本發(fā)明涉及全人源Enbrel Fab片段在昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)中的制備方法，屬于生物技術領域。

背景技術：

Enbrel(即依那西普，恩利)近年來全球最暢銷的生物藥，是首個獲FDA批準的全人源單克隆抗體藥物。是IgG分子的抗原結合片段(antigen-binding fragments,Fab片段)。Enbrel Fab片段是人單克隆抗體Enbrel的重鏈和輕鏈經(jīng)二硫鍵結合的二聚物，能特異性地與TNF-α結合從而阻斷其與p55、p75細胞表面的TNF-α受體的相互作用，用于治療類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)，銀屑病關節(jié)炎(psoriatic arthritis,PA)，強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)，和克羅恩病(Crohn's disease,CD)等疾病，并能緩解抗風濕性藥物(DMARD)治療無效的中至重度RA患者的體征和癥狀。

Fab是IgG分子的抗原結合片段，是由Fd片段與輕鏈通過二硫鍵結合形成的異二聚合體，因其相對分子質量小、有高度確定的完整性結構和免疫原性低等優(yōu)點成為IgG類抗體生產(chǎn)和改造的首選。由于Fab片段沒有Fc段，不需要進行復雜的糖基化和翻譯后修飾，所以不需要通過哺乳動物細胞系統(tǒng)來生產(chǎn)。而Bac-to-Bac昆蟲細胞表達系統(tǒng)與其他真核表達系統(tǒng)相比有許多優(yōu)勢：能高水平表達外源基因；大多數(shù)表達的重組蛋白可溶；能進行翻譯后的加工修飾：包括糖基化、磷酸化、酰基化、信號肽切除等；較容易分離純化；昆蟲細胞懸浮生長易放大培養(yǎng)，有利于大規(guī)模表達重組蛋白。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種在昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)中分泌共表達獲得重組Enbrel Fab片段的制備方法。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，通過利用昆蟲細胞作為宿主進行表達，可獲得具有生物活性的重組Enbrel Fab蛋白。

在此，本發(fā)明提供一種全人源單克隆抗體Enbrel Fab片段的制備方法，包括：

(a)將N端分別帶有信號肽的Fab片段的重鏈(heavy chain，Hc)與輕鏈(light chain，Lc)的氨基酸序列的基因克隆于帶有雙啟動子的桿狀病毒表達載體(優(yōu)選為pFastBacT1)內(nèi)構建重組表達載體；

(b)將所得的重組表達載體轉座至感受態(tài)細胞中，篩選重組菌斑，提取重組質粒，并將其轉染至昆蟲細胞中，得到重組桿狀病毒后進一步擴增病毒，并使用病毒感染放大培養(yǎng)的昆蟲細胞以表達Fab蛋白，離心收集含F(xiàn)ab蛋白的上清產(chǎn)物；

(c)將所得昆蟲細胞表達上清首先使用膜包進行超濾濃縮和置換緩沖溶液，然后色譜柱純化，即可得到全人源單克隆抗體Enbrel Fab片段。

本發(fā)明運用基因工程等技術手段，將帶有信號肽(例如Ac NPV gp64)的Fab片段的重鏈與輕鏈分別克隆至桿狀病毒載體(例如pFastBacT1)中，獲得重組質粒，將重組質粒轉座到感受態(tài)細胞(例如DH10Bac)中獲得重組Bacmid DNA，轉染昆蟲細胞(例如Sf9)獲得重組桿狀病毒，利用病毒感染昆蟲細胞，分泌共表達目的蛋白，離心收集含目的蛋白的上清產(chǎn)物。再進行色譜柱純化，得到有生物活性的Enbrel Fab蛋白。經(jīng)本發(fā)明方法獲得的全人源單克隆抗體Enbrel Fab片段經(jīng)分析顯示純度較高，且能特異性結合TNF-α，其抑制效果與標準品Enbrel(恩利)相似，說明本發(fā)明方法Fab片段保留了標準品恩利具備的抗原結合性和特異性；而該Fab片段分子量低易靶向作用于病灶，另外昆蟲細胞懸浮生長易放大培養(yǎng)，該Fab片段可以在昆蟲細胞中大規(guī)模表達生產(chǎn)，易于分離純化。

