物喂飼和紡織/皮革工業(yè)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶與洗滌劑、助洗劑、漂白劑和其他常規(guī)成分組合以產(chǎn)生多種在衣物和其他清潔領(lǐng)域中使用的新清潔組合物，例如，如衣物洗滌劑(粉末衣物洗滌劑和液體衣物洗滌劑二者)、衣物預(yù)洗劑、完全織物漂白劑、自動(dòng)餐具清洗洗滌劑(液體自動(dòng)餐具清洗洗滌劑和粉末自動(dòng)餐具清洗洗滌劑二者)、家庭清洗劑、特別是棒和液體皂應(yīng)用和drainopeners。此外，通過(guò)將該材料與清潔組合物的水溶液接觸，變體蛋白酶可以用于隱型眼鏡以及其他物品的清潔。此外，這些變體蛋白酶可以用于例如肽水解、廢物處理、紡織品應(yīng)用、醫(yī)療器材清潔、生物膜去除，并可以用作為蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的融合-剪切酶等。這些產(chǎn)品的組合物對(duì)于本發(fā)明并不是關(guān)鍵的，只要變體蛋白酶在所使用的環(huán)境中一直維持其功能。在一些實(shí)施方案中，該組合物可以通過(guò)將清潔有效量的蛋白酶變體或者包含變體蛋白酶制備物的酶組合物與該組合物的常規(guī)成分以其領(lǐng)域公認(rèn)的量組合來(lái)容易地制備。清潔組合物除非另外指出，本文中提供的所有組分或組合物水平通過(guò)參考組分或組合物的活性水平而提供，并不包括雜質(zhì)，例如，殘留溶劑或副產(chǎn)物，其可能存在于市售的來(lái)源中。酶組分的重量基于總活性蛋白質(zhì)。除非另外指出，所有百分比和比率都通過(guò)重量計(jì)算。除非另外指出，所有百分比和比率都基于全部組合物計(jì)算。在示例性洗滌劑組合物中，酶水平按總組合物的重量計(jì)的純酶表述，并且除非特別說(shuō)明，洗滌劑成分按總組合物的重量計(jì)的方式來(lái)表述。如本文所示，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物進(jìn)一步包含輔助材料，包括但不限于表面活性劑、助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、漂白催化劑、其他酶類(lèi)、酶穩(wěn)定系統(tǒng)、螯合劑、熒光增白劑、污物釋放聚合物、染料傳遞劑、分散劑、抑泡劑、染料、香料、著色劑、填充鹽、水溶增溶劑、光漂劑、熒光增白劑、織物調(diào)節(jié)劑、可水解表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑、抗縮劑、抗皺劑、殺菌劑、殺真菌劑、增光劑、silvercare、防晦暗劑和/或放腐蝕劑、堿度來(lái)源、增溶劑、載體、加工助劑、色素和pH控制劑(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，所述全部專(zhuān)利在此處引用作為參考)。具體清潔組合物的實(shí)施方案在以下詳細(xì)說(shuō)明。在清潔組合物中清潔輔助材料與本發(fā)明的變體蛋白酶不兼容的實(shí)施方案中，那么使用保持清潔輔助材料與蛋白酶分離(即相互并不接觸)直到需要兩種組分組合時(shí)的合適方法。該分離方法包括本領(lǐng)域已知的任一合適的方法(例如，軟膠囊、膠囊、片劑、物理分離，等)。本發(fā)明的清潔組合物可以有利地用于例如衣物應(yīng)用、硬表面清潔、餐具清洗應(yīng)用，以及美容應(yīng)用例如假牙、牙齒、頭發(fā)和皮膚。此外，由于在較低溫度溶液中具有增加的有效性的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的酶特別適合于衣物應(yīng)用。而且，本發(fā)明的酶可以用于顆粒和液體組合物。本發(fā)明的變體蛋白酶也可以用于清潔添加劑產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，用于低溫溶液清潔應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)需要其他的漂白效果時(shí)，本發(fā)明提供了特別適合于摻入到洗滌過(guò)程中的包含本發(fā)明的至少一種酶的清潔添加產(chǎn)品。此類(lèi)例子包括但不限于低溫溶液清潔應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，該添加劑產(chǎn)品是其最簡(jiǎn)單的形式，一種或多種蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，該添加劑是以劑量形式包裝的，用于添加到清潔過(guò)程中。在一些實(shí)施方案中，添加劑是以劑量形式包裝的，用于添加到清潔過(guò)程中，其中使用了過(guò)氧化(peroxygen)源并且期望得到增加的漂白效果。本發(fā)明使用的任一合適的單一劑量單位形式包括但不限于，丸劑、片劑、軟膠囊，或者其他單一劑量單位例如預(yù)量過(guò)的粉末或液體。在一些實(shí)施方案中，包含填充物或載體材料以增加此類(lèi)組合物的體積。合適的填充物或載體材料包括但不限于，多種硫酸鹽、碳酸鹽和硅酸鹽以及滑石、粘土等。用于液體組合物的合適填充物或載體材料包括但不限于，水或低分子量一級(jí)醇和二級(jí)醇包括多元醇和二元醇。此類(lèi)醇的示例包括但不限于，甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇。在一些實(shí)施方案中，該組合物含有約5％至約90％的此類(lèi)物質(zhì)。酸性填充物用于降低pH。備選地，在一些實(shí)施方案中，該清潔添加劑包括如下更充分描述的輔助成分。本清潔組合物和清潔添加劑需要有效量的本文中所提供的至少一種蛋白酶變體，其可以是單獨(dú)的或者與其他蛋白酶和/或其他酶的組合。所需酶的水平通過(guò)添加一種或多種本發(fā)明的蛋白酶變體來(lái)達(dá)到。一般地，本清潔組合物包括至少約0.0001重量百分比，約0.0001至約10，約0.001至約1或者甚至約0.01至約0.1重量百分比的本發(fā)明的至少一種變體蛋白酶。本文中的清潔組合物一般如下配制以在用于含水清潔操作期間使用時(shí)，洗滌用水具有約5.0至約11.5或者甚至約7.5至約10.5的pH。一般制備具有約3.0至約9.0或者甚至約3至約5的凈pH的液體產(chǎn)品制劑。一般制備具有約9至約11的pH的顆粒洗衣產(chǎn)品?？刂苝H在推薦的使用水平的技術(shù)包括緩沖液、堿、酸等的使用，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。合適的低pH清潔組合物一般具有約3至約5的凈pH，并且一般不含在該pH環(huán)境中水解的表面活性劑。此類(lèi)表面活性劑包括烷基硫酸鈉，其包含至少一個(gè)環(huán)氧乙烷部分或者甚至約1至約16摩爾的環(huán)氧乙烷。此類(lèi)清潔組合物一般包含足夠量的pH調(diào)節(jié)物，例如氫氧化鈉、單乙醇胺或鹽酸，以為此類(lèi)清潔組合物提供約3至約5的凈pH。此類(lèi)組合物一般包含至少一種酸穩(wěn)定酶。在一些實(shí)施方案中，該組合物是液體，而在其他實(shí)施方案中，它們是固體。此類(lèi)液體組合物的pH一般測(cè)量為凈pH。將此類(lèi)固體組合物的pH測(cè)量為所述組合物的10％固體溶液，其中該溶劑是蒸餾水。在這些實(shí)施方案中，除非另外指出，所有pH測(cè)量都在20℃進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)將變體酶用于顆粒組合物或液體中時(shí)，期望的是變體蛋白酶是封裝的顆粒形式，以在儲(chǔ)存期間保護(hù)變體蛋白酶免于受顆粒組合物中其他組分的影響。此外，包封也是在清潔過(guò)程中控制變體蛋白酶的有效性的方法。在一些實(shí)施方案中，包封增強(qiáng)了變體蛋白酶和/或其他酶的性能。就此而言，將本發(fā)明的變體蛋白酶用本領(lǐng)域已知的任一合適包封材料封裝。在一些實(shí)施方案中，該包封材料一般封裝了有關(guān)本發(fā)明的變體蛋白酶的催化劑的至少一部分。一般地，該包封材料是水溶的和/或水分散的。在一些實(shí)施方案中，該包封材料具有0℃或更高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)。玻璃化轉(zhuǎn)變溫度在WO97/11151中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述。該包封材料一般選自碳水化合物、天然或合成樹(shù)膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖、纖維素和纖維素衍生物、硅酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蠟和它們的混合物。當(dāng)包封物質(zhì)是碳水化合物時(shí)，其通常選自單糖、寡糖、多糖和它們的組合物。在一些一般的實(shí)施方案中，該封裝材料是淀粉(參見(jiàn)例如，EP0922499；US4,977,252；US5,354,559和US5,935,826)。在一些實(shí)施方案中，包封材料是用塑料制備的微球體，例如熱塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈和它們的混合物；可用的市售微球體包括但不限于那些由(Stockviksverken，瑞士)和PM6545、PM6550、PM7220、PM7228、和(PQCorp.，ValleyForge，PA)提供的微球體。如本文中所述，本發(fā)明的變體蛋白酶可以特別地用于清潔工業(yè)，包括但不限于衣物和餐具洗滌劑。這些應(yīng)用將酶置于多種環(huán)境壓力下。本發(fā)明的變體蛋白酶提供了優(yōu)于許多目前使用的酶的優(yōu)點(diǎn)，歸因于其在多種條件下的穩(wěn)定性。事實(shí)上，參與洗滌的蛋白酶暴露于多種洗滌條件，包括不同的洗滌劑制劑、洗滌用水體積、洗滌用水溫度和洗滌時(shí)間長(zhǎng)短。此外，在不同地區(qū)使用的洗滌劑制劑，其相對(duì)組分在洗滌用水中存在的濃度是不同的。例如，歐洲洗滌劑在洗滌用水中一般具有約4500-5000ppm的洗滌劑組分，而日本洗滌劑在洗滌用水中一般具有大約667ppm的洗滌劑組分。在北美，特別是美國(guó)，洗滌劑在洗滌用水中一般具有約975ppm的洗滌劑組分。低洗滌劑濃度系統(tǒng)包括在洗滌用水中存在小于約800ppm的洗滌劑組分的洗滌劑。一般認(rèn)為日本洗滌劑為低洗滌劑濃度系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈冊(cè)谙礈煊盟芯哂写蠹s667ppm的洗滌劑組分。中等洗滌劑濃度包括在洗滌用水中存在約800ppm至約2000ppm之間的洗滌劑組分的洗滌劑。一般認(rèn)為北美洗滌劑為中等洗滌劑濃度系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈冊(cè)谙礈煊盟芯哂写蠹s975ppm的洗滌劑組分。巴西洗滌劑在洗滌用水中存在的洗滌劑組分一般為大約1500ppm。高洗滌劑濃度系統(tǒng)包括在洗滌用水中存在大于約2000ppm的洗滌劑組分的洗滌劑。一般認(rèn)為歐洲洗滌劑為高洗滌劑濃度系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈冊(cè)谙礈煊盟芯哂写蠹s4500-5000ppm的洗滌劑組分。