本發(fā)明涉及谷物胚芽綜合利用開發(fā)抗氧化肽技術(shù)，尤其涉及一種輻照輔助雙酶酶解谷物胚芽制備抗氧化肽的方法。

背景技術(shù)：

隨著蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性的發(fā)現(xiàn)和對(duì)小分子肽生理功能的深入認(rèn)識(shí)，抗氧化肽的制備技術(shù)已成為當(dāng)今生物活性肽研究中的熱點(diǎn)之一。蛋白酶的商品化為蛋白質(zhì)在溫和條件下通過控制水解的程度獲得新型的材料資源提供了有效的工具和手段，所以酶解制備抗氧化肽的技術(shù)倍受關(guān)注。

谷物胚芽是谷物淀粉加工的副產(chǎn)物，相對(duì)于胚乳(主要是淀粉)，其具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。胚芽是谷物籽粒的生命源泉，除含有淀粉、脂肪、纖維素、多種維生素及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素外，還蘊(yùn)含豐富的蛋白質(zhì)，如麥胚中蛋白質(zhì)含量高達(dá)30％以上。目前絕大部分谷物胚芽被混入皮粕作為飼料或肥料出售，導(dǎo)致寶貴的谷物胚芽資源未能被合理、有效地利用。谷物胚芽蛋白通過特異的蛋白酶水解可生成具有抗氧化活性的氨基酸序列，即抗氧化肽。蛋白水解肽的常規(guī)制備技術(shù)是先從原料中提取純化蛋白質(zhì)，然后再利用酶解技術(shù)將其降解成肽，但這樣做的弊端是蛋白質(zhì)在提取純化過程中用到的試劑及溶劑極易導(dǎo)致蛋白質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生改變(如內(nèi)部二硫鍵增加、疏水值升高)，使其溶解性變差、利用率降低，所以在對(duì)其進(jìn)行酶解時(shí)不能提高其水解度、肽得率及肽的功能活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，針對(duì)現(xiàn)有酶解谷物胚芽蛋白制備抗氧化肽方法中存在的問題，提供一種輻照輔助雙酶酶解谷物胚芽制備抗氧化肽的方法，以進(jìn)一步提高酶解效率。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是：(1)以麥胚為原料，將其送入⁶⁰Co-γ射線輻照?qǐng)霾捎?-10KGy的劑量進(jìn)行輻照處理；(2)將麥胚粉碎，利用超臨界CO₂萃取設(shè)備進(jìn)行脫脂；(3)在經(jīng)步驟(2)處理的脫脂麥胚粉中加水，使蛋白質(zhì)含量達(dá)到3％-5％(w/w)，將溫度調(diào)至50℃、pH值調(diào)至9.0，加入堿性蛋白酶(Alcalase)，酶解2h；(4)將溫度調(diào)至50℃、pH值調(diào)至7.0，加入中性蛋白酶(Neutrase)，酶解1.5h后滅酶；(5)待自然冷卻后，將pH值調(diào)至4.0-5.0，按1:1(V:V)的比例加入乙醇后，離心取上清液，將其過分子量為10KDa的超濾膜，取透過液再過分子量為1KDa的超濾膜，取截留液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到高活性抗氧化肽。

步驟(1)中所述的輻照?qǐng)霾捎玫氖?sup>60Co-γ輻照源，源強(qiáng)為9.99×10¹⁵Bq，劑量率為2KGy/h；

步驟(2)中所述將麥胚粉碎是指將麥胚粉碎過40-60目篩，取篩下物；

步驟(2)中所述利用超臨界CO₂萃取設(shè)備進(jìn)行脫脂的條件是壓力25-35MPa、溫度30-35℃、時(shí)間120-180min，常溫分離，分離壓力5MPa，流量13L/min。

堿性蛋白酶的加酶量[E]/[S]為3000U/g～4000U/g，中性蛋白酶的加酶量[E]/[S]為600U/g～1000U/g。

本發(fā)明在不進(jìn)行蛋白提取的情況下，利于⁶⁰Co-γ射線先對(duì)谷物胚芽進(jìn)行輻照處理。⁶⁰Co-γ射線的穿透力極強(qiáng)，對(duì)原料經(jīng)過一定時(shí)間和劑量的輻照處理，不僅可以降農(nóng)殘，可有效降低其中大分子物質(zhì)的聚合度、使結(jié)構(gòu)變得松散、酶反應(yīng)可及度提高，從而有利于后續(xù)酶解過程中蛋白質(zhì)分子酶切位點(diǎn)的暴露，縮短酶解時(shí)間，提高水解度、肽得率及肽的抗氧化活性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果為：

