本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸基因工程菌，其構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid,3-HP)，又名β-羥基丙酸，CAS號(hào)：503-66-2。3-HP是一種三碳弱有機(jī)酸，分子兩端分別帶有的一個(gè)羥基和一個(gè)羧基使其分子性質(zhì)較為活潑，是近年來(lái)興起的一種重要的化學(xué)中間體，可以作為生產(chǎn)1，3-丙二醇(PDO)、丁二酸，特種聚酯和丙烯酸的原料，可用于合成涂料、膠黏劑、水處理化學(xué)品和個(gè)人護(hù)理用品等多種化工產(chǎn)品及日用品，具有的重大的開(kāi)發(fā)價(jià)值，使得其受到越來(lái)越多的關(guān)注。2004年美國(guó)能源部預(yù)測(cè)3-HP將是未來(lái)12種最具開(kāi)發(fā)潛力的三碳化工產(chǎn)品之一。

傳統(tǒng)的3-HP生產(chǎn)工藝都是從化學(xué)工藝的角度出發(fā)的，具有能耗高、污染大、副產(chǎn)物多、分離困難等缺點(diǎn)，而生物方法生產(chǎn)3-HP可以有效地避免這些不利因素。因此，用生物方法制備3-HP成了現(xiàn)在國(guó)際上最注目的研究熱點(diǎn)之一。

生物法主要由一些野生菌株或基因工程菌等微生物經(jīng)過(guò)一定方法改性后發(fā)酵得到3-HP。雖然早在上世紀(jì)60年代起，已經(jīng)開(kāi)始了利用野生菌株生物轉(zhuǎn)化法制備3-HP的研究，但由于微生物細(xì)胞自我調(diào)節(jié)控制機(jī)制等限制了其的發(fā)展應(yīng)用，使得利用野生菌株生物轉(zhuǎn)化法制備3-HP的方法長(zhǎng)期處于實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)，而很難應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

利用分子生物學(xué)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)特定外源基因在不同種屬之間的轉(zhuǎn)移、克隆以及表達(dá)，并可基于代謝工程原理構(gòu)建高產(chǎn)目的產(chǎn)物的基因工程菌。因此利用基因工程技術(shù)是生物法生產(chǎn)3-HP的一重要途徑。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因工程表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，目前應(yīng)用廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚，目標(biāo)基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)等特點(diǎn)。目前的研究主要通過(guò)構(gòu)建以葡萄糖或甘油等廉價(jià)碳源物質(zhì)作為底物來(lái)生產(chǎn)3-HP的基因工程菌株。目前的研究主要通過(guò)構(gòu)建以葡萄糖或甘油等廉價(jià)碳源物質(zhì)作為底物來(lái)生產(chǎn)3-HP的基因工程菌株。

Cargill公司主要研究以葡萄糖為底物的生物轉(zhuǎn)化途徑，并于2002年將該研究成果申請(qǐng)專(zhuān)利。該研究主要是以大腸桿菌作為宿主菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵。Cargill通過(guò)基因克隆手段將存在于不同微生物體內(nèi)的反應(yīng)組合在一起，在宿主體內(nèi)形成了一條以3-HP為代謝終產(chǎn)物的代謝路徑，代謝途徑中涉及到的關(guān)鍵酶都可以在KEGG代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到。專(zhuān)利中對(duì)該途徑當(dāng)中的所有酶都做了詳細(xì)說(shuō)明，并且通過(guò)大量研究將大部分酶的酶活力活提高了50％-80％，從而提高了底物轉(zhuǎn)化率。

