本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于指示核酸分子量大小的DNA Marker及其制備工藝。

背景技術(shù)：

20世紀(jì)70年代末至80年代初，由于近代生物學(xué)的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)、基因工程、DNA重組技術(shù)等的問(wèn)世，基于生物遺傳物質(zhì)DNA為基礎(chǔ)，從微觀角度闡釋生命活動(dòng)規(guī)律的研發(fā)開(kāi)展得如火如荼。在這些涉及核酸物質(zhì)DNA的研發(fā)工作中，DNA Marker是最為廣泛使用的試劑之一，它能判斷和指示核酸分子量大小，用作核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)核酸片段進(jìn)行定量分析。

DNA Marker含有不同分子量的DNA片段，其主要用途是在核酸的瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，用來(lái)指示核酸電泳中未知片段的分子量大小。據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)即DNA Marker制備所涉及的技術(shù)可分為用限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒及噬菌體DNA和PCR技術(shù)擴(kuò)增，前者的主要不足是酶切位點(diǎn)過(guò)多或過(guò)少，使得酶切產(chǎn)物DNA大小過(guò)于接近或相差太遠(yuǎn)，不能按照目的DNA片段大小設(shè)計(jì)相符的DNA片段，在特定的實(shí)驗(yàn)中并不能很好的指定DNA的分子質(zhì)量；由于PCR擴(kuò)增具有強(qiáng)大的擴(kuò)增DNA片段的能力，利用該技術(shù)制作DNA Marker不存在技術(shù)問(wèn)題。已有學(xué)者基于PCR技術(shù)擴(kuò)增出100-1000bp的DNA片段，制成DL1000 Marker、利用多重PCR制備出DL1000 DNA Marker。利用PCR技術(shù)制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵是目的DNA片段大小的設(shè)計(jì)、模板的選擇、引物設(shè)計(jì)、PCR反應(yīng)條件摸索，本發(fā)明所制備的DL2000 DNA Marker制品比常規(guī)常品多設(shè)計(jì)了一條大小為1500bp的DNA片段，適宜用于分子量不高于2000bp目的DNA片段的指示，特別是利用原核微生物16S rDNA（約為1500bp）基因?qū)ζ溥M(jìn)行種屬鑒定的試驗(yàn)中。本發(fā)明所用擴(kuò)增模板序列為SEQ NO1，大小約為5900bp，可用于5kb以下，能擴(kuò)增到的目標(biāo)大小DNA片段的擴(kuò)增。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于指示核酸分子量大小的DNA Marker及其制備工藝

本發(fā)明所提供的DL2000 DNA Marker是由2000 bp、1500bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及 100 bp共 7 條雙鏈DNA片段組成，已混有上樣緩沖液，可直接用于凝膠電泳，每次上樣5μl；為便于電泳后觀察，1000bp條帶最亮，約為100ng，其它約為50ng；用作指示核酸電泳中未知大小DNA片段的分子量大小。

本發(fā)明所提供的DL2000 DNA Marker的制備工藝是以質(zhì)粒SEQ No.1為模板，設(shè)計(jì)一條上游引物和7條下游引物，利用PCR擴(kuò)增大小分別為2000 bp、1500bp、1000 bp、750 bp、500 bp、 250 bp以及 100 bp的DNA片段，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物含量并進(jìn)行DNA片段配方優(yōu)化，最后得到按照目的DNA條帶大小設(shè)計(jì)的、經(jīng)電泳及染色后條帶清晰，密度適宜的DL2000 DNA Marker。

引物的設(shè)計(jì)與合成

通過(guò)參照質(zhì)粒SEQ No.1的序列DNA序列，結(jié)合Ediseq和PrimerSelect軟件設(shè)計(jì)1個(gè)上游引物和7個(gè)下游引物，并送生物公司進(jìn)行合成。其序列見(jiàn)表1：

