本發(fā)明涉及動物疫苗，具體地說，涉及一種乙型腦炎活疫苗的抗原及含有其的疫苗。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有豬用乙型腦炎疫苗的抗原生產(chǎn)方式包括兩種，一種是采用乙型腦炎強(qiáng)毒接種小鼠，收集感染小鼠腦組織，經(jīng)組織勻漿制備而成的抗原，該方法存在生物安全風(fēng)險高、雜蛋白多、不適于規(guī)?；a(chǎn)等問題；另一種是采用原代地鼠腎細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)疫苗弱毒株，該方法存在原代細(xì)胞制備工藝復(fù)雜、外源病毒控制難、批間差異大等問題，尤其是培養(yǎng)病毒毒價低，僅能達(dá)到5.5-7.0LgPFU/mL，增加了疫苗的生產(chǎn)成本。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種乙型腦炎活疫苗的抗原及其制備方法與應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：第一方面，本發(fā)明提供了一種乙型腦炎活疫苗的抗原，其制備方法包括如下步驟：1)在Vero細(xì)胞中接種已適應(yīng)Vero細(xì)胞的乙型腦炎病毒減毒株0.02～0.2MOI(PFU/細(xì)胞數(shù))，進(jìn)行吸附；2)添加pH7.6～7.8的病毒培養(yǎng)維持液進(jìn)行培養(yǎng)；所述病毒培養(yǎng)維持液為含有15～20mL/L的小牛血清、6～15g/L精氨酸鹽酸鹽、5～10g/LPEG2000和2.3～12g/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸，純水配置的DMEM溶液；3)待vero細(xì)胞出現(xiàn)60～80％病變，凍融收獲病毒液，澄清過濾去掉細(xì)胞碎片，收集上清病毒液，即得。作為優(yōu)選，所述病毒培養(yǎng)維持液的pH值為7.6，采用1M的NaOH調(diào)節(jié)，所述病毒培養(yǎng)維持液經(jīng)濾膜過濾除菌后使用。作為優(yōu)選，所述病毒培養(yǎng)維持液為含有20mL/L的小牛血清、10g/L精氨酸鹽酸鹽、5g/LPEG2000和5g/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸，純水配置的DMEM溶液。作為優(yōu)選，步驟1)中，在37℃、12～20轉(zhuǎn)/小時的條件下，吸附1h。步驟2)中，在35℃、12～20轉(zhuǎn)/小時的條件下，培養(yǎng)3～4天。上述條件，能夠更加有利于病毒吸附和穩(wěn)定。進(jìn)一步地，步驟1)中，用于接種減毒株的Vero細(xì)胞的制備方法為：采用含體積百分比8％小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)Vero細(xì)胞，待Vero細(xì)胞形成單層，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，以pH7.4的PBS清洗3次，棄掉洗液，即得。進(jìn)一步地，步驟1)中，所述已適應(yīng)Vero細(xì)胞的乙型腦炎病毒減毒株為經(jīng)Vero細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，毒價大于7LgPFU/mL，且傳代次數(shù)較少的減毒株。作為優(yōu)選，進(jìn)行Vero細(xì)胞傳代培養(yǎng)的乙型腦炎病毒減毒株為SA14-14-2株，可購自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司銷售的豬乙型腦炎活疫苗(SA14-14-2株)，經(jīng)Vero細(xì)胞傳代培養(yǎng)即可獲得。第二方面，本發(fā)明提供了前述抗原在制備乙型腦炎疫苗中的應(yīng)用。需要說明的是，所述疫苗可采用本領(lǐng)域常規(guī)的疫苗制備方法進(jìn)行，但只要使用了本發(fā)明所述的抗原進(jìn)行疫苗的制備，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。第三方面，本發(fā)明提供了一種含有前述抗原的豬用乙型腦炎活疫苗。進(jìn)一步地，其由所述抗原與凍干保護(hù)劑混合后經(jīng)真空冷凍干燥制備。