在以葡萄糖為底物轉(zhuǎn)化生成3-HP的代謝路徑中，轉(zhuǎn)化率最高的是由存在于丙酸梭菌體內(nèi)的β-丙氨酸代謝路徑和橙色綠曲撓菌的3-羥基丙酸循環(huán)路徑組合而成。這條路徑中涉及到的3-羥基丙酰CoA脫水酶(OS19)基因來(lái)自于橙色綠曲撓菌，丙酸CoA轉(zhuǎn)移酶(PCT)基因和乳酰CoA脫水酶(LCD)基因則是來(lái)自于埃氏巨球菌。據(jù)報(bào)道，底物葡萄糖通過(guò)該代謝途徑的轉(zhuǎn)化，最終3-HP的產(chǎn)量可達(dá)20g/L。但是該路徑的構(gòu)建也存在一定的難度。乳酰CoA脫水酶是一種對(duì)O₂十分敏感的酶類(lèi)，該酶結(jié)構(gòu)中含有鐵硫中心，很容易因被氧化而失活。有文獻(xiàn)報(bào)道，該酶暴露于空氣中60min，其酶活性將降低90％，所以這種性質(zhì)給酶活的檢測(cè)工作增加了難度，同時(shí)使得構(gòu)建的基因工程菌發(fā)酵條件苛刻，必須在厭氧環(huán)境中進(jìn)行。

在以甘油為底物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)3-HP的代謝路徑中，甘油在甘油脫水酶DHAB以維生素B12為輔酶作用下轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物3-HPA；3-HPA在醛脫氫酶的催化下生成3-HP，并生成還原當(dāng)量NADH，產(chǎn)生的3-HP是細(xì)胞代謝終產(chǎn)物，可在發(fā)酵液中高度積累。該途徑經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)即可生成3-HP，且培養(yǎng)條件無(wú)需在嚴(yán)格的厭氧環(huán)境中。美國(guó)威斯康辛州研究基金會(huì)于上世紀(jì)末開(kāi)始研究構(gòu)建以甘油為底物的基因工程菌生產(chǎn)3-HP，并于2001年申請(qǐng)專(zhuān)利，該研究主要構(gòu)建能利用甘油作為底物生產(chǎn)3-HP的基因工程菌，但3-HP產(chǎn)量不高。2008年，Raj SM等以E.coli BL21(DE3)為宿主共表達(dá)了源于K.pneumoniae DSM 2026的甘油脫水酶DhaB和源于E.coli K-12MG1655的乙醛脫氫酶AldH，該重組菌可以直接利用甘油生產(chǎn)3-HP，但其產(chǎn)量?jī)H為0.58g/L；Raj SM等進(jìn)一步優(yōu)化了載體及誘導(dǎo)條件后，搖瓶情況下，3-HP的最高產(chǎn)量達(dá)到了4.4g/L。

同時(shí)，國(guó)內(nèi)的研究者們也對(duì)構(gòu)建以甘油為底物的基因工程菌生產(chǎn)3-HP進(jìn)行了試驗(yàn)研究。2008年，江南大學(xué)的黃瑞和許贛榮等將利用PCR方法從釀酒酵母克隆到的乙醛脫氫酶ALDH基因和克雷伯氏菌中的甘油脫水酶基因DHAB等兩個(gè)基因分別構(gòu)建了重組菌E.coli JM109(pUCtac-aldh)和E.coli JM109(pEtac-dhaB)，并將兩種重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM 109得到了重組大腸桿菌E.coli JM109(pUCtac-aldh，pEtac-dhaB)，該菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，3-HP的產(chǎn)量達(dá)4.92g/L。2012年，胡南等以自身攜帶乙醛脫氫酶的E.coli BL21(DE3)plysS作為宿主，異源表達(dá)源自Klebsiella pneumoniae的甘油脫水酶基因dhaB后，重組菌E.coli HP在搖瓶條件下，3-HP的最大產(chǎn)量達(dá)5.44g/L。

盡管眾多的研究者們通過(guò)一系列的研究試驗(yàn)，構(gòu)建了眾多的以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)3-HP的基因工程菌，在一定程度上提高了發(fā)酵生產(chǎn)3-HP的產(chǎn)量，但仍由于多種已知和未知的原因，以甘油為底物發(fā)酵產(chǎn)3-HP的量并未達(dá)到一個(gè)較為理想的狀態(tài)，且發(fā)酵過(guò)程中甘油的利用率也需要進(jìn)一步提高。因此轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)3-HP的基因工程菌還需要進(jìn)一步的研究。