表1 制備DNA Marker所用引物序列。

菌種的活化及質(zhì)粒提取

菌種的活化：將JM109(SEQ No.1)甘油菌接至LB液體培養(yǎng)基中，于37℃140rpm過(guò)夜振蕩培養(yǎng)8-10小時(shí)。用已活化的菌種均勻涂布在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h后，挑取單菌落于液體培養(yǎng)基上，過(guò)夜搖床后提取質(zhì)粒。質(zhì)粒的提取：利用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

目的DNA片段的PCR擴(kuò)增及反應(yīng)條件優(yōu)化

采用50μl的PCR反應(yīng)體系，包括：ddH₂O 39μl、10×PCR Buffer 5μl、10mM的dNTPs 1μl、10μM的引物all-F 1μl、10μM的下游引物-R 1μl、DNA模板1μl、2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min、94℃變性30s、退火溫度49-54℃30s、72℃延伸1-3min、共30-35個(gè)循環(huán)、72℃再延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA目的條帶。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，進(jìn)行PCR條件的優(yōu)化，如改變PCR反應(yīng)體系中的dNTPs的量，反應(yīng)條件中的退火溫度、循環(huán)轉(zhuǎn)數(shù)以及延伸時(shí)間，使擴(kuò)增的目的條帶清晰且單一。

表2 各DNA片段的最佳PCR反應(yīng)條件。

DNA Marker設(shè)計(jì)

該Marker中1000bp的DNA片段終濃度設(shè)計(jì)約為20ng/μl，其余各DNA片段終濃度設(shè)計(jì)約為10ng/μl。

DNA片段含量測(cè)定：將擴(kuò)增產(chǎn)物中低分子量的DNA片段（100bp，250bp）用DNA快速純化試劑盒進(jìn)行純化后用超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定核酸含量；其余各片段直接用超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀進(jìn)行含量測(cè)定。

少量DNA Marker配方摸索及體系放大：按預(yù)制Marker體積計(jì)算各DNA片段含量及應(yīng)取樣體積，取相應(yīng)體積500bp以上DNA片段的PCR產(chǎn)物混合，按量加入已純化的100bp，250bp的DNA片段，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Marker效果，據(jù)電泳效果微調(diào)各片段的濃度，確定各擴(kuò)增產(chǎn)物的配比。將反應(yīng)體系放大到400μl。為增加DNA Marker的辨認(rèn)效果，突出指示條帶，標(biāo)亮1000bp。按2.5% 的比例加入Loading Buffer 和7.5%的甘油，混勻后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA Marker效果，根據(jù)瓊脂糖凝膠圖像微調(diào)各片段的濃度，得到效果滿意、條帶清晰、1000bp高亮的DL2000 DNA Marker。

附圖說(shuō)明

圖1 DL2000 DNA Marker各片段PCR擴(kuò)增

Lane 1~7 分別為 100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 DL2000 DNA Marker的瓊脂糖凝膠電泳

Lane 1~4 DL2000 DNA Marker。

具體實(shí)施方式

用實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明DNA Marker及其制備工藝實(shí)施內(nèi)容。但本發(fā)明的內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例：制備400μl DL2000 DNA Marker。

（1）引物的設(shè)計(jì)

在NCBI中找到SEQ No.1質(zhì)粒序列（GenBank：CS054777.1）后用DNAStar-Lasergene軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，引物序列如表1。

（2）細(xì)菌的復(fù)蘇

從超低溫儲(chǔ)存箱（-86℃）中取出大腸桿菌JM109(SEQ No.1），在無(wú)菌操作臺(tái)上取50μl加至5ml的已加5μl氨芐青霉素（Amp）LB液體培養(yǎng)基試管中，放置于氣浴搖床中以37℃、140r/min的溫度和轉(zhuǎn)速培養(yǎng)10-12h。

（3）細(xì)菌的純化

取活化的JM109(SEQ No.1）100μl涂布于含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，在37℃的光照恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16-18h。用已滅菌的牙簽挑單菌落，放入已含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置控溫氣浴搖床中以37℃、140r/min培養(yǎng)10-12h備用。