拉美洗滌劑一般是高泡磷酸鹽助洗劑洗滌劑，并且由于它們?cè)谙礈煊盟芯哂?500ppm至6000ppm的洗滌劑組分，因此在拉美使用的洗滌劑可以屬于中等和高洗滌劑濃度二者的范圍。如上提及，巴西洗滌劑在洗滌用水中存在的洗滌劑組分一般為大約1500ppm。然而，并不僅限于拉美國(guó)家，其他高泡磷酸鹽助洗洗滌劑地區(qū)也具有存在于洗滌用水中的高達(dá)約6000ppm洗滌劑組分的高洗滌劑濃度系統(tǒng)。根據(jù)前述，在全世界，洗滌劑組合物在一般洗滌溶液中的濃度變化如下：從小于約800ppm的洗滌劑組合物(“低洗滌劑濃度地區(qū)”)，例如在日本約667ppm，到約800ppm至約2000ppm之間(“中間洗滌劑濃度地區(qū)”)，例如在美國(guó)約975ppm和在巴西約1500ppm，到高于約2000ppm(“高洗滌劑濃度地區(qū)”)，例如在歐洲約4500ppm至約5000ppm和在高泡磷助洗劑地區(qū)約6000ppm。經(jīng)驗(yàn)地確定一般的洗滌溶液的濃度。例如，在美國(guó)，一般的洗衣機(jī)容納約64.4L的洗滌溶液。因此，為了在洗滌溶液中獲得約975ppm的洗滌劑濃度，必須加入約62.79g的洗滌劑組合物到64.4L洗滌溶液中。該量是通過(guò)消費(fèi)者使用洗滌劑提供的測(cè)量杯測(cè)量加入到洗滌用水中的一般量。作為另外的例子，不同的地區(qū)使用不同的洗滌溫度。在日本，洗滌用水的溫度一般低于在歐洲使用的溫度。例如，在北美和日本，洗滌用水的溫度一般為約10℃至約30℃(例如，約20℃)，而在歐洲，洗滌用水的溫度一般為約30℃至約60℃(例如，約40℃)。然而，為了節(jié)約能源，許多消費(fèi)者改為用冷水洗滌。此外，在一些另外的區(qū)域，一般將冷水用于洗衣，以及餐具洗滌應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的“冷水洗滌”指在約10℃至約40℃、或者約10℃至約30℃、或者約15℃至約25℃，以及在約10℃至約40℃的范圍內(nèi)的所有其他組合溫度時(shí)進(jìn)行的洗滌。作為另外的例子，不同地區(qū)一般具有不同的水硬度。水硬度通常描述為每加侖混合的Ca2+/Mg2+的格令量。硬度是在水中測(cè)量的鈣(Ca2+)和鎂(Mg2+)的量。在美國(guó)，大多數(shù)水是硬的，但是硬度的程度不同。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有百萬(wàn)分之60至181(百萬(wàn)分率轉(zhuǎn)變成美國(guó)每加侖格令是ppm#除以17.1等于每加侖格令)的硬礦物質(zhì)。水每加侖的格令百萬(wàn)分率軟少于1.0小于17微硬1.0至3.517至60中等硬3.5至7.060至120硬7.0至10.5120至180非常硬高于10.5大于180歐洲水硬度一般高于每加侖約10.5(例如約10.5至約20.0)格令的混合的Ca2+/Mg2+(例如，每加侖約15格令的混合的Ca2+/Mg2+)。北美水硬度一般高于日本水硬度，但是低于歐洲水硬度。例如，北美水硬度可以在約3格令至約10格令之間、約3格令至約8格令之間或者約6格令。日本水硬度一般低于北美水硬度，通常低于約4格令，例如每加侖約3格令的混合的Ca2+/Mg2+。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在至少一組洗滌條件(例如，水溫、水硬度和/或洗滌劑濃度)下顯示出令人驚奇的洗滌性能的變體蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體蛋白酶與其他枯草桿菌蛋白酶在洗滌性能方面是相當(dāng)?shù)?。在一些?shí)施方案中，與目前市售的枯草桿菌蛋白酶比較，本發(fā)明的變體蛋白酶顯示出增強(qiáng)的洗滌性能。因此，在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文中提供的變體蛋白酶顯示出增強(qiáng)的氧化穩(wěn)定性、增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、在多種條件下增強(qiáng)的清潔能力和/或增強(qiáng)的螯合穩(wěn)定性。此外，本發(fā)明的變體蛋白酶可以單獨(dú)或者與助洗劑和穩(wěn)定劑組合地用于并不含有洗滌劑的清潔組合物中。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，清潔組合物包含按組合物的重量計(jì)約0.00001％至約10％水平的本發(fā)明的至少一種變體蛋白酶和按組合物的重量計(jì)含清潔輔助材料的剩余部分(例如，約99.999％至約90.0％)。在本發(fā)明的其他方面，本發(fā)明的清潔組合物包含按組合物的重量計(jì)約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至2％、約0.005％至約0.5％水平的至少一種變體蛋白酶和含清潔輔助材料的清潔組合物的剩余部分(例如，按重量計(jì)約99.9999％至約90.0％、約99.999％至約98％、約99.995％至約99.5％)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含一種或多種其他洗滌劑酶，其提供了清潔性能和/或織物護(hù)理和/或餐具清洗益處。合適的酶的示例包括但不限于，半纖維素酶、纖維素酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、果膠酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪加氧酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶或它們的混合物。在一些實(shí)施方案中，所用的酶組合物(即，“混合物”)包含常規(guī)使用的酶如蛋白酶、酯肪酶、角質(zhì)酶和/或纖維素酶連同使用的淀粉酶。除本文中提供的蛋白酶變體外，在本發(fā)明的組合物中可以使用任一其他合適的蛋白酶。合適的蛋白酶包括動(dòng)物、植物或微生物來(lái)源的那些蛋白酶。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用微生物蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，包括化學(xué)或遺傳修飾的變體。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選地堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子包括枯草桿菌蛋白酶，特別是衍生自芽孢桿菌屬(Bacillus)的那些枯草桿菌蛋白酶(例如，枯草桿菌蛋白酶、緩慢芽孢桿菌的蛋白酶,解淀粉芽孢桿菌的蛋白酶,枯草桿菌蛋白酶Carlsberg,枯草桿菌蛋白酶309,枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168)。其他例子包括在美國(guó)專(zhuān)利RE34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628中描述的變體蛋白酶，所述全部專(zhuān)利在此處引用作為參考。其他蛋白酶例子包括但不限于，胰蛋白酶(例如，豬或牛來(lái)源的胰蛋白酶)和在WO89/06270所述的鐮孢屬(Fusarium)蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明中使用的市售蛋白酶包括但不限于，MAXACALTM、MAXAPEMTM、EXCELLASETM、PURAFASTTM和OXP(Genencor)；DURAZYMTM、和(Novozymes)；和BLAPTM(HenkelKommanditgesellschaftaufAktien，Duesseldorf，德國(guó))。多種蛋白酶描述于WO95/23221、WO92/21760、U.S.專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文本No.2008/0090747和美國(guó)專(zhuān)利5,801,039、5,340,735、5,500,364、5,855,625、USRE34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628，以及多種其他專(zhuān)利中。在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明中使用的金屬蛋白酶包括但不限于，描述于WO07/044993中的中性金屬蛋白酶。此外，本發(fā)明中可以使用任一合適的脂肪酶。合適的脂肪酶包括但不限于細(xì)菌和真菌來(lái)源的那些脂肪酶。本發(fā)明包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。有用的脂肪酶的示例包括柔毛腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)脂肪酶(參見(jiàn)例如，EP258068和EP305216)、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶(參見(jiàn)例如，EP238023)、假絲酵母(Candida)脂肪酶，例如南極假絲酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如，南極假絲酵母脂肪酶A或南極假絲酵母脂肪酶B；參見(jiàn)例如，EP214761)、假單胞菌屬(Pseudomonas)脂肪酶例如P.alcaligenes脂肪酶和P.pseudoalcaligenes脂肪酶(參見(jiàn)例如，EP218272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)脂肪酶(參見(jiàn)例如，EP331376)、P.stutzeri脂肪酶(參見(jiàn)例如，GB1,372,034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢桿菌屬脂肪酶(例如枯草芽孢桿菌脂肪酶[Dartois等人，Biochem.Biophys.Acta1131：253-260[1993]]；嗜熱脂肪芽孢桿菌脂肪酶[參見(jiàn)例如，JP64/744992]；和B.pumilus脂肪酶[參見(jiàn)例如，WO91/16422])。此外，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中可以使用許多克隆的脂肪酶，包括但不限于沙門(mén)柏干酪青霉(Penicilliumcamembertii)脂肪酶(參見(jiàn)，Yamaguchi等人，Gene103：61-67[1991])、白地霉(Geotricumcandidum)脂肪酶(參見(jiàn)，Schimada等人，J.Biochem.，106：383-388[1989])和多種根霉屬(Rhizopus)脂肪酶例如代氏根霉(R.delemar)脂肪酶(參見(jiàn)，Hass等人，Gene109：117-113[1991])、R.niveus脂肪酶(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.56：716-719[1992])和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中也可以使用其他類(lèi)型的脂解酶例如角質(zhì)酶，包括但不限于，來(lái)源于門(mén)多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)的角質(zhì)酶(參見(jiàn)，WO88/09367)，和來(lái)源于豌豆腐皮鐮孢(Fusariumsolanipisi)的角質(zhì)酶(參見(jiàn)，WO90/09446)。