研究構(gòu)建新的轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)3-HP的基因工程菌，提高發(fā)酵生產(chǎn)3-HP的產(chǎn)量，提高底物甘油的利用率，為利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)3-HP的工業(yè)化生產(chǎn)提供新的資源，具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸基因工程菌，其構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

所述的發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸基因工程菌，它是包含有甘油脫水酶DHAB編碼基因和乙醛脫氫酶ALDH編碼基因的大腸桿菌。

所述的甘油脫水酶DHAB編碼基因來(lái)源于克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的乙醛脫氫酶ALDH編碼基因來(lái)源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述的發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸基因工程菌的構(gòu)建方法，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中擴(kuò)增出甘油脫水酶DHAB編碼基因，構(gòu)建重組質(zhì)?？寺≥d體pMD18-T-DHAB，再對(duì)重組質(zhì)?？寺≥d體pMD18-T-DHAB和表達(dá)載體pET30a(+)分別用Hind III、Sac I酶雙酶切，將pMD18-T-DHAB切下的DHAB基因連接到載體pET30a(+)，構(gòu)建表達(dá)載體pET30a-DHAB；通過(guò)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303A中擴(kuò)增出乙醛脫氫酶ALDH編碼基因，構(gòu)建重組質(zhì)?？寺≥d體pMD18-T-ALDH；對(duì)重組質(zhì)粒pET30a-DHAB和pMD18-T-ALDH分別用BamH I、Sac I酶雙酶切，將pMD18-T-ALDH切下的ALDH基因連接到pET30a-DHAB載體上，構(gòu)建表達(dá)載體pET30a-ALDH-DHAB，將重組質(zhì)粒表達(dá)載體pET30a-ALDH-DHAB克隆到大腸桿菌DH5α中，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，然后再通過(guò)熱擊轉(zhuǎn)化法把pET30a-ALDH-DHAB轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中。

所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中使用的上、下游引物的序列分別如SEQ ID NO.3～4所示。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述的發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸基因工程菌的應(yīng)用。

所述的工程菌以甘油為碳源，可發(fā)酵生產(chǎn)3-HP，產(chǎn)量達(dá)8.442g/L。

本發(fā)明通過(guò)將兩種基因重組到同一個(gè)載體中，特別是pET30a(+)質(zhì)粒載體上，能夠顯著的提高3-HP的產(chǎn)量，具有較強(qiáng)的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

有益效果

本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)3-HP基因工程菌的優(yōu)益之處在于，其為用分子生物學(xué)方法構(gòu)建的工程菌，該工程菌利用原核表達(dá)載體pET30(+)，在載體的多克隆位點(diǎn)上通過(guò)雙酶切定向引入DHAB和ALDH兩個(gè)編碼基因，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、操作簡(jiǎn)便、可以大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。因而，該工程菌具備課大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)3-HP基因工程菌是將DHAB和ALDH兩個(gè)編碼基因同時(shí)克隆到同一個(gè)載體中，能同時(shí)高效表達(dá)產(chǎn)生DHAB和ALDH兩中酶蛋白，可有效避免所需兩種酶蛋白中的一種酶表達(dá)產(chǎn)生酶活性不足的情況，提高了3-HP的產(chǎn)量。

附圖說(shuō)明

圖1 PCR產(chǎn)物DHAB的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。泳道1、2為PCR產(chǎn)物，泳道M為Maker5000bp

圖2 PCR產(chǎn)物ALDH的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。泳道1～4為PCR產(chǎn)物，泳道M為Maker5000bp

