本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因，還涉及該基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：影響豬毛色性狀的色素主要是黑色素，黑色素可分為真黑色素和褐黑色素兩種。真/褐黑色素在不同品種豬被毛中的含量和分布造就了不同的毛色類型。黑素皮質(zhì)素受體1(Melanocortin1Receptor,MC1R)基因在控制動(dòng)物黑色素合成的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，并被證實(shí)為控制動(dòng)物毛色的主效基因。KijasJM等(KijasJM,MollerM,PlastowG,etal.AframeshiftmutationinMC1Randahighfrequencyofsomaticreversionscauseblackspottinginpigs.[J].Genetics,2001,158(2):779-85.)發(fā)現(xiàn)在塔姆沃思和赫里福德(TamworthandHereford)豬種的MC1R編碼區(qū)第67-68位點(diǎn)處有CC插入的突變，這種移碼突變可能引起的隱性紅毛色。頓桂玲等(頓桂玲,李祥龍,曹洪戰(zhàn),等.3個(gè)豬品種黑素皮質(zhì)素受體1(MC1R)基因變異研究[J].JournalofGeneticsandGenomics,2007,34(9):777-782.)研究發(fā)現(xiàn)所有長(zhǎng)白、大白豬個(gè)體在894位點(diǎn)均存在CC插入，并推測(cè)該突變可能與長(zhǎng)白、大白豬白毛色存在相關(guān)性，但未經(jīng)過(guò)群體驗(yàn)證。而師科榮等(師科榮,王愛(ài)國(guó),李寧,等.中國(guó)地方豬種黑素皮質(zhì)激素受體1基因(MC1R)的單核苷酸多態(tài)性[J].中國(guó)科學(xué),2004,34(2):144-149.)對(duì)中國(guó)地方豬種MC1R基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，民豬、金華豬、榮昌豬、五指山豬、梅山豬等11個(gè)中國(guó)地方豬種的MC1R基因存在3個(gè)突變G284A，T309C和T364C，未檢測(cè)出編碼區(qū)67-68bp處有CC插入的突變，且認(rèn)為MC1R基因?qū)τ谥袊?guó)地方豬種之間毛色的差異沒(méi)有起到關(guān)鍵的影響作用。印崇等(印崇,高峰,李傲楠,等.豬毛色基因黑色素受體1的基因型分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2014,41(11):44-49.)通過(guò)對(duì)豬MC1R基因型分析發(fā)現(xiàn)，西藏小型豬在nt894insCC位點(diǎn)表現(xiàn)出其他基因型，而非CC插入突變基因型。迄今為止，豬MC1R基因突變的研究中，尚未發(fā)現(xiàn)能引起巴馬香豬白化的相關(guān)報(bào)道。而白化巴馬香豬具有如下多種用途：一、在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用：廣西巴馬小型豬作為國(guó)內(nèi)小型豬主要品種之一，具有遺傳性穩(wěn)定、多產(chǎn)、體重較小等特征，組織器官及生化指標(biāo)與人類相似，已越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。醫(yī)用疾病動(dòng)物模型中常用白毛色動(dòng)物為理想模型，普通巴馬香豬毛色中間部分為白色，兩頭為黑色，對(duì)于實(shí)驗(yàn)觀察存在不利之處。因此，體表全覆蓋白毛的白化巴馬香豬與普通巴馬香豬相比更具有作為醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的價(jià)值。二、作為寵物用豬:目前市面上國(guó)內(nèi)的寵物豬品種以香豬為主，其中主要為巴馬香豬。由于巴馬香豬是一個(gè)具有穩(wěn)定的遺傳基因、品質(zhì)優(yōu)良、珍貴稀有的地方小型豬種，且其體型矮小短圓，外形俊秀，聰明溫順，很受一些寵物愛(ài)好者的歡迎。目前，市面上的寵物用巴馬香豬毛色品系主要為兩頭烏，全白毛色的巴馬香豬寵物尚未出現(xiàn)，因此白化隱性巴馬香豬品系開發(fā)成寵物豬具有一定的市場(chǎng)。三、巴馬香豬毛色對(duì)遺傳育種中的作用：毛色可以作為一種遺傳標(biāo)記，應(yīng)用于評(píng)判品種的純度、遺傳穩(wěn)定性、親緣關(guān)系及在配套系培育中確定親本的雜交組合類型。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因及其應(yīng)用，可引起巴馬香豬白化并呈隱性遺傳，能夠用于制備白化醫(yī)用動(dòng)物模型、制備白化寵物用豬和遺傳育種用途的遺傳標(biāo)記。