（4） 質(zhì)粒DNA的提?。河脡A裂解法提取質(zhì)粒DNA, 具體步驟如下：

A．將菌液轉(zhuǎn)入1.5ml的Eppendorf管中，以8000r/min轉(zhuǎn)速1min將細(xì)菌沉淀至管底，除盡上層培養(yǎng)基；

B．加入100μl預(yù)冷的溶液I，放置漩渦振蕩儀充分懸浮細(xì)菌，加入4μl RNase，室溫放置2min。加入200μl的溶液II，快速顛倒，溫和混勻，冰浴5min。再向其中加入150μl冰上預(yù)冷的溶液III，溫和混勻，冰浴5min；

C．12000r/min轉(zhuǎn)速5min，沉淀白色絮狀物，將上層清液轉(zhuǎn)至另一1.5mlEppendorf管中。

D．向其中加入2倍上層清液體積且預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，放置與-20℃冷藏20min；

E．取出后12000r/min轉(zhuǎn)速5min，除盡上層清液。加入500μl的70%乙醇清洗沉淀，以3000r/min轉(zhuǎn)速1min沉淀DNA，風(fēng)干，徹底揮發(fā)除去乙醇；

F．再加入40μl 雙蒸水溶解DNA，其余放置于-20℃冷藏，待用。

(5) PCR擴(kuò)增及反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用50μl的PCR反應(yīng)體系：ddH₂O 39μl、10×PCR Buffer 5μl、10mM的dNTPs 1μl、10μM的引物all-F 1μl、10μM的引物-R 1μl、DNA模板1μl、2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl。 PCR反應(yīng)體系中的dNTPs、模板DNA、Taq DNA Polymerase用量、引物以及Mg²⁺的濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同而進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，通過(guò)調(diào)節(jié)dNTPs、Taq DNA Polymerase的用量而其它保持初始量。而退火溫度的初始擬定是根據(jù)所設(shè)計(jì)引物里的A、T、C、G的含量按照Tm=（4*G/C+2*A/T-5）來(lái)分別計(jì)算，再根據(jù)上下游引物的Tm值計(jì)算T=（Tm₁+Tm₂）/2-5，然后在計(jì)算所得溫度加減2℃-3℃來(lái)設(shè)定范圍，完成后梯度PCR儀根據(jù)設(shè)定范圍會(huì)給出8個(gè)溫度梯度。通過(guò)微調(diào)PCR條件中的dNTPs的用量以及循環(huán)數(shù)來(lái)提高目的基因濃度，實(shí)現(xiàn)每一條帶的優(yōu)化，得到一個(gè)客觀的最優(yōu)PCR條件，最后確定各DNA片段的最佳PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表二。

(6) 各DNA片段配方優(yōu)化

為了突出指示效果，將1000bp的DNA片段設(shè)為高亮，在DNA Marker中的終濃度約為20 ng /μl，其余DNA片段終濃度設(shè)計(jì)為約10 ng /μl；將低分子量的DNA片段（100bp，250bp）用DNA快速純化試劑盒純化后用超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定核酸含量，其余DNA片段直接用超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定核酸含量。

在最佳反應(yīng)條件下擴(kuò)增各片段DNA后，2000 bp、1500bp、1000 bp、750 bp、500 bp的DNA片段含量經(jīng)測(cè)定分別為：89.68 ng/μl、89.68 ng/μl、86.87 ng/μl、80.65 ng/μl、113.00 ng/μl。另外，250 bp、100 bp的PCR產(chǎn)物經(jīng)濃縮純化后，含量均為117.42 ng/μl。

據(jù)DNA片段含量計(jì)算需加入體積分別為：44.6μl、44.6μl、92.1μl、49.6μl、35.4μl、34.1μl、34.1μl。按計(jì)算結(jié)果取相應(yīng)量混合，按2.5% 的比例即加入20μl Loading Buffer 和7.5%即30μl的甘油，用滅菌水定容到接近400μl，混勻后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA Marker效果，根據(jù)瓊脂糖凝膠圖像微調(diào)各片段的濃度，得到效果滿意、條帶清晰、1000bp高亮的DL2000 DNA Marker。