圖3重組pMD18-T-ALDH質(zhì)粒雙酶切電泳鑒定圖。泳道1為pMD18-T-ALDH酶切產(chǎn)物，泳道M為Maker5000bp

圖4重組pMD18-T-DHAB質(zhì)粒PCR電泳鑒定圖。泳道1～12為單克隆菌落PCR產(chǎn)物，泳道M為Maker5000bp

圖5重組pET30a-DHAB質(zhì)粒PCR電泳鑒定圖。泳道1～12為單克隆菌落PCR產(chǎn)物，泳道M為Maker5000bp

圖6重組pET30a-ALDH-DHAB質(zhì)粒PCR電泳鑒定圖。泳道1～8為單克隆菌落PCR產(chǎn)物，泳道M為Maker5000bp

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。

本發(fā)明所述的克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae subsp.Pneumoniae的來(lái)源是：購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，菌株編號(hào)為1.1736。

本發(fā)明所述的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303A的來(lái)源是：山東大學(xué)鮑曉明教授實(shí)驗(yàn)室。(參見(jiàn)：劉向勇，張小華，鮑曉明.釀酒酵母工業(yè)菌株脅迫條件耐受性分析[J]，2006，中國(guó)釀造，8-11)

本發(fā)明所述的克隆載體pMD18-T的來(lái)源是：購(gòu)買(mǎi)自寶生物工程(大連)有限公司。

本發(fā)明所述的表達(dá)載體pET30(+)的來(lái)源是：江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所鹽城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

本發(fā)明所述的大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞來(lái)源是：購(gòu)買(mǎi)自上海邁其生物科技有限公司。

本發(fā)明所述的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞來(lái)源是：購(gòu)買(mǎi)自上海邁其生物科技有限公司。

實(shí)施例1重組質(zhì)粒pET30a-ALDH-DHAB的構(gòu)建

1.以克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的基因組DNA作為模板擴(kuò)增出DHAB基因

提取克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的基因組DNA，以克雷伯氏菌的基因組DNA作為模板，合成引物，擴(kuò)增出DHAB基因序列，引物如下：

P1:ExDHABF:5’-ACGCGGAGCTCATGAAAAGATCAAAACGA-3’(SEQ ID NO.2)

P2:ExDHABR:5’-CGGCAAGCTTTTAGCTTCCTTTACGCAG-3’(SEQ ID NO.3)

上游引物(P1)引入Sac I位點(diǎn)，下游引物(P2)引入Hind III的酶切位點(diǎn)。5’端各引入5個(gè)、4個(gè)酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基。

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析，DHAB基因大小約為2700bp(圖1)，與預(yù)期大小相符。PCR產(chǎn)物純化后，送到上海生工生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與genebank上的已知DHAB基因一致，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.pMD18-T-DHAB質(zhì)粒構(gòu)建

純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性質(zhì)粒，進(jìn)行單克隆菌落PCR，PCR產(chǎn)物電泳驗(yàn)證，大小正確(圖3)。

3.表達(dá)載體pET30a-DHAB構(gòu)建

用Hind III、Sac I酶切表達(dá)載體pET30a(+)，將從pMD18-T-DHAB上用Hind III和Sac I雙酶切下的DHAB基因片段連接到載體pET30a(+)上，轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α中，進(jìn)行單克隆菌落PCR篩選，菌落PCR產(chǎn)物電泳驗(yàn)證，大小正確(圖4)。

4.以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303A基因組DNA為模板擴(kuò)增出ALDH基因

提取克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的基因組DNA，以克雷伯氏菌的基因組DNA作為模板，合成引物，擴(kuò)增出DHAB基因序列，引物如下：

P3:ExALDHF:5’-ACCGGGATCCATGTTCAGTAGATCTACGC-3’(SEQ ID NO.5)

P4:ExALDHR:5’-ACCGGAGCTCCTCGTCCAATTTGGCACG-3’(SEQ ID NO.6)

上游引物(P3)引入BamH I位點(diǎn)，下游引物(P4)引入Sac I的酶切位點(diǎn)。5’端各引入4個(gè)酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基。

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析，ALDH基因大小約為1557bp(圖2)，與預(yù)期大小相符。PCR產(chǎn)物純化后，送到上海生工生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與genebank上的已知ALDH基因一致，其序列如SEQ ID NO.4所示。