另外的合適脂肪酶包括市售的脂肪酶例如M1LIPASETM、LUMAFASTTM和LIPOMAXTM(Genencor)；和ULTRA(Novozymes)；和LIPASEPTM“Amano”(AmanoPharmaceuticalCo.Ltd.，日本)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，清潔組合物進(jìn)一步包含按組合物的重量計(jì)約0.00001％至約10％的其他脂肪酶水平的脂肪酶和按組合物的重量計(jì)的清潔輔助材料的剩余部分。在本發(fā)明的其他方面，本發(fā)明的清潔組合物也包含按組合物的重量計(jì)約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至2％、約0.005％至約0.5％的脂肪酶水平的脂肪酶。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以使用任一合適的淀粉酶。在一些實(shí)施方案中，也可以使用適合于在堿性溶液中使用的任一淀粉酶(例如，α淀粉酶和/或β淀粉酶)。合適的淀粉酶包括但不限于細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些淀粉酶。在一些實(shí)施方案中包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。在本發(fā)明中使用的淀粉酶包括但不限于，獲自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)的α淀粉酶(參見(jiàn)例如，GB1,296,839)。在本發(fā)明中使用的市售淀粉酶包括但不限于，和BANTM(Novozymes)，以及POWERASETM、和P(Genencor)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物進(jìn)一步包含按組合物的重量計(jì)約0.00001％至約10％的其他淀粉酶水平的淀粉酶和按組合物的重量計(jì)的清潔輔助材料的剩余部分。在本發(fā)明的其他方面，本發(fā)明的清潔組合物也包含按組合物的重量計(jì)約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至2％、約0.005％至約0.5％的淀粉酶水平的淀粉酶。在一些另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物可以使用任一合適的纖維素酶。合適的纖維素酶包括但不限于細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些纖維素酶。在一些實(shí)施方案中包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。合適的纖維素酶包括但不限于特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)纖維素酶(參加例如，美國(guó)專(zhuān)利4,435,307)。特別合適的纖維素酶是具有色彩護(hù)理優(yōu)點(diǎn)的纖維素酶(參見(jiàn)例如，EP0495257)。在本發(fā)明中使用的市售的纖維素酶包括但不限于，(Novozymes)和KAC-500(B)TM(KaoCorporation)。在一些實(shí)施方案中，摻入的纖維素酶為成熟野生型或變體纖維素酶的一部分或者片段，其中氨基端的一部分缺失(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利5,874,276)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物進(jìn)一步包含按組合物的重量計(jì)約0.00001％至約10％水平的其他纖維素酶的纖維素酶和按組合物的重量計(jì)的清潔輔助材料的剩余部分。在本發(fā)明的其他方面，本發(fā)明的清潔組合物也包含按組合物的重量計(jì)約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至約2％、約0.005％至約0.5％的纖維素水平的纖維素酶。適合于在洗滌劑組合物中使用的任一甘露聚糖酶也可以用于本發(fā)明中。合適的甘露聚糖酶包括但不限于細(xì)菌和真菌來(lái)源的那些甘露聚糖酶。在一些實(shí)施方案中包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。在本發(fā)明中使用的多種甘露聚糖酶是已知的(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利6,566,114、美國(guó)專(zhuān)利6,602,842和美國(guó)專(zhuān)利6,440,991，所述全部專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖颂幰米鳛閰⒖?。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物進(jìn)一步包含按組合物的重量計(jì)約0.00001％至約10％的其他甘露聚糖酶水平的甘露聚糖酶和按組合物的重量計(jì)的清潔輔助材料的剩余部分。在本發(fā)明的其他方面，本發(fā)明的清潔組合物也包含按組合物的重量計(jì)約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至2％、約0.005％至約0.5％的甘露聚糖酶水平的甘露聚糖酶。在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的組合物中使用與過(guò)氧化氫或其來(lái)源(例如，過(guò)碳酸鹽、過(guò)硼酸鹽或過(guò)硫酸鹽)組合的過(guò)氧化物酶。在一些備選的實(shí)施方案中，氧化酶與氧組合使用。兩種酶都用于“溶液漂白”(即，當(dāng)織物在洗滌用水中一起洗滌時(shí)，防止織物染料從染色織物向另一織物轉(zhuǎn)移)，優(yōu)選地與增強(qiáng)劑一起使用(參見(jiàn)例如，WO94/12621和WO95/01426)。合適的過(guò)氧化物酶/氧化酶包括但不限于，植物、細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些過(guò)氧化物酶/氧化酶。在一些實(shí)施方案中包括了化學(xué)或遺傳修飾的突變體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物進(jìn)一步包含按組合物的重量計(jì)約0.00001％至約10％的其他過(guò)氧化物酶和/或氧化酶水平的其他過(guò)氧化物酶和/或氧化酶和按組合物的重量計(jì)的清潔輔助材料的剩余部分。在本發(fā)明的其他方面，本發(fā)明的清潔組合物也包含按組合物的重量計(jì)約0.0001％至約10％、約0.001％至約5％、約0.001％至2％、約0.005％至約0.5％的過(guò)氧化物酶和/或氧化酶水平的過(guò)氧化物酶和/或氧化酶。在一些實(shí)施方案中，可以使用的其他酶包括但不限于過(guò)水解酶(perhydrolase)(參見(jiàn)例如，WO05/056782)。此外，在一些具體優(yōu)選的實(shí)施方案中，包括了本文上述酶的混合物，具體是一種或多種其他蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一種纖維素酶。事實(shí)上，考慮在本發(fā)明中使用這些酶的多種混合物。也考慮變體蛋白酶和一種或多種其他酶的不同水平都可以獨(dú)立地變動(dòng)至約10％，清潔組合物的剩余部分是清潔輔助材料。通過(guò)考慮待清潔的表面、物品或者織物，和在使用期間(例如，在清洗洗滌劑使用期間)用于清潔條件的組合物的期望形式可以容易地具體選擇清潔輔助材料。合適的清潔輔助材料的例子包括但不限于，表面活性劑、助洗劑、漂白劑、漂白活性劑、漂白催化劑、其他酶、酶穩(wěn)定系統(tǒng)、螯合劑、熒光增白劑、去污聚合物、染料轉(zhuǎn)移劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、催化材料、過(guò)氧化氫、過(guò)氧化氫的來(lái)源、預(yù)制的過(guò)酸、聚合分散劑、去粘土污漬劑、結(jié)構(gòu)增彈劑、分散劑、抑泡劑、染料、香料、色料、填料鹽、水溶增溶劑、光漂劑、熒光增白劑、衣物柔順劑、織物軟化劑、載體、水溶增溶劑、加工助劑、溶劑、色素、可水解的表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑、抗縮劑、抗皺劑、殺菌劑、殺真菌劑、色斑、silvercare、防晦暗劑和/或防腐蝕劑、堿度來(lái)源、增溶劑、載體、加工助劑、色素和pH控制劑(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，所述全部專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖颂幰胱鳛閰⒖?。以下詳細(xì)地列舉了具體的清潔組合物材料的實(shí)施方案。在清潔組合物中清潔輔助材料與本發(fā)明的變體蛋白酶不兼容的實(shí)施方案中，那么使用保持清潔輔助材料與蛋白酶分離(即相互并不接觸)的合適方法，直到需要將兩種組分組合時(shí)。該分離方法包括本領(lǐng)域已知的任一合適的方法(例如，軟膠囊、膠囊、片劑、物理分離等)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文中提供的一種或多種變體蛋白酶的有效量包含于用于清潔需要去除蛋白質(zhì)污跡的多種表面的組合物中。此類(lèi)清潔組合物包括用于如清潔硬表面、織物和餐具此類(lèi)應(yīng)用的清潔組合物。事實(shí)上，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了織物清潔組合物，而在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了非織物清潔組合物。特別地，本發(fā)明也提供了適合于個(gè)人護(hù)理的清潔組合物，包括口腔護(hù)理(包括dentrifices、牙膏、漱口劑等，以及假牙清潔組合物)、皮膚和頭發(fā)清潔組合物。本發(fā)明意圖包括任一形式(即，液體、顆粒、棒、半固體、凝膠、乳劑、片劑、膠囊等)的洗滌組合物。通過(guò)實(shí)施例的方式，以下更詳細(xì)地描述了使用本發(fā)明的變體蛋白酶的幾種清潔組合物。在一些實(shí)施方案中，其中將本發(fā)明的清潔組合物配制為適合于在洗衣機(jī)洗滌方法中使用的組合物，本發(fā)明的組合物優(yōu)選地含有至少一種表面活性劑和至少一種助洗劑化合物，以及選自有機(jī)聚合化合物、漂白劑、其他酶、抑泡劑、分散劑、石灰皂分散劑、污物懸液和抗再沉淀劑和腐蝕抑制劑的一種或多種清潔輔助材料。在一些實(shí)施方案中，洗衣組合物也含有軟化劑(即，作為其他的清潔輔助材料)。本發(fā)明的組合物也可以用于固體或液體形式的洗滌劑添加產(chǎn)品。此類(lèi)添加劑產(chǎn)品意圖補(bǔ)充和/或增強(qiáng)傳統(tǒng)洗滌組合物的性能，并可以在清潔過(guò)程的任一階段添加。在一些實(shí)施方案中，在20℃測(cè)量的本文中的衣物洗滌組合物的濃度為約400g/升至約1200g/升，而在其他實(shí)施方案中，其為約500g/升至約950g/升。