本發(fā)明中，選用昆蟲細胞桿狀病毒表達載體pFastBacT1共分泌表達，能容納大分子的插入片段，表達多種外源基因并可以高效并大量表達外源基因。通過添加外分泌信號肽可以分泌共表達Fab蛋白于昆蟲細胞上清中，利用胞外的氧化環(huán)境，能夠指導Fab重鏈和輕鏈間二硫鍵的形成。

較佳地，在步驟(a)中，所述重組表達載體為pFastBacT1，包括：兩個啟動子、復制子、多克隆酶切位點、和兩個終止子。

較佳地，在步驟(a)中，F(xiàn)ab片段的Lc與Hc的N端的信號肽為外分泌信號肽Ac NPV gp64。較佳地，F(xiàn)ab片段的重鏈和輕鏈的啟動子皆為多角體基因啟動子(polyhedrin(PH)promoter)。

較佳地，在步驟(b)中，所述感受態(tài)為DH10Bac。較佳地，轉座菌斑篩選方法為藍白斑篩選法。

較佳地，在步驟(b)中，所述昆蟲細胞為Sf9細胞。較佳地，轉染試劑可為脂質體cellfection，另外，轉染步驟中所用培養(yǎng)基可為Sf-900TMII SFM培養(yǎng)基。

較佳地，在步驟(b)中，所述重組桿狀病毒P0擴增病毒P1，即將200μL重組桿狀病毒P0加入100mL細胞密度為2×10⁶cells/ml的Sf9昆蟲細胞中，37℃搖床培養(yǎng)96h后離心獲得病毒P1。

較佳地，在步驟(b)中放大培養(yǎng)細胞并表達所用的培養(yǎng)基為ESF AF培養(yǎng)基。

較佳地，在步驟(c)中，所述純化依次包括：使用膜包進行超濾濃縮和置換緩沖溶液；以及親和層析和分子篩介質層析。

較佳地，在步驟(c)中，所述親和柱層析的親和層析介質為Protein A。

較佳地，在步驟(c)中，所述分子篩介質層析的分子篩層析介質為Superdex 75。

獲得純化的Fab蛋白后，可將其使用ELISA、和TNF-α的細胞中和活性方法驗證分析。較佳地，純化Fab對TNF-α的細胞中和活性分析可使用小鼠成纖維細胞L929細胞和Cell Counting Kit-8(CCK-8)。經(jīng)分析可知，本發(fā)明獲得的Fab蛋白能與抗原TNF-α特異性結合且抑制其效果，與標準品恩利相比無明顯差異，說明其具備與標準品恩利相同的抗體性質和特異性。由本發(fā)明的制備方法所制備的全人源單克隆抗體Enbrel Fab片段可用于治療由TNF-α升高引起的相關疾病主要包括類風濕性關節(jié)炎和癌癥。

附圖說明

圖1為Enbrel Fab抗體片段重組表達載體圖譜；

圖2為Protein A親和純化后的Fab SDS-PAGE電泳圖；其中的圖A為在非還原條件下電泳所得結果，圖B為還原條件下電泳所得結果；Fab為IgG1抗原結合區(qū)Hc和Lc二聚體，還原條件下為23kD兩條電泳條帶，非還原條件下在47kD處有單一電泳條帶；

圖3為分子篩層析純化后的Fab SDS-PAGE電泳圖，其中的圖A為在非還原條件下電泳所得結果，圖B為還原條件下電泳所得結果；

圖4為分子篩層析純化并濃縮后的Fab SDS-PAGE電泳圖，表明獲得的Fab抗體片段具有較高純度；

圖5為Western Blot檢測分子篩層析純化并濃縮后的圖。

具體實施方式

以下結合附圖和下述實施方式進一步說明本發(fā)明，應理解，附圖及下述實施方式僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