(1)谷物胚芽資源一直沒有得到充分利用和開發(fā)，一方面是受傳統(tǒng)加工利用方式的影響，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值認(rèn)識(shí)不夠；而最重要的一方面則是因?yàn)楣任锱哐康哪蛢?chǔ)性差導(dǎo)致。因?yàn)楣任锱哐恐泻胸S富的內(nèi)源酶與脂類，使其很容易酸敗變質(zhì)。本發(fā)明采用⁶⁰Co-γ射線對(duì)原料進(jìn)行輻照處理，不僅可以鈍化其中的內(nèi)源酶，而且可以降低其水分活度，極大地提高了原料的耐儲(chǔ)性；另外輻照處理可以降農(nóng)殘，提高原料的安全性；

(2)本發(fā)明采用⁶⁰Co-γ射線對(duì)原料進(jìn)行輻照處理，可有效降低淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的聚合度、使結(jié)構(gòu)變得松散、酶反應(yīng)可及度提高，提高了水解度、肽得率及肽的抗氧化活性；

(3)本發(fā)明采用雙酶分步酶解技術(shù)，提高了原料中蛋白的水解度和利用率。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

(1)以下各實(shí)施例中，水解度的測(cè)定方法如下：

水解后產(chǎn)生的游離氨基氮用甲醛電位滴定法測(cè)定，總氮用凱氏定氮法測(cè)定，再按下式計(jì)算水解度：

游離氨基氮含量采用甲醛電位滴定法測(cè)定步驟為：用移液管吸取10mL水解液于200mL燒杯，加蒸餾水50mL，置于磁力攪拌器上混勻，以精密pH計(jì)指示溶液pH值，用0.05mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH為8.2，加入10mL預(yù)先調(diào)至pH8.2的甲醛后，繼續(xù)用0.05mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 9.2，記錄溶液pH值從8.2到9.2間所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積V₁。以相同條件未酶解的溶液為空白，記錄所消耗的0.05mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積V₂，則水解液總游離氨基氮含量為：

游離氨基氮含量(mmol/mL)＝M×(V₁－V₂)/10

式中：M－NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度(mol/mL)

V₁－水解液所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL)

V₂－空白溶液所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL)

(2)以下各實(shí)施例中，肽得率測(cè)定的測(cè)定方法如下：

采用酸溶性肽含量測(cè)定法：

(一)雙縮脲測(cè)定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用最小二乘法求牛血清白蛋白濃度X與吸光度Y之間的回歸方程。

(二)酸溶性肽含量的測(cè)定

量取麥胚蛋白水解液10mL，加入10％三氯乙酸(TCA)10mL與之混合，放置20min，在4000r/min下離心15min，用雙縮脲測(cè)定上清液中的肽含量。每個(gè)樣品測(cè)定三次，取均值。

(三)肽得率(TCA-PSI)的計(jì)算

(3)以下各實(shí)施例中，抗氧化活性的測(cè)定采用二苯基苦味?；诫伦杂苫?DPPH·)清除率法，具體測(cè)定方法如下：

配制濃度為6.5×10^-4mol/L的DPPH·甲醇溶液作為母液，并置入4℃冰箱避光保存。臨用前用50％甲醇將母液稀釋10倍，然后將稀釋后的DPPH·甲醇溶液、50％甲醇及測(cè)試樣品液按表1進(jìn)行反應(yīng)，并于DPPH·甲醇溶液的最大吸收波長(zhǎng)517nm測(cè)A₀、A_i、A_j所表示樣品的吸光度值(注：A_i所表示的樣品需在室溫下反應(yīng)30min后方可進(jìn)行吸光度的測(cè)定)。每個(gè)試樣做三個(gè)平行試驗(yàn)，取其平均值。

表1DPPH·試驗(yàn)加樣表

樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力(scavenging activity,SA)可表示為：

$SA\left(\%\right)=(1-\frac{A_i-A_j}{A_0})\×100\%$

其中A₀：DPPH·甲醇溶液的吸光度；

A_i：DPPH·甲醇溶液與樣品反應(yīng)后的吸光度；

A_j：樣品與甲醇混合液的吸光度。

實(shí)施例1：

將麥胚置入源強(qiáng)為9.99×10¹⁵Bq的⁶⁰Co-γ射線輻照?qǐng)?，采?KGy/h的劑量率、8KGy的劑量進(jìn)行輻照處理；將麥胚粉碎并過60目篩，取篩下物利用超臨界CO₂萃取設(shè)備進(jìn)行脫脂，操作條件為壓力25MPa、溫度30℃、時(shí)間120min，常溫分離，分離壓力5MPa，流量13L/min；在脫脂麥胚粉中加入去離子水，使蛋白質(zhì)含量達(dá)到3％(w/w)，將溫度調(diào)至50℃、pH值調(diào)至9.0，按酶用量[E]/[S]為4000U/g加入Alcalase反應(yīng)2h；然后將pH值調(diào)至7.0，按酶用量[E]/[S]為1000U/g加入Neutrase反應(yīng)1.5h后，95℃滅酶10min。待自然冷卻后，調(diào)pH值為4.0，然后再按1:1(V:V)的比例加入乙醇，在4℃、10000rpm條件下離心10min，并將上清液過分子量為10KDa的超濾膜，取透過液再過分子量為1KDa的超濾膜，取截留液，最后經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到高活性的1-10kDa谷物胚芽蛋白肽凍干粉。酶解液的蛋白水解度、肽得率及抗氧化肽活性結(jié)果見表2。