在配制為在人工餐具洗滌方法中使用的組合物的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物優(yōu)選地含有至少一種表面活性劑和優(yōu)選地至少一種選自有機(jī)聚合化合物、增泡劑、第II族金屬離子、溶劑、水溶增溶劑和其他酶的其他清潔助劑材料。在一些實(shí)施方案中，多種清潔組合物例如在美國(guó)專(zhuān)利6,605,458中提供的那些清潔組合物可以與本發(fā)明的變體蛋白酶一起使用。因此，在一些實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的至少一種變體蛋白酶的組合物是緊湊型顆?？椢锴鍧嵔M合物，而在其他實(shí)施方案中，該組合物是在洗滌有色織物中有用的顆?？椢锴鍧嵔M合物，在另外的實(shí)施方案中，該組合物是在洗滌的過(guò)程中提供軟化的顆粒織物清潔組合物，在其他的實(shí)施方案中，該組合物是強(qiáng)效液體織物清潔組合物。在一些實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的至少一種變體蛋白酶的組合物是織物清潔組合物，例如在美國(guó)專(zhuān)利6,610,642和6,376,450中描述的那些織物清潔組合物。此外，本發(fā)明的變體蛋白酶可以用于在歐洲或日本洗滌條件下顆粒衣物洗滌劑組合物的具體用途中(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利6,610,642)。在一些備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本文中提供的至少一種變體蛋白酶的硬表面清潔組合物。因此，在一些實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的至少一種變體蛋白酶的組合物是硬表面清潔組合物，例如描述于美國(guó)專(zhuān)利6,610,642、6,376,450和6,376,450中的那些硬表面清潔組合物。又在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本文中提供的至少一種變體蛋白酶的餐具洗滌組合物。因此，在一些實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的至少一種變體蛋白酶的組合物是硬表面清潔組合物，例如在美國(guó)專(zhuān)利6,610,642和6,376,450中的那些硬表面清潔組合物。仍在一些另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本文中提供的至少一種變體蛋白酶的餐具洗滌組合物。在一些另外的實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的至少一種變體蛋白酶的組合物包含口腔護(hù)理組合物，例如那些在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)6,376,450和6,376,450中的那些口腔護(hù)理組合物。包含在前述美國(guó)專(zhuān)利6,376,450、6,605,458、6,605,458和6,610,642中的化合物和清潔輔助材料的配方和說(shuō)明書(shū)可與本文中提供的變體蛋白酶一起使用。本發(fā)明的清潔組合物可以配制成任一合適的形式并通過(guò)由制造者選擇的任一方法制備，所述方法的非限制性示例描述于美國(guó)專(zhuān)利5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,422、5,516,448、5,489,392和5,486,303中，所述全部專(zhuān)利在此處引入作為參考。當(dāng)需要低pH清潔組合物時(shí)，通過(guò)添加材料例如單乙醇胺或者酸性物質(zhì)例如HCl調(diào)節(jié)此類(lèi)組合物的pH。雖然實(shí)質(zhì)上并非是本發(fā)明的目的，但是在下文中說(shuō)明的輔助物的非限制性列表適合于在速溶清潔組合物中使用。在一些實(shí)施方案中，將這些輔助物摻入，例如以輔助或者增強(qiáng)清潔性能、用于處理待清潔的底物或者以修飾清潔組合物的美學(xué)感官(如在使用香料、染料、色料等的情況時(shí))。應(yīng)當(dāng)理解，此類(lèi)輔助物是在除本發(fā)明的變體蛋白酶之外而添加的。這些添加組分的精確性質(zhì)和其摻入的水平取決于組合物的物理形式和將使用其的清潔操作的性質(zhì)。合適的輔助物材料包括但不限于，表面活性劑、助洗劑、螯合劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、沉積助劑、分散劑、其他的酶和酶穩(wěn)定劑、催化材料、漂白活性劑、漂白加強(qiáng)劑、過(guò)氧化氫、過(guò)氧化氫的來(lái)源、預(yù)制的過(guò)酸、聚合的分散劑、去粘土污漬/抗再沉積劑、增白劑、抑泡劑、染料、香料、結(jié)構(gòu)增彈劑、織物軟化劑、載體、水溶增溶劑、加工助劑和/或色素。除以下的公開(kāi)外，此類(lèi)其他輔助物的合適示例和使用的水平見(jiàn)于引用作為參考的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)5,576,282、6,306,812和6,326,348。上述的輔助成分可以構(gòu)成本發(fā)明的清潔組合物的余量。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的清潔組合物包含至少一種表面活性劑和/或表面活性劑系統(tǒng)，其中該表面活性劑選自非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、兩性表面活性劑、兼性離子表面活性劑、半極性非離子表面活性劑和它們的混合物。在一些低pH清潔組合物實(shí)施方案中(例如，具有約3至約5的凈pH的組合物)，該組合物一般并不含有烷基乙氧基化硫酸鹽，因?yàn)檎J(rèn)為此類(lèi)表面活性劑可能被該組合物的酸性物質(zhì)水解。在一些實(shí)施方案中，該表面活性劑按清潔組合物的重量計(jì)為約0.1％至約60％的水平存在，而在備選的實(shí)施方案中，該水平為約1％至約50％，而仍在另外的實(shí)施方案中，該水平為約5％至約40％。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含一種或多種洗滌劑助洗劑或助洗劑系統(tǒng)。在一些摻入至少一種助洗劑的實(shí)施方案中，清潔組合物包含按清潔組合物的重量計(jì)的至少約1％、約3％至約60％或者甚至約5％至約40％的助洗劑。助洗劑包括但不限于，多磷酸鹽的堿金屬鹽、銨鹽和鏈烷醇銨鹽、堿金屬硅酸鹽、堿土金屬碳酸鹽和堿金屬碳酸鹽、鋁硅酸鹽、聚羧酸酯化合物、羥基聚羧酸酯醚、馬來(lái)酸酐與乙烯或者乙烯甲基醚的共聚物、1,3,5-三羥基苯-2,4,6-三磺酸和羧基甲氧基琥珀酸(carboxymethyloxysuccinicacid)、聚乙酸的多種堿金屬鹽、銨鹽和取代的銨鹽例如乙二胺四乙酸和氨三乙酸，以及聚羧酸鹽例如苯六甲酸、琥珀酸、檸檬酸、氧聯(lián)琥珀酸、聚馬來(lái)酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸和它們的可溶性鹽。事實(shí)上，考慮在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中使用任一合適的助洗劑。在一些實(shí)施方案中，助洗劑形成水溶性硬度離子復(fù)合物(hardnessioncomplex)(例如，多價(jià)螯合的助洗劑)，例如檸檬酸鹽和聚磷酸鹽(例如，三聚磷酸鈉和三聚磷酸鈉六水合物、三聚磷酸鉀以及混合的三聚磷酸鈉和三聚磷酸鉀等)?？紤]在本發(fā)明中使用任一合適的助洗劑，包括本領(lǐng)域已知的那些助洗劑(參見(jiàn)例如，EP2100949)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含至少一種螯合劑。合適的螯合劑包括但不限于，銅、鐵和/或錳螯合劑和它們的混合物。在使用至少一種螯合劑的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含占受試清潔組合物的重量計(jì)的約0.1至約15％或者甚至約3.0％至約10％的螯合劑。仍在一些實(shí)施方案中，本文中提供的清潔組合物包含至少一種沉積助劑。合適的沉積助劑包括但不限于，聚乙二醇、聚丙二醇、多羧酸酯、去污聚合物例如polytelephthalicacid，粘土例如高嶺石、蒙脫土、凹凸棒石黏土(atapulgite)、伊利石、膨潤(rùn)土、埃洛石石和它們的混合物。如在本文中所指，在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中可以使用抗再沉積劑。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用非離子表面活性劑。例如，在自動(dòng)餐具洗滌實(shí)施方案中，非離子表面活性劑可以用于表面修飾目的，特別是對(duì)于表面(sheeting)，以避免薄膜形成和起斑并改善光澤。這些非離子表面活性劑也可以用于預(yù)防污漬的再沉積。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗再沉積劑是本領(lǐng)域已知的非離子表面活性劑(參見(jiàn)例如，EP2100949)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含一種或多種染料轉(zhuǎn)移抑制劑。合適的聚合型染料轉(zhuǎn)移抑制劑包括但不限于，聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮(polyvinyloxazolidone)和聚乙烯咪唑或者它們的混合物。在使用了至少一種染料轉(zhuǎn)移抑制劑的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含按清潔組合物重量計(jì)約0.0001％至約10％、約0.01％至約5％或者甚至約0.1％至約3％的染料轉(zhuǎn)移抑制劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物內(nèi)包含硅酸鹽。在一些此類(lèi)實(shí)施方案中，可以使用硅酸鈉(例如，二硅酸鈉、偏硅酸鈉和晶體層狀硅酸鹽)。在一些實(shí)施方案中，硅酸鹽以約1％至約20％的水平存在。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，硅酸鹽按組合物的重量計(jì)以約5％至約15％的水平存在。仍在一些其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物也含有分散劑。合適的水溶性有機(jī)材料包括但不限于，同或共聚合物酸或者它們的鹽，其中多聚羧酸包含至少兩個(gè)羧基，通過(guò)不多于2個(gè)的碳原子將所述羧基彼此分離。在一些另外的實(shí)施方案中，在清潔組合物中使用的酶通過(guò)任何合適的技術(shù)穩(wěn)定。在一些實(shí)施方案中，本文中使用的酶通過(guò)最終組合物中存在的鈣和/鎂離子的水溶性來(lái)源而穩(wěn)定，所述最終組合物提供此類(lèi)離子給酶。在一些實(shí)施方案中，酶穩(wěn)定劑包括寡糖、多糖和無(wú)機(jī)二價(jià)金屬鹽包括堿土金屬鹽，例如鈣鹽。本發(fā)明中可以使用多種用于酶穩(wěn)定的技術(shù)。