每頭份病毒含量不低于105.0PFU。所述真空冷凍干燥的程序?yàn)椋侯A(yù)凍階段－40℃，疫苗達(dá)到最低溫度后維持時間2小時；升華干燥階段疫苗最終溫度－20℃，達(dá)到疫苗最終溫度時運(yùn)行時間17小時，凍干箱真空控制壓力為0.18mbar；解析干燥階段疫苗的最終溫度28℃，凍干箱真空壓力為0.005mbar，運(yùn)行時間8小時。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種乙型腦炎活疫苗的抗原及其制備方法與應(yīng)用，采用Vero細(xì)胞進(jìn)行乙型腦炎病毒減毒株(SA14-14-2株)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，使用了含有4-羥乙基哌嗪乙磺酸、精氨酸鹽酸鹽、PEG2000等成分的病毒培養(yǎng)維持液，所生產(chǎn)得到的抗原，具有批間差異小、免疫原性好、毒價高等優(yōu)勢，以該抗原制備的豬乙型腦炎活疫苗能有效預(yù)防豬的乙型腦炎病毒感染。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例子來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例子僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1適應(yīng)Vero細(xì)胞乙型腦炎病毒減毒株的制備及免疫原性研究(1)病毒的適應(yīng)性傳代用含8％小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液制備Vero細(xì)胞懸液，按照分種率1：3接種培養(yǎng)瓶，37℃，5％CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞形成致密單層(約培養(yǎng)48小時)，用于接毒。接毒前將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液倒凈，用pH7.4的PBS清洗3次，最后一次洗滌后將殘液控凈，然后按照培養(yǎng)液體積的5％接種乙型腦炎病毒減毒株(SA14-14-2)。接毒后于37℃吸附90分鐘。吸附完畢，加入含2％小牛血清DMEM維持液，于35℃培養(yǎng)。逐日觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到75％時終止培養(yǎng)，凍融后收獲病毒記作F1待，按此方法將乙腦病毒減毒株連續(xù)傳代10代，測定各代次毒價。(2)病毒毒價的測定采用含2％小牛血清DMEM對各代次病毒液進(jìn)行10倍系列稀釋，接種24孔細(xì)胞板培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞單層，0.1mL/孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中吸附60min，每隔30分鐘輕搖板1次。吸附結(jié)束后將培養(yǎng)板倒置，控干孔內(nèi)殘余毒液，然后每孔加入含1.5％甲基纖維素、2％小牛血清的DMEM維持培養(yǎng)基2mL，覆蓋細(xì)胞單層，置入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)5～6天進(jìn)行固定染色，每孔加入含1％結(jié)晶紫，20％甲醇的固定染色劑0.5mL，室溫放置20分鐘，然后棄去染色劑，用清水漂洗1次，控干水分，置培養(yǎng)板于干燥通風(fēng)處陰干。固定染色細(xì)胞板上的正常細(xì)胞著色呈藍(lán)紫色，病變區(qū)域細(xì)胞不著色或?yàn)榈{(lán)色。在低倍顯微鏡鏡下計數(shù)各孔的蝕斑數(shù)，計算出某個稀釋度的平均蝕斑數(shù)(PFU)，根據(jù)公式計算檢測樣品的蝕斑含量。樣品蝕斑含量(LgPFU/mL)＝Lg某稀釋度平均蝕斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。結(jié)果，乙型腦炎病毒減毒株SA14-14-2在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代后，逐步適應(yīng)，毒價呈現(xiàn)逐代增高的趨勢，在F8-F10待達(dá)到穩(wěn)定，將此代次范圍內(nèi)的病毒液作為乙腦病毒減毒株抗原制備的毒種。