本發(fā)明運用基因工程等手段，利用桿狀病毒作為表達載體，利用昆蟲細胞作為宿主，表達Enbrel Fab片段。在一個示例中，本發(fā)明的制備方法包括：將分別帶有Ac NPV gp64信號肽的Fab片段的重鏈和輕鏈克隆至桿狀病毒載體pFastBacT1中，構建重組表達載體，將重組質粒轉座到感受態(tài)細胞DH10Bac中獲得重組Bacmid DNA并轉染至Sf9昆蟲細胞中獲得重組桿狀病毒，利用病毒感染sf9昆蟲細胞，分泌共表達Fab目的蛋白，離心獲得含目的蛋白的上清產(chǎn)物；對所得的蛋白進行色譜柱純化，得到Enbrel Fab蛋白。以下，示例性地說明本發(fā)明的制備方法。

(1)重組表達載體的構建

分別合成帶有信號肽的Fab片段的重鏈與輕鏈的基因，克隆于帶有雙啟動子的pFastBacT1載體內(nèi)，構建Enbrel Fab抗體片段重組表達載體(Fab in pFastBacT1)。

優(yōu)選地，在Hc和Lc的N端各加上一個外分泌信號肽Ac NPV gp64。

在一個示例中，Lc之前添加信號肽Ac NPV gp64形成AcNPV gp64+Lc in pFastBacT1。優(yōu)選地，利用5'BamHI和3'EcoRI插入于第一個啟動子之后。

在另一個示例中，在Hc之前添加信號肽Ac NPV gp64形成AcNPV gp64+Hc in pFastBacT1。優(yōu)選地，利用5'XhoI和3'HindIII插入于第二個啟動子之后。

所構建的Enbrel Fab抗體片段重組表達載體圖譜如圖1所示。由圖1可知，該重組表達載體包括：兩個昆蟲細胞啟動子、復制子、多克隆酶切位點和兩個終止子。

(2)Fab片段在昆蟲細胞中的表達

重組質粒的制備：將所構建的Enbrel Fab抗體片段重組表達載體轉座至感受態(tài)細胞(例如DH10Bac)中，篩選重組菌斑，提取重組質粒(重組Bacmid)。其中，轉座菌斑篩選方法可為藍白斑篩選法。

重組Bacmid轉染sf9昆蟲細胞，轉染試劑可為脂質體cellfection，培養(yǎng)基可為Sf-900^TMII SFM培養(yǎng)基，得到Fab-P0代病毒。轉染得到的P0代病毒進一步擴增病毒得到P1。在一個示例中，擴增方法為：將200μL重組桿狀病毒P0加入100mL細胞密度為2×10⁶cells/ml的Sf9昆蟲細胞中，37℃搖床培養(yǎng)96h后離心獲得病毒P1。使用P1感染昆蟲細胞表達Fab蛋白。

(3)Fab的純化

Fab蛋白的表達為可溶性外分泌表達，表達所用的培養(yǎng)基可為ESF AF培養(yǎng)基，病毒擴增感染細胞培養(yǎng)至細胞有感染跡象且細胞百分數(shù)80％左右時收集細胞懸液，離心機3000g 4℃下離心10min，收集上清溶液，使用Vivaflow 200切向流超濾膜包將上清進行濃縮并置換緩沖液，方便后續(xù)的分離與純化。然后進行色譜柱純化，獲得高純度的Fab片段。優(yōu)選地，依次通過親和柱層析和分子篩介質層析進行純化。在一個示例中，親和柱層析的親和層析介質為Protein A。在另一個示例中，分子篩介質層析的分子篩層析介質為Superdex 75。在純化過中，可以使用SDS-PAGE電泳分析蛋白純度?？梢允褂?0kD Milipore超濾管濃縮蛋白。