例如，在一些實(shí)施方案中，本文中使用的酶通過(guò)在最終組合物中存在鋅(II)、鈣(II)和/鎂(II)離子的水溶性來(lái)源，以及其他金屬離子(例如，鋇(II)、鈧(II)、鐵(II)、錳(II)、鋁(III)、錫(II)、鈷(II)、銅(II)、鎳(II)和氧化釩(oxovanadium(IV))而得到穩(wěn)定，所述最終組合物提供此類(lèi)離子給酶。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中也可以使用氯化物和硫酸鹽。合適的寡糖和多糖(例如，糊精)的示例是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如，WO07/145964)。在一些實(shí)施方案中，也可以使用可逆的蛋白酶抑制劑，例如含硼的化合物(例如，硼酸鹽、4-甲酰苯基硼酸)和/或如所希望地，使用三肽醛進(jìn)一步改善穩(wěn)定性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物中存在漂白劑、漂白活性劑和/或漂白催化劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含無(wú)機(jī)和/有機(jī)漂白化合物。無(wú)機(jī)漂白劑包括但不限于，過(guò)氧化氫合物鹽(例如，過(guò)硼酸鹽、過(guò)碳酸鹽、過(guò)磷酸鹽、過(guò)硫酸鹽和過(guò)硅酸鹽)。在一些實(shí)施方案中，無(wú)機(jī)過(guò)氧化氫合物鹽是堿金屬鹽。在一些實(shí)施方案中，包含沒(méi)有其他保護(hù)的結(jié)晶性固體的無(wú)機(jī)過(guò)氧化氫合物鹽，而在一些其他實(shí)施方案中，該鹽是包被的。可以在本發(fā)明中使用本領(lǐng)域已知的任何合適鹽(參見(jiàn)例如，EP2100949)。在一些實(shí)施方案中，將漂白活性劑用于本發(fā)明的組合物中。漂白活性劑一般是在60℃或更低溫度的清潔期間增強(qiáng)漂白作用的有機(jī)過(guò)酸前體。適合于在本文中使用的漂白活性劑包括在過(guò)水解(perhydrolysis)條件下提供脂肪族過(guò)氧化羧酸(aliphaicperoxoycarboxylicacid)和/或任選地經(jīng)取代的過(guò)苯甲酸的化合物，其中脂肪族過(guò)氧化羧酸具有優(yōu)選的約1個(gè)至約10個(gè)碳原子、特別是約2個(gè)至約4個(gè)碳原子。其他漂白活性劑是本領(lǐng)域已知的并可以適用于本發(fā)明中(參見(jiàn)例如，EP2100949)。此外，在一些實(shí)施方案中和如本文中進(jìn)一步所述，本發(fā)明的清潔組合物進(jìn)一步包含至少一種漂白催化劑。在一些實(shí)施方案中，可以使用三氮雜環(huán)壬烷錳和相關(guān)的絡(luò)合物，以及鈷、銅、錳和鐵絡(luò)合物。在本發(fā)明中可以使用其他漂白催化劑(參加例如，美國(guó)4,246,612、5,227,084、4,810410、WO99/06521和EP2100949)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物含有一種或多種催化金屬?gòu)?fù)合物。在一些實(shí)施方案中，可以使用含金屬的漂白催化劑。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用包含催化系統(tǒng)的金屬漂白催化劑，所述催化系統(tǒng)包含確定了漂白催化活性的過(guò)渡金屬陽(yáng)離子(例如，銅、鐵、鈦、釕、鎢、鉬或錳陽(yáng)離子)、具有極少或者沒(méi)有漂白催化活性的輔助金屬陽(yáng)離子(例如，鋅或鋁陽(yáng)離子)和具有針對(duì)催化性和輔助性金屬陽(yáng)離子的定義了穩(wěn)定常數(shù)的螯合劑(sequestrate)，特別是乙二胺四乙酸、乙二胺四甲叉膦酸(亞甲基膦酸)和它們的水溶性鹽(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)4,430,243)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物通過(guò)錳化合物催化。使用的此類(lèi)化合物及其水平是本領(lǐng)域熟知的(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)5,576,282)。在其他的實(shí)施方案中，可以在本發(fā)明的清潔組合物中使用鈷漂白催化劑。多種鈷漂白催化劑是本領(lǐng)域已知的(參加例如，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)5,597,936和5,595,967)并可以通過(guò)已知的方法容易地制備。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含巨多環(huán)剛性配體(MRL)的過(guò)渡金屬絡(luò)合物。作為實(shí)施的方式，并不以限制的方式，在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)由本發(fā)明提供的組合物和清潔方法以在含水洗滌介質(zhì)中提供至少億萬(wàn)分之一級(jí)別的活性MRL種類(lèi)，并且在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在溶液中提供約0.005ppm至約25ppm，更優(yōu)選地約0.05ppm至約10ppm，和最優(yōu)選地約0.1ppm至約5ppm的MRL。在速溶過(guò)渡金屬漂白催化劑中優(yōu)選的過(guò)渡金屬包括但不限于，錳、鐵和鉻。優(yōu)選的MRL也包括但不限于，交聯(lián)的特異超剛性配體(例如，5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]正十六烷)?？梢酝ㄟ^(guò)已知的方法(參見(jiàn)例如，WO2000/32601和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)6,225,464)容易地制備合適的過(guò)渡金屬M(fèi)RL。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含金屬護(hù)理劑。金屬護(hù)理劑用于預(yù)防和/或降低金屬，包括鋁、不銹鋼和非鐵類(lèi)金屬(例如，銀和銅)的銹蝕、腐蝕和/或氧化。合適的金屬護(hù)理劑包括描述于EP2100949、WO9426860和WO94/26859中的那些金屬護(hù)理劑。在一些實(shí)施方案中，金屬護(hù)理劑是鋅鹽。在一些另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的清潔組合物包含按重量計(jì)約0.1％至約5％的一種或多種金屬護(hù)理劑。如上所指出，本發(fā)明的清潔組合物可以配制成任一合適的形式，并可以通過(guò)由配制者選擇的任一方法制備，所述方法的非限制性示例描述于美國(guó)專(zhuān)利5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,516,448、5,489,392、和5,486,303，所述全部專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖颂幰胱鳛閰⒖?。在其中需要低pH清潔組合物的一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)添加酸性物質(zhì)例如HCl調(diào)節(jié)此種組合物的pH。本文中公開(kāi)的清潔組合物可以用于清潔物品(situs)(例如，表面、餐具或織物)。一般而言，該物品的至少一部分與以純品形式或者稀釋于洗滌用水中的本發(fā)明清潔組合物的實(shí)施方案接觸，并然后任選地洗滌和/或漂洗該物品。對(duì)于本發(fā)明的目的，“洗滌”包括但不限于，擦洗和機(jī)械攪拌。在一些實(shí)施方案中，該清潔組合物在溶液中一般以約500ppm至約15,000ppm的濃度使用。當(dāng)洗滌溶液是水時(shí)，水溫一般為約5℃至約90℃的范圍，并當(dāng)物品包含織物時(shí)，水與織物質(zhì)量比率一般為約1:1至約30:1。實(shí)驗(yàn)提供以下實(shí)施例以說(shuō)明并進(jìn)一步闡明本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方案和方面，并不應(yīng)解釋為限制其范圍。在以下公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)中，使用以下縮寫(xiě)：℃(攝氏度)；rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)；H2O(水)；HCl(鹽酸)；aa和AA(氨基酸)；bp(堿基對(duì))；kb(千堿基對(duì))；kD(千道爾頓)；gm(克)；μg和ug(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；μl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(納米)；μm和um(微米)；M(體積摩爾濃度的)；mM(毫摩爾)；μM和uM(微摩爾)；U(單位)；V(電壓)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分鐘)；hr(小時(shí))；MgCl2(氯化鎂)；NaCl(氯化鈉)；OD280(280nm處光密度)；OD405(405nm處光密度)；OD600(600nm處光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸鹽緩沖鹽水[150mMNaCl、10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2])；LAS(十二烷基磺酸鈉)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris(三(羥甲基)胺基甲烷)；TAED(N,N,N’N’-四乙酰乙二胺)；BES(聚酯砜(polyesstersulfone))；MES(2-嗎啉代乙磺酸,一水合物；f.w.195.24；Sigma#M-3671)；CaCl2(氯化鈣,無(wú)水的；f.w.110.99；Sigma#C-4901)；SRI(去污指數(shù)),BMI(血乳墨)和BMIPI(血乳墨性能指數(shù)),TCA(三氯乙酸)和TCAPI(三氯乙酸性能指數(shù))。此外，材料獲自以下的一些機(jī)構(gòu)：TIGR(TheInstituteforGenomicResearch，Rockville，MD)；AATCC(AmericanAssociationofTextileandColoringChemists)；Amersham(AmershamLifeScience，Inc.ArlingtonHeights，IL)；Corning(CorningInternational，Corning，NY)；ICN(ICNPharmaceuticals，Inc.，CostaMesa，CA)；Pierce(PierceBiotechnology，Rockford，IL)；Equest(Equest，WarwickInternationalGroup，Inc.，F(xiàn)lintshire，UK)；EMPA(EidgenossischeMaterialPrufungsundVersuchAnstalt，St.Gallen，Switzerland)；CFT(CenterforTestMaterials，Vlaardingen，TheNetherlands)；Amicon(Amicon，Inc.