表1：乙型腦炎病毒減毒株在Vero細(xì)胞上的適應(yīng)性傳代毒價變化(3)毒種的純凈性及免疫原性試驗(yàn)純凈性檢驗(yàn)：參照《中華人民共和國獸藥典》方法進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)。免疫原性實(shí)驗(yàn)：選擇Vero細(xì)胞培養(yǎng)的F8、F9、F10代乙腦病毒液以及原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)的乙腦病毒液(記作PHK-SA14-14-2)，用2％血清DMEM進(jìn)行10倍系列稀釋，每代毒種取10－2、10－3和10－4三個稀釋度，每稀釋度皮下接種10～12g小白鼠10只，0.1mL/只，免疫一次，全部小白鼠于免疫后14日用乙型腦炎強(qiáng)毒P3株腹腔攻擊，每只小白鼠腹腔注射0.3mL(不低于500*LD50)，腹腔攻擊同時每只腦內(nèi)空刺，破壞血腦屏障，另設(shè)同批次對照小白鼠10只，不進(jìn)行免疫，但與免疫組一起進(jìn)行攻毒。攻毒后3日內(nèi)死亡不計，其余觀察14天，對照組小白鼠應(yīng)出現(xiàn)腦炎綜合癥，80％以上死亡，14天后計算各免疫組半數(shù)有效劑量(ED50)。根據(jù)各免疫組的半數(shù)有效劑量計算出半數(shù)保護(hù)劑量，半數(shù)保護(hù)劑量＝毒種毒價×半數(shù)有效劑量。結(jié)果，F(xiàn)8、F9、F10代Vero細(xì)胞培養(yǎng)乙腦病毒液無細(xì)菌、霉菌、支原體和外源病毒污染。免疫原性與原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)的病毒半數(shù)保護(hù)劑量相當(dāng)，均符合對小白鼠的半數(shù)保護(hù)劑量≤1000PFU的要求。表2：乙型腦炎病毒減毒株的純凈性及免疫原性試驗(yàn)結(jié)果序號病毒種類無菌檢驗(yàn)支原體檢驗(yàn)外源病毒檢驗(yàn)半數(shù)有效劑量1F8陰性陰性陰性192F9陰性陰性陰性213F10陰性陰性陰性194PHK-SA14-14-2陰性陰性陰性21實(shí)施例2采用3L轉(zhuǎn)瓶制備乙型腦炎活疫苗病毒液(抗原)(1)抗原的制備技術(shù)方案1：采用3L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)Vero，培養(yǎng)基為含8％小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，待Vero細(xì)胞形成單層，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，以pH7.4的PBS清洗3次，棄掉PBS洗液；接種適應(yīng)Vero細(xì)胞的F8代乙型腦炎病毒減毒株(SA14-14-2株)0.2MOI(PFU/細(xì)胞數(shù))，轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為12轉(zhuǎn)/小時，37℃吸附1h；添加0.22ul濾膜過濾除菌pH7.6的DMEM溶液(含有20mL/L的小牛血清、10g/L精氨酸鹽酸鹽、5g/LPEG2000和5g/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸)，35℃條件下恒溫培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為12轉(zhuǎn)/小時；約3～4d，細(xì)胞出現(xiàn)75％病變，凍融一次收獲病毒液，澄清過濾去掉細(xì)胞碎片，收集上清病毒液。按此方法制備疫苗抗原3批。技術(shù)方案2：病毒維持液選用0.22ul濾膜過濾除菌后pH7.6含有2％小牛血清的DMEM溶液，其他同技術(shù)方案1，按此方法制備疫苗抗原3批。技術(shù)方案3：按照豬乙型腦炎活疫苗(SA14-14-2株)生產(chǎn)與檢驗(yàn)規(guī)程，采用原代地鼠腎細(xì)胞生產(chǎn)乙型腦炎活疫苗抗原3批。(2)毒價的測定參考實(shí)施例1的毒價測定方法進(jìn)行。