5.pMD18-T-ALDH質(zhì)粒構(gòu)建

純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性質(zhì)粒，陽(yáng)性質(zhì)粒用BamH、Sac I雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳驗(yàn)證，大小正確(圖3)。

6.表達(dá)載體pET30a-ALDH-DHAB構(gòu)建與熱擊轉(zhuǎn)化

用BamH I、Sac I酶切表達(dá)載體pET30a-DHAB，將從pMD18-T-ALDH上用BamH I和Sma I雙酶切下的ALDH基因片段連接到載體pET30a-DHAB上，轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α中，通過(guò)克隆ALDH基因進(jìn)行菌落PCR，電泳篩選轉(zhuǎn)化成功的陽(yáng)性單菌落，提取質(zhì)粒pET30a-ALDH-DHAB。然后再通過(guò)熱擊轉(zhuǎn)化法把質(zhì)粒pET30a-ALDH-DHAB轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，進(jìn)行表達(dá)，最后測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物的酶活。

7.熱擊轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的選擇性篩選

(1)從-70℃冰箱中取出大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，冰浴融化，每管取50uL感受態(tài)細(xì)胞，加入10uL連接反應(yīng)液(或載體)，槍打混勻，冰浴20min；

(2)42℃水浴熱擊90s，立即放入冰浴2min；

(3)加入940μL LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃、150rpm搖床培養(yǎng)1.5h；

(4)將培養(yǎng)菌液涂板(LB，含抗生素)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，產(chǎn)生菌落后可存放于4℃。

(5)挑取數(shù)十個(gè)所培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行菌落PCR，篩選轉(zhuǎn)化成功的單菌落。其菌落PCR反應(yīng)體系為：

實(shí)施例2轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)

從新鮮轉(zhuǎn)化的平板分別挑取重組菌株的單克隆菌落，加入含25μg/mL卡那霉素的100mL LB培養(yǎng)基37℃，150rpm，震蕩培養(yǎng)10-12小時(shí)，至菌液OD₆₀₀值達(dá)到0.6-0.9時(shí)，加入IPTG，使IPTG終濃度為1.0mM，在15-25℃誘導(dǎo)15-20小時(shí)，得到本發(fā)明的工程菌。(這里不提供酶活測(cè)定了，下面的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)即可說(shuō)明生產(chǎn)3-HP特性)

實(shí)施例3:本發(fā)明的工程菌發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的反應(yīng)

在500mL滅菌的三角瓶中加入100mL M9培養(yǎng)基(g.L^-1，甘油50，酵母膏5.0，KH₂PO₄7.5，MgSO₄·7H₂O 0.25，(NH₄)₂SO₄ 2.0，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.005，CaCl₂ 0.1，維生素B12 0.015，去離子水1000mL，pH7.0)，按10％的接種量接入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BL21(pET30a-ALDH-DHAB)菌株(與實(shí)施例2中培養(yǎng)方法相同)，然后于37℃、140rpm條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)60h，以未加入IPTG誘導(dǎo)的發(fā)酵液作為對(duì)照，對(duì)照組同樣在上述條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

在培養(yǎng)中定時(shí)取樣，通過(guò)高效液相色譜3-HP濃度。該基因工程菌生產(chǎn)3-HP的產(chǎn)率見(jiàn)表1(表中數(shù)值為三個(gè)重復(fù)的平均值)。

高效液相測(cè)定3-HP色譜條件：色譜柱Diamonsal C18；流動(dòng)相:甲醇:水＝5:95；流速:0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng):210nm；柱溫:30℃；進(jìn)樣量:20μ1。