(分析與檢測)

可以使用SDS-PAGE電泳分析目的蛋白Fab片段。圖2、3分別示出經(jīng)親和柱層析、分子篩介質層析所獲得的蛋白的SDS-PAGE電泳圖，用以表征蛋白的純度。該兩幅圖中的圖A均為非還原條件，圖B均為還原條件。由圖2可知，F(xiàn)ab為IgG1抗原結合區(qū)Hc和Lc的二聚體，還原條件下在23kD處有兩條電泳條帶，從上至下分別為Hc和Lc，非還原條件下在47kD處有單一電泳條帶為Fab片段。圖4示出分子篩層析純化并濃縮后的Fab蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中泳道1樣品為非還原條件下處理，泳道2為還原條件下處理，由圖4可知縮后的Fab抗體片段的純度大于98％。圖5示出Western Blot檢測分子篩層析純化并濃縮后的Fab片段，檢測中使用HRP標記的羊抗人lgk特異性抗輕鏈抗體，其中泳道1中樣品為還原條件下處理，泳道2中樣品為非還原條件下處理。

可以使用ELISA測定純化的Enbrel Fab片段與抗原TNF-α特異性結合能力及抗體活性。Enbrel Fab抗體片段能與抗原TNF-α特異性結合，說明該Fab片段保留了標準品恩利具備的抗體性質和特異性。因此，根據(jù)本發(fā)明的制備方法所制備的Fab片段可應用于制備治療與TNF-α水平升高有關的疾病(例如類風濕性關節(jié)炎、癌癥等)的藥物。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有的優(yōu)點：

(1)本發(fā)明所制備的Fab片段分子量小，因此在到達腫瘤靶部位的過程中穿透力大；

(2)本發(fā)明所制備的Fab片段保留了全抗體對TNF-α的高特異性和高親和力，并且其半衰期較同類藥物長，可以減少藥物的使用次數(shù)；

(3)昆蟲細胞系統(tǒng)表達的重組蛋白具有完整的生物學功能，能正確折疊并形成Fab分子間重要的二硫鍵，表達產(chǎn)物在結構及功能上接近天然蛋白；

(4)能進行翻譯后的加工修飾：包括糖基化、磷酸化、?；?、信號肽切除等；

(5)與其他真核表達系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達系統(tǒng)可以高效表達外源基因，表達量高；

(6)能容納大分子的插入片段：桿狀病毒毒?？梢詳U大，能包裝大的基因片段并可以在昆蟲細胞中表達多種外源基因；

(7)純化過程中，使用親和層析-分子篩層析法純化獲得純度大于98％的抗體蛋白，是一種操作簡單方便，低成本，高產(chǎn)出的抗體片段純化制備方法；

(8)本發(fā)明提供了一種Enbrel Fab抗體片段的制備方法，為獲得高質量的單克隆抗體Fab片段奠定了基礎。

下面進一步例舉實施例以詳細說明本發(fā)明。同樣應理解，以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領域的技術人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質的改進和調整均屬于本發(fā)明的保護范圍。下述示例具體的工藝參數(shù)等也僅是合適范圍中的一個示例，即本領域技術人員可以通過本文的說明做合適的范圍內(nèi)選擇，而并非要限定于下文示例的具體數(shù)值。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

(1)重組質粒的構建

首先擴增基因Lc，添加信號肽AcNPV gp64(苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒)將基因AcNPV gp64+Lc克隆至載體pFastbacT1(Thermo Fisher Scientific)，構建質粒AcNPV gp64+Lc in pFastBacT1。然后從模板質粒Fab in pETDuet1(Shanghai Medicilon Inc.)中擴增基因Hc，添加信號肽AcNPVgp64，3’終止密碼子TAA，將基因AcNPV gp64+Hc克隆至載體pFastbacT1，構建質粒AcNPVgp64+Hc in pFastBacT1。最終從模板質粒Ac NPV gp64+Hc in pFastBacT1中擴增基因PH promoter+Ac NPV gp64+Hc，使用重組的方法將基因PH promoter+Ac NPV gp64+Hc克隆至載體AcNPV gp64+Lc in pFastBacT1，構建質粒Ac NPV gp64+Lc and Ac NPV gp64+Hc in pFastBacT1。