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：一種引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因，MC1R基因的第894位之后新插入CC兩個(gè)堿基，該突變可引起巴馬香豬白化并呈現(xiàn)隱性遺傳。一種利用所述的引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因在制備醫(yī)用動(dòng)物模型中的應(yīng)用。一種利用所述的引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因在制備白化寵物用豬的應(yīng)用。一種利用所述的引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因在制備一種遺傳標(biāo)記，作為評(píng)判品種的純度、遺傳穩(wěn)定性、親緣關(guān)系及在遺傳育種配套系培育中確定親本的雜交組合類型中的應(yīng)用。一種檢測(cè)巴馬香豬隱性白化位點(diǎn)的基因型的方法，是以檢測(cè)巴馬香豬MC1R基因第894位脫氧核糖核酸是否有CC插入，即第889位脫氧核糖核酸為起始的六個(gè)連續(xù)C是否突變?yōu)榘藗€(gè)連續(xù)C，確定待測(cè)巴馬香豬的基因型是--/--、CC/--或者CC/CC，其中CC/CC基因型的巴馬香豬的毛色呈現(xiàn)全白，而--/--和CC/--基因型的巴馬香豬的毛色呈現(xiàn)兩頭烏黑中間白；所述--/--基因型的個(gè)體為巴馬香豬MC1R基因的自5’末端第894位脫氧核糖核酸無(wú)CC插入的純合體；所述CC/CC基因型的個(gè)體為巴馬香豬MC1R基因的自5’末端第894位脫氧核糖核酸有CC插入的純合體；所述CC/--基因型的個(gè)體則為兩個(gè)等位基因中僅有一個(gè)基因有CC插入的雜合體。確定待測(cè)巴馬香豬MC1R基因第894位脫氧核糖核苷酸后是否插入CC的方法可采用測(cè)序分析方法。測(cè)序分析包括PCR擴(kuò)增和對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；所述PCR擴(kuò)增用的引物對(duì)設(shè)計(jì)：以巴馬香豬基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物含有巴馬香豬MC1R基因的第889位至第896位脫氧核糖核苷酸；PCR擴(kuò)增得到的DNA片段為序列1所示的核苷酸序列或序列2所示的核苷酸序列。測(cè)序方法中，設(shè)計(jì)引物如下：正向引物F：5’-GGAGAGGAGGCTGCTGG-3’反向引物R：5’-TGGACACCTCCAGGCACT-3’用上述引物對(duì)在巴馬香豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：2×TaqUnicornPremix12.5μl，DNA(1/100)1.0μl，PrimerF2(10μM)0.5μl，PrimerR2(10μM)0.5μl，AddH2OTo25.0μl；PCR反應(yīng)程序：94℃4min；94℃20sec，57℃20sec，72℃20sec，20cycles；72℃3min；10℃。本發(fā)明的有益技術(shù)效果有：本發(fā)明的突變基因可引起巴馬香豬白化并呈現(xiàn)隱性遺傳，可用于選育白化巴馬香豬品系，與普通巴馬香豬品系兩頭黑、中間白相比，體表全覆蓋純白毛發(fā)的白化巴馬香豬品系更適宜作為醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。同時(shí)，巴馬香豬作為主要的寵物用豬，白化品系的培育可滿足部分寵物豬愛(ài)好者對(duì)全白毛色的偏愛(ài)。此外，全白毛色還可以作為一種遺傳標(biāo)記，應(yīng)用于評(píng)判品種的純度、遺傳穩(wěn)定性、親緣關(guān)系及在配套系培育中確定親本的雜交組合類型。附圖說(shuō)明圖1為正常巴馬香豬外觀；圖2為白化突變巴馬香豬外觀；圖3為基因型檢測(cè)測(cè)序峰圖；具體實(shí)施方式實(shí)施例1：白化巴馬香豬遺傳家系的建立以我國(guó)巴馬香豬為模式動(dòng)物，在進(jìn)行近交建系的過(guò)程中意外獲得了呈高度穩(wěn)定隱性遺傳的、白化巴馬香豬遺傳家系。具體過(guò)程如下：第一階段：以1頭F1建系公豬與野生型巴馬香豬進(jìn)行交配獲得F2群體，選留F2母豬和F1公豬回交產(chǎn)生F3代；在F3代意外發(fā)現(xiàn)白化個(gè)體，為檢測(cè)其遺傳性，增加F2母豬和F1公豬回交以出生足夠數(shù)量的F3代，結(jié)果共出生F3代125頭，其中白化個(gè)體29頭，正常個(gè)體96頭；第二階段(進(jìn)展中)：利用F3代白化巴馬香豬公豬與F3代白化巴馬香豬母豬交配產(chǎn)生F4代白化巴馬香豬，擴(kuò)大白化巴馬香豬遺傳家系豬只數(shù)量。該家系目前共包括148頭個(gè)體，包括攜帶隱性遺傳基因的F1公豬1頭，攜帶隱性遺傳基因的F2母豬3頭，F(xiàn)3代豬125頭，及參與家系配種的野生型豬19頭。將所有的白化家系產(chǎn)生的F3代進(jìn)行隱性遺傳卡方合適度檢驗(yàn)，如表1所示。