表1BL21(pET30a-ALDH-DHAB)工程菌株發(fā)酵產(chǎn)3-HP的能力

上表中對(duì)照組代表未加入IPTG的發(fā)酵樣品、處理組是指加入了1.0mM IPTG的發(fā)酵樣品。

在含有50g·L^-1甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基中于37℃、140rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)60h，每5h取樣測(cè)定發(fā)酵液中3-HP含量，分析發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明基因工程菌在1.0mM IPTG條件下、發(fā)酵培養(yǎng)45h時(shí)，發(fā)酵液中3-HP的含量可達(dá)8.442g·L^-1，比文獻(xiàn)中已報(bào)道的基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)3-HP的產(chǎn)量有了較大程度的提高。

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atgaaaagat caaaacgatt tgcagtactg gcccagcacc ccgtcaatca ggacgggctg 60

attggcgagt ggcctgaaga ggggctgatc gccatggaca gcccctttga cccggtctct 120

tcagtaaaag tggacaacgg tctgatcgtc gagctggacg gcaaacgccg ggaccagttt 180

gacatgatcg accggtttat cgccgattac gcgatcaacg ttgagcgcac agagcaggca 240

atgcgcctgg aggcggtgga aatagcccgc atgctggtgg atattcacgt cagccgggag 300

gagatcattg ccatcactac cgccatcacg ccggccaaag cggtcgaggt gatggcgcag 360

atgaacgtgg tggagatgat gatggcgctg cagaagatgc gtgcccgccg gaccccctcc 420

aaccagtgcc acgtcaccaa tctcaaagat aatccggtgc agattgccgc tgacgccgcc 480

gaggccggga tccgcggctt ctcagaacag gagaccacgg tcggtatcgc gcgctacgcg 540

ccgtttaacg ccctggcgct gttggtcggt tcgcagtccg gccgccccgg cgtgttgacg 600

cagtgctcgg tggaagaggc caccgagctg gagctgggca tgcgtggctt aaccagctac 660

gccgagacgg tgtcggtcta cggcacggaa gcggtattta ccgacggcga tgatacgccg 720

tggtcaaagg cgttcctcgc ctcggcctac gcctcccgcg ggttgaaaat gcgctacacc 780

tccggcaccg gatccgaagc gctgatgggc tattcggaga gcaagtcgat gctctacctc 840

gaatcgcgct gcatcttcat taccaaaggc gccggggttc aggggctgca aaacggcgcg 900

gtgagctgta tcggcatgac cggcgctgtg ccgtcgggta ttcgggcggt gctggcggaa 960

aacctgatcg cctctatgct cgacctcgaa gtggcgtccg ccaacgacca gactttctcc 1020

cactcggata ttcgccgcac cgcgcgcacc ctgatgcaga tgctgccggg caccaacttt 1080

attttctccg gctacagcgc ggtgccgaac tacgacaaca tgttcgccgg ctcgaacttc 1140

gatgcggaag attttgatga ttacaacatc ctgcagcgtg acctgatggt tgacggcggc 1200

ctgcgtccgg tgaccgagga ggaaaccatt gccattcgcc agaaagcggc gcgggcgatc 1260

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gtggaagaga tgatgaagcg caacatcacc ggcctcgata ttgtcggcgc gctgagccgc 1440

agcggctttg aggatatcgc cagcaatatt ctcaatatgc tgcgtcagcg ggtcaccggc 1500

gattacctgc agacctcggc cattctcgat cggcagttcg agatggtgag tgcggtcaac 1560

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gtgcaacaga caacccaaat tcagccctct tttaccctga aaacccgcga gggcggggta 1740

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caccagcatc acactctgaa cgatatgccc catggcgcga tcctcaaaga gctgattgcc 1860

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tcctttatgg cctgggatgc ggccaacctg agcggctcgg ggatcggcat cggtatccag 1980

tcgaagggga ccacggtcat ccatcagcgc gatctgctgc cgctcagcaa cctggagctg 2040

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agcgcattct ggctatctat aacgcgctgc gcccgttccg ctcctcgcag gcggagctgc 2580

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gaggacgatg tggaagaggc cgtgcaggcc gccgaccgtg ccttctctaa tgggtcttgg 300

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