(2)Fab在Sf9昆蟲細胞中的表達

Sf9昆蟲細胞(Thermo Fisher scientific)在27℃，90rpm的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)。當Sf9昆蟲細胞濃度達到2.0×10⁶cells/ml時，以感染復數(shù)(MOI)為1pfu/cell的比例加入P2代病毒(即每升細胞加入20ml的P2病毒)，于27℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行病毒感染，培養(yǎng)基為ESF AF培養(yǎng)基(Expression Systems)。Fab蛋白的表達為可溶性外分泌表達，病毒擴增感染細胞培養(yǎng)至細胞有感染跡象且細胞百分數(shù)80％左右時收集細胞懸液，離心機3000g 4℃離心10min，收集細胞上清。

(3)Fab表達上清的濃縮與緩沖液置換

Fab蛋白的表達為可溶性外分泌表達，離心收集的上清溶液，使用Vivaflow 200切向流超濾膜包進行濃縮并置換緩沖液(50mmol/L Tris-HCl pH7.2，150mmol/L NaCl，10％Glycerol)，方便后續(xù)的分離與純化。

(4)色譜柱純化

第一步Protein A親和層析

1)色譜柱：親和層析介質：Protein A親和填料(GE.)；

2)Protein A親和柱的制備

3)樣品處理：將完成濃縮和置換緩沖溶液的上清溶液離心取上清；

4)緩沖液配置：緩沖液A：50mmol/L Tris-HCl pH7.2，150mmol/L NaCl，10％Glycerol，緩沖液B：0.1mol/L Glycine,pH 2.5；

5)純化過程：用緩沖液A預先平衡填料，樣品上樣后以緩沖液A平衡柱子，再用緩沖液B洗脫，Ep管收集并中和洗脫下的Fab蛋白至pH 7.0左右；

6)結果：收集目標蛋白峰，測蛋白濃度計算回收率，SDS-PAGE分析蛋白純度(圖2)。結果表明該蛋白純度為大于90％。

第二步分子篩層析

1)色譜柱：HiLoad 16/60Superdex 75prep grade，美國GE公司；

2)樣品處理：通過Protein A親和層析洗脫的目標蛋白利用截留分子量為30KD的超濾濃縮管濃縮至2-4ml；

3)緩沖液配置：緩沖液為50mmol/L Tris-HCl pH7.0，150mmol/L NaCl，10％Glycerol；

4)純化過程：用緩沖液預先平衡分子篩，上樣，以1ml/min進行洗脫；

5)結果：收集目標蛋白峰，樣品進行SDS-PAGE電泳(圖3)。結果表明該蛋白純度大于98％。

最后，對純化產(chǎn)物使用Millipore超濾系統(tǒng)超濾濃縮，截留分子量為30KD的再生纖維素膜包對純化后的蛋白質溶液進行脫鹽和濃縮，整個純化組合合理，操作簡單，工藝穩(wěn)定。SDS-PAGE分析蛋白純度(圖4)。Western Blot分析提取結果，恒壓下進行SDS-PAGE，結束后將膠卸下進行轉膜，60min結束后將膜從電轉槽中取出，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩1h，然后用含HRP標記的羊抗人lgk特異性抗輕鏈抗體的封閉液室溫下輕搖孵育1h，孵育結束后，用PBST漂洗膜后再浸洗3次，每次5～10min，之后使用ECL法顯色(圖5)。結果表明在昆蟲細胞中存在分泌表達的Enbrel Fab抗體Hc和Lc，且輕鏈與重鏈形成二硫鍵結合的異二聚體。