，Beverly，MA)；ATCC(AmericanTypeCultureCollection，Manassas，VA)；BectonDickinson(BectonDickinsonLabware，LincolnPark，NJ)；Perkin-Elmer(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)；Rainin(RaininInstrument，LLC，Woburn，MA)；Eppendorf(EppendorfAG，Hamburg，Germany)；Waters(Waters，Inc.，Milford，MA)；Geneart(GeneartGmbH，Regensburg，Germany)；PerseptiveBiosystems(PerseptiveBiosystems，Ramsey，MN)；MolecularProbes(MolecularProbes，Eugene，OR)；BioRad(BioRad，Richmond，CA)；Clontech(CLONTECHLaboratories，PaloAlto，CA)；Cargill(Cargill，Inc.，Minneapolis，MN)；Difco(DifcoLaboratories，Detroit，MI)；GIBCOBRL或GibcoBRL(LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)；NewBrunswick(NewBrunswickScientificCompany，Inc.，Edison，NJ)；Thermoelectron(ThermoelectronCorp.，Waltham，MA)；BMG(BMGLabtech，GmbH，Offenburg，Germany)；Greiner(GreinerBio-One，Kremsmuenster，Austria)；Novagen(Novagen，Inc.，Madison，WI)；Novex(Novex，SanDiego，CA)；Finnzymes(FinnzymesOY，F(xiàn)inland)Qiagen(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)；Invitrogen(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA)；Sigma(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)；DuPontInstruments(Asheville，NY)；GlobalMedicalInstrumentation或GMI(GlobalMedicalInstrumentation；Ramsey，MN)；MJResearch(MJResearch，Waltham，MA)；Infors(InforsAG，Bottmingen，Switzerland)；Stratagene(StratageneCloningSystems，LaJolla，CA)；Roche(HoffmannLaRoche，Inc.，Nutley，NJ)；Agilent(AgilentTechnologies，PaloAlto，CA)；Merck(Merck&Co.，Rahway，NJ)；IonBeamAnalysisLaboratory(IonBeanAnalysisLaboratory，TheUniversityofSurreyIonBeamCentre(Guildford，UK)；TOM(Terg-o-Meter)；BMI(血漬、乳漬、墨漬)；BaChem(BaChemAG，Bubendorf，Switzerland)；MolecularDevices(MolecularDevices，Inc.，Sunnyvale，CA)；Corning(CorningInternational，Corning，NY)；MicroCal(Microcal，Inc.，Northhampton，MA)；ChemicalComputing(ChemicalComputingCorp.，Montreal，Canada)；NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)；Beckman(Beckman-Coulter，F(xiàn)ullerton，CA)；SeitzSchenk(SeitzSchenkFiltersystemsGmbH，BadKreuznach，Germany)；Pall(PallCorp.，EastHills，NY)；MalvernInstruments(MalvernInstruments，Inc.，Worcestershire，UK)，DNA2.0(MenloPark，CA)，MolecularDevices(Sunnyvale，CA)，Costar(Cambridge，MA).實(shí)施例1測(cè)定法在以下的實(shí)施例中，為了便于閱讀，如下所述地使用多種測(cè)定法。標(biāo)出了以下提供的方法的任一差別。A.在96空微滴定板中用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定的TCA測(cè)定法對(duì)于FNA(例如，親本蛋白酶)和其突變體，使用來(lái)自在33℃、230轉(zhuǎn)/分鐘搖蕩并加濕通風(fēng)生長(zhǎng)于微滴定板3-4天的過(guò)濾培養(yǎng)上清開(kāi)始該測(cè)定。將新的96孔平底微滴定板(MTP)用于測(cè)定。首先，在每孔中放入100μL/孔的0.25NHCl。然后加入50μL的過(guò)濾培養(yǎng)液。然后在405nm處(在平板讀取器中使用5秒混合模式)測(cè)定光散射/吸收，以提供“空白”讀數(shù)。對(duì)于該測(cè)試，將100μL/孔的15％(w/v)三氯乙酸(TCA)放入板中，并室溫溫育5至30分鐘。然后在405nm處(在平板讀取器中使用5秒混合模式)測(cè)定光散射/吸收。對(duì)于GG36(例如，親本蛋白酶)和其突變體，使用來(lái)自在37℃、300轉(zhuǎn)/分鐘搖蕩并加濕通風(fēng)生長(zhǎng)于微滴定板約3天的過(guò)濾培養(yǎng)上清進(jìn)行該測(cè)定。在該測(cè)定中，將100μL的0.25MHCl溶液加入到96孔平底微滴定板的每一孔中。隨后，向每孔加入25μL等分的過(guò)濾培養(yǎng)上清(含蛋白酶)。然后在405nm處(在平板讀取器中使用5秒混合模式)測(cè)定光散射/吸收，以提供“空白”讀數(shù)。在該測(cè)量后，將100μL/孔的30％(w/v)TCA溶液加入每孔，并將微滴定板室溫溫育5至15分鐘。最后，在405nm處(在平板讀取器中使用5秒混合模式)測(cè)定最終的光散射/吸收。使用的設(shè)備是BiomekFXRobot(BeckmanCoulter)和SpectraMAX(340型；MolecularDevices)MTPReader；MTP來(lái)自Costar(9017型)。使用的設(shè)備是BiomekFXRobot(BeckmanCoulter)和SpectraMAX340型(MolecularDevices)MTPReader；和MTP是9017型(Costar)。通過(guò)從含TCA的測(cè)試讀數(shù)中減去空白(無(wú)TCA)進(jìn)行計(jì)算以提供樣品中蛋白質(zhì)含量的相對(duì)測(cè)量。如需要，可以通過(guò)用具有已知轉(zhuǎn)變因子的克隆的AAPF測(cè)定校正TCA讀數(shù)來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。然而，就蛋白酶濃度為每毫升50至500微克(ppm)的蛋白質(zhì)而言，TCA結(jié)果是線性的，并因此為了選擇良好性能的變體，可以直接針對(duì)酶性能作圖。在樣品中渾濁度/光散射的增加與培養(yǎng)上清中可沉淀蛋白質(zhì)的總量相關(guān)。B.清潔性能測(cè)定在市售的2XCold洗滌劑中、在微滴定板(MTP)規(guī)模上測(cè)定提到的絲氨酸蛋白酶和其變體在微塊布樣上的去污性能。將確定缺少蛋白酶活性的熱滅活2XCold(成品洗滌劑)用于該測(cè)定。將熱滅活的購(gòu)買(mǎi)的洗滌劑用于破壞任一蛋白質(zhì)組分的酶活性，但保留非酶組分的特性。因此，該方法適合于制備用于在測(cè)試本發(fā)明的酶變體中使用的商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的洗滌劑。使用的試劑為：5mMHEPES，pH8.0或5mMMOPS，pH7緩沖液、3:1Ca：Mg的介質(zhì)水硬度(CaCl2：MgCl2·6H2O)；稀釋成6gpg的每加侖15000格令(gpg)儲(chǔ)液。每孔使用由CFT處理的兩塊EMPA-116BMI(血漬/乳漬/墨漬)棉花布料樣品。將微布料樣品室溫在去離子水中預(yù)洗滌20分鐘。預(yù)洗滌步驟后，將布料樣本置于紙巾上面干燥。然后，在沖壓(expulsionpress下)使用1/4”圓沖模將風(fēng)干的布料樣品沖孔。最后，將兩塊微布料樣品垂直地放入96孔MTP的每一孔中以暴露全部表面區(qū)域(即，并不是平放在孔的底部)。工作洗滌劑溶液顯示于表1-1中。將溫箱設(shè)定為16℃。將來(lái)自主稀釋平板的～10ppm酶的10μL樣品加入具有上文列出的190μL工作洗滌劑溶液的BMI2-布料樣品板中。將測(cè)定板中的體積調(diào)節(jié)到變體的終濃度為0.5ppm。立即將平板轉(zhuǎn)移到iEMS溫箱/震蕩器(Thermo/Labsystems)；并在給定的溫度1400轉(zhuǎn)/分鐘搖蕩溫育30分鐘。溫育后，將100μL的上清轉(zhuǎn)移到新96孔板(將Costar9017型用于溫育后讀取反應(yīng)平板)中，并在405nm和/或600nm處在SpectraMAXMTPReader(340型；MolecularDevices)中測(cè)量吸收率。測(cè)試中也包括含有2塊微布料樣品和沒(méi)有添加蛋白酶樣品的洗滌劑的對(duì)照孔。405nm處的測(cè)量提供了更高的值并追蹤了色素去除，而在600nm處的測(cè)量追蹤了渾濁度和清潔。在該測(cè)定中，蛋白酶水解底物并從底物中釋放色素和不溶性顆粒。因此，渾濁度的速率是酶活性的測(cè)量。計(jì)算去污活性將獲得的吸光度值用空白值(沒(méi)有酶的底物)校正，以提供水解活性的測(cè)量。對(duì)每一樣品(變體)，計(jì)算性能指數(shù)。在相同的蛋白質(zhì)濃度比較變體(實(shí)際值)和標(biāo)準(zhǔn)酶(理論值)的性能的性能指數(shù)。此外，可以使用標(biāo)準(zhǔn)酶的Langmuir等式的參數(shù)計(jì)算理論值。性能指數(shù)在相同蛋白質(zhì)濃度比較變體(實(shí)際值)和親本蛋白酶(理論值)的性能的性能指數(shù)。此外，使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶的結(jié)合曲線(即，Langmuir等式)的參數(shù)可以計(jì)算理論值。對(duì)于至少一種特性具有值>0.5的性能指數(shù)(PI)鑒定了包含至少一種突變的變體，所述突變可以與一種或多種突變組合以產(chǎn)生具有一種或多種目的特性的合適的性能指標(biāo)的蛋白質(zhì)，該一種或多種目的特性不同于測(cè)量的PI值>0.5的目的特性，或者是除測(cè)量的PI值>0.5的目的特性之外的特性。