實(shí)施例2：

將麥胚置入源強(qiáng)為9.99×10¹⁵Bq的⁶⁰Co-γ射線輻照?qǐng)?，采?KGy/h的劑量率、10KGy的劑量進(jìn)行輻照處理；將麥胚粉碎并過40目篩，取篩下物利用超臨界CO₂萃取設(shè)備進(jìn)行脫脂，操作條件為壓力35MPa、溫度35℃、時(shí)間180min，常溫分離，分離壓力5MPa，流量13L/min；在脫脂麥胚粉中加入去離子水，使蛋白質(zhì)含量達(dá)到5％(w/w)，將溫度調(diào)至50℃、pH值調(diào)至9.0，按酶用量[E]/[S]為3000U/g加入Alcalase反應(yīng)2h；然后將pH值調(diào)至7.0，按酶用量[E]/[S]為800U/g加入Neutrase反應(yīng)1.5h后，95℃滅酶10min。待自然冷卻后，調(diào)pH值為4.5，然后再按1:1(V:V)的比例加入乙醇，在4℃、10000rpm條件下離心10min，并將上清液過分子量為10KDa的超濾膜，取透過液再過分子量為1KDa的超濾膜，取截留液，最后經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到高活性的1-10kDa谷物胚芽蛋白肽凍干粉。酶解液的蛋白水解度、肽得率及抗氧化肽活性結(jié)果見表2。

實(shí)施例3：

將麥胚置入源強(qiáng)為9.99×10¹⁵Bq的⁶⁰Co-γ射線輻照?qǐng)?，采?KGy/h的劑量率、9KGy的劑量進(jìn)行輻照處理；將麥胚粉碎并過50目篩，取篩下物利用超臨界CO₂萃取設(shè)備進(jìn)行脫脂，操作條件為壓力30MPa、溫度25℃、時(shí)間150min，常溫分離，分離壓力5MPa，流量13L/min；在脫脂麥胚粉中加入去離子水，使蛋白質(zhì)含量達(dá)到4％(w/w)，將溫度調(diào)至50℃、pH值調(diào)至9.0，按酶用量[E]/[S]為3500U/g加入Alcalase反應(yīng)2h；然后將pH值調(diào)至7.0，按酶用量[E]/[S]為600U/g加入Neutrase反應(yīng)1.5h后，95℃滅酶10min。待自然冷卻后，調(diào)pH值為5.0，然后再按1:1(V:V)的比例加入乙醇，在4℃、10000rpm條件下離心10min，并將上清液過分子量為10KDa的超濾膜，取透過液再過分子量為1KDa的超濾膜，取截留液，最后經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到高活性的1-10kDa谷物胚芽蛋白肽凍干粉。酶解液的蛋白水解度、肽得率及抗氧化肽活性結(jié)果見表2。

實(shí)施例4：

將麥胚置入源強(qiáng)為9.99×10¹⁵Bq的⁶⁰Co-γ射線輻照?qǐng)?，采?KGy/h的劑量率、10KGy的劑量進(jìn)行輻照處理；將麥胚粉碎并過60目篩，取篩下物利用超臨界CO₂萃取設(shè)備進(jìn)行脫脂，操作條件為壓力35MPa、溫度35℃、時(shí)間120min，常溫分離，分離壓力5MPa，流量13L/min；在脫脂麥胚粉中加入去離子水，使蛋白質(zhì)含量達(dá)到4％(w/w)，將溫度調(diào)至50℃、pH值調(diào)至9.0，按酶用量[E]/[S]為4000U/g加入Alcalase反應(yīng)2h；然后將pH值調(diào)至7.0，按酶用量[E]/[S]為700U/g加入Neutrase反應(yīng)1.5h后，95℃滅酶10min。待自然冷卻后，調(diào)pH值為4.0，然后再按1:1(V:V)的比例加入乙醇，在4℃、10000rpm條件下離心10min，并將上清液過分子量為10KDa的超濾膜，取透過液再過分子量為1KDa的超濾膜，取截留液，最后經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到高活性的1-10kDa谷物胚芽蛋白肽凍干粉。酶解液的水解度、肽得率及抗氧化肽活性結(jié)果見表2。

表2酶解液的水解度、肽得率及抗氧化肽活性結(jié)果