表1白化家系F3代產(chǎn)仔記錄正常白化總數(shù)觀察次數(shù)O9629125理論次數(shù)T93.7531.25125|O-T|-0.51.751.75(|O-T|-0.5)23.06253.0625(|O-T|-0.5)2/T0.03270.0981、假設(shè)H0：正常和白化的分離比符合理論比3：1，H1：不符合。2、顯著水平：α＝0.053、計(jì)算χ2值：由于自由度df＝k-1＝1，所以χ2需要連續(xù)矯正。χ2＝0.0327+0.098＝0.13074、推斷：從卡方分布表中查得χ20.05(1)＝3.841，實(shí)得χ2<χ20.05(1)，結(jié)論是接受H0，即正常與白化的分離比符合理論比3：1。同時(shí)，該性狀在不同性別間無(wú)差異分布。表明該家系白化性狀遺傳模式符合常染色體單基因隱性遺傳的孟德?tīng)栠z傳定律，故可確定該巴馬香豬家系是一個(gè)呈單基因隱性遺傳的遺傳性白化家系。目前，已經(jīng)建立了遺傳關(guān)系清楚、連續(xù)傳代2代共148頭個(gè)體，白化表型符合孟德?tīng)栯[性遺傳模式的遺傳大家系。實(shí)施例2：家系特征分析正常巴馬香豬外貌顏色特征主要表現(xiàn)為兩頭黑、中間白(如圖1所示)，部分個(gè)體背腰部稍帶黑斑，額頭有白線或倒三角型白斑，俗稱“兩頭烏”、“芭蕉豬”。突變巴馬香豬外貌顏色特征表現(xiàn)為全身覆蓋白毛色(如圖2所示)。實(shí)施例3：家系基因定位眾多文獻(xiàn)表明，黑素皮質(zhì)素受體1(Melanocortin1Receptor,MC1R)基因在控制動(dòng)物黑色素合成的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，并被證實(shí)為控制動(dòng)物毛色的主效基因。因此，本研究對(duì)此白化巴馬香豬遺傳家系的MC1R候選基因外顯子測(cè)序，共檢測(cè)家系內(nèi)58個(gè)體頭，其中29頭白化個(gè)體、25頭正常個(gè)體、4頭表型正常的攜帶隱性遺傳基因個(gè)體，測(cè)序發(fā)現(xiàn)：29頭白化個(gè)體MC1R基因第894堿基處插入了兩個(gè)CC，且為純合突變，命名為--/--基因型；4頭表型正常的攜帶隱性遺傳基因個(gè)體也發(fā)現(xiàn)MC1R基因第894堿基處插入兩個(gè)CC，但為雜合突變，命名為--/CC基因型；25頭正常個(gè)體MC1R基因未發(fā)現(xiàn)突變，命名為CC/CC基因型。具體的檢測(cè)巴馬香豬隱性白化位點(diǎn)基因型測(cè)序方法如下：設(shè)計(jì)引物如下：正向引物F：5’-GGAGAGGAGGCTGCTGG-3’反向引物R：5’-TGGACACCTCCAGGCACT-3’用上述引物對(duì)在巴馬香豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：2×TaqUnicornPremix12.5μl，DNA(1/100)1.0μl，PrimerF2(10μM)0.5μl，PrimerR2(10μM)0.5μl，AddH2OTo25.0μl。PCR反應(yīng)程序：94℃4min；94℃20sec，57℃20sec，72℃20sec，20cycles；72℃3min；10℃。PCR產(chǎn)物純化、測(cè)序所得--/--基因型序列和CC/CC基因型序列分別如序列表中序列1和序列2所示；--/--基因型序列、--/CC和CC/CC基因型突變位點(diǎn)的測(cè)序峰圖如圖3所示(圖中由上至下分別對(duì)應(yīng)突變體純合、突變體雜合、以及野生型純合)。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的/優(yōu)選的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，其還可以對(duì)這些已描述的實(shí)施例做出若干替代或變型，而這些替代或變型方式都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表<110>深圳市金成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司<120>引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因及其應(yīng)用<130>16A100348JYC<160>2<210>1<211>110<212>DNA<213>人工序列<400>1ggagaggaggctgctggcttccctcagctccgcgcccccagccgccccccgcctcgggct60ggccgccaaccagaccaaccagacgggcccccagtgcctggaggtgtcca110<210>2<211>112<212>DNA<213>人工序列<400>2ggagaggaggctgctggcttccctcagctccgcgcccccagccgccccccccgcctcggg60ctggccgccaaccagaccaaccagacgggcccccagtgcctggaggtgtcca112當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3