實(shí)施例2枯草芽孢桿菌GG36枯草桿菌蛋白酶變體在該實(shí)施例中，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以在所述的枯草芽孢桿菌中產(chǎn)生GG36(也在本文中稱(chēng)為遲緩芽胞桿菌枯草桿菌蛋白酶)。如本領(lǐng)域已知進(jìn)行轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如，WO02/14490)。在枯草芽孢桿菌中產(chǎn)生GG36蛋白酶使用在共有aprE啟動(dòng)子和BPN’轉(zhuǎn)錄終止予的控制下，與aprE信號(hào)序列的笫8個(gè)密碼子融合的GG36密碼予改進(jìn)的基因構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pAC-GG36ci。在以下提供的序列(SEQIDNO：2)中，黑字體和斜字體表示共有aprE啟動(dòng)子，標(biāo)準(zhǔn)字體表示信號(hào)序列，下劃線字體表示前序列，且黑字體表示編碼GG36成熟蛋白酶的DNA，并且下劃線斜字體表示BPN’終止子。用于克隆的KpnI和XhoI限制位點(diǎn)位于編碼GG36成熟區(qū)的DNA序列(SEQIDNO：4)的側(cè)翼(參見(jiàn)圖4)。atctcaaaaaaatgggtctactaaaatattactccatctattataataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcattgctgatttctgttgcttttagctcatccatcgcatccgctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagttgaggcaaatgacgaggtaαccattctctctaaggaagaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttctgtccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgttagagctcgatccagctatttcttatattgaagaggatgcagaagtaactacaatggcgcaatcggtaccatggggaattagcagagtacaagccccagctgcacataaccgtggattgacaggttctggtgtaaaagttgctgtccttgataccggtatttccactcatccagacttaaatattcgtggtggagctagctttgtaccaggggaaccatccactcaagatggcaatggacatggcactcatgttgccggcacaatcgcggctcttaacaattcaattggtgttcttggcgtagcgccaagcgcagaactatacgctgttaaagtattaggagcaagcggttcaggctctgtcagctctattgcccaaggattggaatgggcagggaacaatggcatgcacgttgctaatcttagtttaggatctccttcgccaagtgccacacttgagcaagctgttaatagcgcgacttctagaggcgttcttgttgtagcggcctctggaaattcaggtgcaggctcaatcagctatccggcccgttatgcgaacgctatggcagtcggagctactgaccaaaacaacaaccgcgccagcttttcacagtatggcgcagggcttgacattgtcgcaccaggtgtaaacgtgcagagcacttacccaggttcaacatatgccagcttaaacggtacatcaatggctactcctcatgttgcaggtgcggctgcacttgttaaacaaaagaacccatcttggtccaatgtacaaatccgcaatcatcttaagaatacggcaactagcttaggaagcacaaacttgtatggaagcggacttgtcaatgcagaagctgcaactcgttaaaagcttaactcgagataaaaaaccggccttggccccgccggttttttat(SEQIDNO：2)用于在枯草芽孢桿菌中表達(dá)GG36蛋白酶的質(zhì)粒pAC-GG36ci顯示于圖4中。質(zhì)粒元件如下：pUB110＝來(lái)自質(zhì)粒pUB110的DNA片段[McKenzieT.，HoshinoT.，TanakaT.，SueokaN.(1986)pUB110的核苷酸序列：與復(fù)制和其調(diào)節(jié)有關(guān)的一些突出特性(TheNucleotideSequenceofpUB110：SomeSalientFeaturesinRelationtoReplicationandItsRegulation)。Plasmid15：93-103]，pBR322＝來(lái)自質(zhì)粒pBR322的DNA片段[BolivarF，RodriguezRL，GreenePJ，BetlachMC，HeynekerHL，BoyerHW。(1977)新載體II的構(gòu)建和表征。多目的克隆系統(tǒng)(Constructionandcharacterizationofnewcloningvehicles.II.Amultipurposecloningsystem)。Gene2：95-113]，pC194＝來(lái)自質(zhì)粒pC194的DNA片段[HorinouchiS.，WeisblumB。(1982)pC194的核苷酸序列和功能圖，特異誘導(dǎo)氯霉素抗性的質(zhì)粒(NucleotidesequenceandfunctionalmapofpC194，aplasmidthatspecifiesinduciblechloramphenicolresistance)，J.Bacteriol150：815-825]。質(zhì)粒特征如下：枯草芽孢桿菌的Ori＝來(lái)自pUB110的復(fù)制原點(diǎn)，CAT＝來(lái)自pC194的氯霉素抗性基因，pMB1復(fù)制原點(diǎn)＝來(lái)自pBR322的復(fù)制原點(diǎn)，bla＝來(lái)自pBR322的β-內(nèi)酰胺酶，短aprE啟動(dòng)予＝共有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，信號(hào)肽＝信號(hào)肽，前肽＝GG36前區(qū)域，GG36ci成熟肽＝成熟GG36(被在本研究中表達(dá)的每一變體的編碼區(qū)替代)，BPN’終止子＝來(lái)自枯草桿菌蛋白酶BPN’的轉(zhuǎn)錄終止子。以下提供了GG36前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQIDNO：3)。在該序列中，黑體表示成熟GG36蛋白酶(野生型)，其也提供為SEQIDNO：4：MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR*(SEQIDNO：3)AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR*(SEQIDNO：4)遲緩芽胞桿菌枯草桿菌蛋白酶(＝GG36)組合電荷/疏水性文庫(kù)(CCHL)的設(shè)計(jì)和產(chǎn)生通過(guò)鑒定7種均勻分布的、表面暴露的氨基酸來(lái)設(shè)計(jì)遲緩芽胞桿菌枯草桿菌蛋白酶組合的電荷/疏水性文庫(kù)(CCHL)。這些殘基是S24、R45、S101、Q109、G118、T213和L217。替換位置的編號(hào)對(duì)應(yīng)于在BPN’枯草桿菌蛋白酶中編號(hào)的位置(BPN’編號(hào)；圖1)。如表2-1顯示，通過(guò)在每一位置處進(jìn)行可能的四種組合：野生型，谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、亮氨酸(L)和精氨酸(R)，產(chǎn)生了33個(gè)成員的組合疏水性文庫(kù)(GH2-GH33)。含有密碼子改進(jìn)的GG36基因的pAC-GG36ci質(zhì)粒發(fā)送到DNA2.0Inc.(MenloPark，CA)用于產(chǎn)生CHL。將枯草芽孢桿菌菌株(基因型：ΔaprE、ΔnprE、ΔspoIIE：amyE::xylRPxylAcomK-phleo)提供為用于轉(zhuǎn)化編碼GG36變體枯草桿菌蛋白酶的DNA的宿主菌株。變體提供為在96孔板中的甘油儲(chǔ)備物。表2-2顯示了在GG36中進(jìn)行的替換以產(chǎn)生的變體。表2-1也提供了變體GG36和野生型之間的凈電荷和疏水性的差異。蛋白酶變體的表達(dá)用鋼制96孔復(fù)制器將來(lái)自甘油儲(chǔ)備物的克隆加到含有200μl的LB培養(yǎng)基+25μg/ml氯霉素的96孔培養(yǎng)板(BD，353075)中，復(fù)制含有GG36或FNA表達(dá)載體的枯草芽孢桿菌克隆，并37℃在濕潤(rùn)的環(huán)境中220轉(zhuǎn)/分鐘生長(zhǎng)過(guò)夜。將200μl過(guò)夜培養(yǎng)物接種在5ml塑料搖管中的2000μl確定成分培養(yǎng)基+25μg/ml氯霉素中。該培養(yǎng)基富含基于MOP緩沖液的半確定成分培養(yǎng)基，其用尿素作為主要的氮源，葡萄糖作為主要的碳源，并補(bǔ)充了1％大豆蛋白胨用于增強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)。將搖管在37℃、220轉(zhuǎn)/分鐘溫育60小時(shí)。60小時(shí)后，將上清在大于8000×RCF的離心機(jī)中離心。將溶液倒入15ml聚丙烯圓錐管中儲(chǔ)存。不再進(jìn)行另外的純化或濃縮。為了長(zhǎng)期穩(wěn)定性，將上清儲(chǔ)備物配制為40％丙二醇儲(chǔ)備物并儲(chǔ)存于4℃。實(shí)施例3枯草芽孢桿菌FNA枯草桿菌蛋白酶變體在枯草芽孢桿菌中產(chǎn)生FNA蛋白酶在該實(shí)施例中，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以在所述的枯草芽孢桿菌中產(chǎn)生FNA(也在本文中稱(chēng)為枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’-Y217L(＝FNA))。如本領(lǐng)域已知進(jìn)行轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如，WO02/14490)。使用在共有aprE啟動(dòng)子和BPN’轉(zhuǎn)錄終止予的控制下，與aprE信號(hào)序列的第8個(gè)密碼子融合的FNA基因構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pAC-FNAre。在以下提供的序列(SEQIDNO：5)中，黑字體和斜字體表示共有aprE啟動(dòng)子，標(biāo)準(zhǔn)字體表示信號(hào)序列，下劃線字體表示前序列，且黑字體表示編碼FNA成熟蛋白酶的DNA，并且下劃線斜字體表示BPN’終止子。FNA成熟區(qū)含有用于克隆的KpnI和XhoI限制位點(diǎn)(參見(jiàn)圖5)。gaattcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattataataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgagaagcaaaaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttcggcagcacatccagcgcgcaggctgcagggaaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcgggtttaaacagacaatgagcacgatgagcgccgctaagaagaaagacgtcatttctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatatgtagacgcagctagcgctacattaaacgaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaagatcacgtagcacacgcgtacgcgcagtccgtgccatatggcgtatcacaaattaaagcccctgctctgcactctcaaggctacaccggttcaaatgttaaagtagcggttatcgacagcggtatcgattcttctcatccagatcttaaagtagcaggcggagccagcatggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacggaacacacgttgctggtaccgttgcggctcttaataactcaatcggtgtattaggcgttgcgccaagcgcatcactttacgctgtaaaagttctcggcgccgacggttccggccaatacagctggatcattaacggaatcgagtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccgtccggttctgctgctttaaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagccggcaacgaaggcacttccggcagctcaagcacagtgggctaccctggtaaatacccttctgtcattgcagtaggcgctgtcgacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcgtaggacctgagctcgatgtcatggcacctggcgtatctatccaaagcacgcttcctggaaacaaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgcacgttgccggagccgcggctttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagctctctagaaaacaccactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaatgtacaggcggcagctcagtaaaactcgagataaaaaaccggccttggccccgccggttttttat(SEQIDNO：5).用于在枯草芽孢桿菌中表達(dá)FNA蛋白酶的質(zhì)粒pAC-FNAre顯示于圖5中。質(zhì)粒元件如下：pUB110＝來(lái)自質(zhì)粒pUB110的DNA片段[McKenzieT.，HoshinoT.，TanakaT.，SueokaN.(1986)pUB110的核苷酸序列：與復(fù)制和其調(diào)節(jié)有關(guān)的一些突出特性(TheNucleotideSequenceofpUB110：SomeSalientFeaturesinRelationtoReplicationandItsRegulation)。Plasmid15：93-103]，pBR322＝來(lái)自質(zhì)粒pBR322的DNA片段[BolivarF，RodriguezRL，GreenePJ，BetlachMC，HeynekerHL，BoyerHW。(1977)新載體II的構(gòu)建和表征。多目的克隆系統(tǒng)(Constructionandcharacterizationofnewcloningvehicles.II.Amultipurposecloningsystem)。Gene2：95-113]，pC194＝來(lái)自質(zhì)粒pC194的DNA片段[HorinouchiS.，WeisblumB。(1982)pC194的核苷酸序列和功能圖，特異誘導(dǎo)氯霉素抗性的質(zhì)粒(NucleotidesequenceandfunctionalmapofpC194，aplasmidthatspecifiesinduciblechloramphenicolresistance)，J.Bacteriol150：815-825]。質(zhì)粒特征如下：枯草芽孢桿菌的Ori＝來(lái)自pUB110的復(fù)制原點(diǎn)，CAT＝來(lái)自pC194的氯霉素抗性基因，pMB1復(fù)制原點(diǎn)＝來(lái)自pBR322的復(fù)制原點(diǎn)，bla＝來(lái)自pBR322的β-內(nèi)酰胺酶，短aprE啟動(dòng)子＝共有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，信號(hào)肽＝信號(hào)肽[指定的]，前肽＝FNA前區(qū)域，F(xiàn)NA成熟肽＝成熟FNA(被在本研究中表達(dá)的每一變體的編碼區(qū)替代)，BPN’終止子＝來(lái)自枯草桿菌蛋白酶BPN’的轉(zhuǎn)錄終止予。以下提供了FNA前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQIDNO：6)。在該序列中，黑體表示成熟FNA蛋白酶(野生型)，其也提供為SEQIDNO：7：MRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAYAQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ*(SEQIDNO：6)AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ*(SEQIDNO：7)枯草桿菌蛋白酶BPN’-Y217L(＝FNA)組合電荷/疏水性文庫(kù)(CCHL)的設(shè)計(jì)和產(chǎn)生通過(guò)鑒定7種均勻分布的、表面暴露的氨基酸來(lái)設(shè)計(jì)枯草桿菌蛋白酶BPN’-Y217L組合的電荷/疏水性文庫(kù)。這些殘基是S24、A45、S101、N109、N118、K213和L217。在如表3-1顯示，通過(guò)在每一位置處進(jìn)行4種可能的組合：野生型，谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、亮氨酸(L)和精氨酸(R)產(chǎn)生了32個(gè)成員的組合疏水性文庫(kù)(FH2-FH33)。含有FNA基因的pAC-FNAre質(zhì)粒發(fā)送到DNA2.0Inc.(MenloPark，CA)用于產(chǎn)生組合疏水性文庫(kù)。提供枯草芽孢桿菌菌株(基因型：ΔaprE、ΔnprE、ΔspoIIE、amyE:：xylRPxylAcomK-phleo)用于編碼FNA變體替代物的DNA的轉(zhuǎn)化。變體提供為在96孔板中的甘油儲(chǔ)備物。表3-1顯示了在FNA中進(jìn)行的替換以產(chǎn)生的變體。表3-1也提供了變體FNA和野生型之間的凈電荷和疏水性的差異。蛋白酶變體的表達(dá)用鋼制96孔復(fù)制器將來(lái)自甘油儲(chǔ)備物的克隆加到含有200μl的LB培養(yǎng)基+25μg/ml氯霉素的96孔培養(yǎng)板(BD，353075)中，復(fù)制含有GG36或FNA表達(dá)載體的枯草芽孢桿菌克隆，并37℃在濕潤(rùn)的環(huán)境中220轉(zhuǎn)/分鐘生長(zhǎng)過(guò)夜。將200μl過(guò)夜培養(yǎng)物接種在5ml塑料搖管中的2000μl確定成分培養(yǎng)基+25μg/ml氯霉素中。該培養(yǎng)基富含基于MOP緩沖液的半確定成分培養(yǎng)基，其用尿素作為主要的氮源，葡萄糖作為主要的碳源，并補(bǔ)充了1％大豆蛋白胨用于增強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)。將搖管在37℃、220轉(zhuǎn)/分鐘溫育60小時(shí)。60小時(shí)后，將上清在大于8000×RCF的離心機(jī)中離心。將溶液倒入15ml聚丙烯圓錐管中儲(chǔ)存。不再進(jìn)行另外的純化或濃縮。為了長(zhǎng)期穩(wěn)定性，將上清儲(chǔ)備物配制為40％丙二醇儲(chǔ)備物并儲(chǔ)存于4℃。實(shí)施例4去污和相對(duì)表達(dá)的評(píng)價(jià)該實(shí)施例描述了在BMI微布料樣品測(cè)定中測(cè)試GG36和FNA組合疏水性文庫(kù)變體。使用在實(shí)施例1中提供的方法。表4-1(GG36)和4-2(FNA)中顯示的結(jié)果是性能指標(biāo)，其中與分別的親本比較了相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)(TCAPI)和去污活性(BMIPI)方面的變體的性能。具有性能指數(shù)大于0.5(PI>0.5)的那些變體具有改善的性能。將性能指數(shù)小于或等于0.05規(guī)定為0.05并表示為黑斜體。ND表示沒(méi)有測(cè)定。本說(shuō)明書(shū)中提及的所有專(zhuān)利和文獻(xiàn)表現(xiàn)出了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易的理解，本發(fā)明適合于實(shí)施該目的并獲得所提及的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，以及其特性。本文中所述的組合物和方法表示為示例性的優(yōu)選實(shí)施方案，并不意為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易的理解，可以對(duì)本文中公開(kāi)的發(fā)明進(jìn)行不同的替換和修飾，并不背離本發(fā)明的范圍和精神。本文中說(shuō)明性描述的發(fā)明可以合適地在沒(méi)有本文中具體公開(kāi)的因素、限制存在的情況下實(shí)施。使用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)用作為描述性并非限制性術(shù)語(yǔ)，并且這些術(shù)語(yǔ)和表述的使用并不意圖排除其顯示和描述的任何等價(jià)特征以及其部分。但是應(yīng)當(dāng)理解，多種修飾可以在本發(fā)明所權(quán)利要求的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)當(dāng)理解，盡管本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施方案具體地公開(kāi)，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用本文中公開(kāi)的觀點(diǎn)的任選特性、修飾和變化，并且如本文中所定義，認(rèn)為此類(lèi)修飾和變化是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的。在本文中已經(jīng)廣泛且概括性地描述了本發(fā)明。屬于概括性公開(kāi)內(nèi)的每一較窄的種類(lèi)和次概括也構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。這包括具有限制或者否定性限制條件的本發(fā)明概括性公開(kāi)，以從種類(lèi)中排除任何物質(zhì)而不論該物質(zhì)是否被本發(fā)明明確地描述為排除。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3