結(jié)果，以技術(shù)方案1制備的3批抗原毒價分別達(dá)到7.90、8.04、7.85LgPFU/mL，各批次毒價差異較小；技術(shù)方案2，采用了常規(guī)病毒培養(yǎng)液，制備的3批抗原毒價也可以達(dá)到7.2LgPFU/mL以上；技術(shù)方案3，采用原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)的抗原毒價較低，且批間差異較大，由此可見技術(shù)方案1效果最好。(3)純凈性檢驗(yàn)參照《中華人民共和國獸藥典》方法進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)。結(jié)果，采用技術(shù)方案1、技術(shù)方案2、技術(shù)方案3制備的9批抗原，均無細(xì)菌、霉菌、支原體、外源病毒污染。表3：3L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)乙型腦炎活疫苗抗原毒價和純凈性檢測結(jié)果實(shí)施例3采用15L轉(zhuǎn)瓶制備豬用乙型腦炎活疫苗(1)抗原的制備采用15L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)Vero細(xì)胞，培養(yǎng)基為含8％小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，待Vero細(xì)胞形成單層，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，以pH7.4的PBS清洗3次，棄掉PBS洗液；接種Vero細(xì)胞的F8代乙型腦炎病毒減毒株(SA14-14-2株)0.02MOI(PFU/細(xì)胞數(shù))，轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為20轉(zhuǎn)/小時，37℃吸附1h；添加pH7.8的病毒培養(yǎng)維持液DMEM(含20mL/L的小牛血清、10g/L精氨酸鹽酸鹽、5g/LPEG2000和5g/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸)，35℃條件下恒溫培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為20轉(zhuǎn)/小時；待細(xì)胞出現(xiàn)75％病變，凍融一次收獲病毒液，澄清過濾去掉細(xì)胞碎片，收集上清病毒液。按此方法制備制備乙腦疫苗抗原3批。(2)抗原毒價的測定抗原毒價測定方法同實(shí)施例1的毒價測定方法。結(jié)果，制備的3批抗原毒價分別達(dá)到8.00、7.95、7.76LgPFU/mL。(3)抗原的安全性檢驗(yàn)方法1：皮下感染致病力將病毒抗原皮下接種10～12g小白鼠10只，每只注射0.1mL，同時進(jìn)行腦內(nèi)空刺，3日內(nèi)死亡數(shù)不得超過2只，其余小白鼠繼續(xù)觀察14日，應(yīng)全部健活。方法2：將病毒抗原以107.0PFU的劑量耳后肌肉注射40～45日齡乙腦中和抗體陰性仔豬4頭，觀察14日，仔豬應(yīng)無不良反應(yīng)。結(jié)果各批次抗原接種小鼠全部健活，接種仔豬無不良反應(yīng)。表4：15L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)乙型腦炎活疫苗抗原毒價及安全性檢驗(yàn)結(jié)果(4)疫苗的制備及毒價測定將15L轉(zhuǎn)瓶Vero細(xì)胞制備的1506001批疫苗抗原與凍干保護(hù)劑(保護(hù)劑組分為明膠12g/L，蔗糖100g/L，海藻糖50g/L，PVP(K90)2.5g/L，甘露醇5g/L，谷氨酸鈉10g/L，完全溶解后加入純水至1L，并用1N的鹽酸調(diào)pH值至7.5，經(jīng)116℃，30分鐘高壓蒸汽滅菌)按照1:1混合，分裝至7mL青瓶中，每瓶2mL。進(jìn)行真空冷凍干燥，凍干程序?yàn)椋侯A(yù)凍階段－40℃，疫苗達(dá)到最低溫度后維持時間2小時；升華干燥階段疫苗最終溫度－20℃，達(dá)到疫苗最終溫度時運(yùn)行時間17小時，凍干箱真空控制壓力為0.18mbar；解析干燥階段疫苗的最終溫度28℃，凍干箱真空壓力為0.005mbar，運(yùn)行時間8小時。軋蓋密封。疫苗命名為豬乙型腦炎傳代細(xì)胞活疫苗，批號為CP-150601。采用無菌純水將凍干疫苗溶解后進(jìn)行毒價測定，方法同實(shí)施例1。結(jié)果，經(jīng)換算后凍干疫苗毒價為7.80LgPFU/mL，凍干過程疫苗抗原毒價損失較小，僅為0.2LgPFU/mL。(5)疫苗對豬的安全性實(shí)驗(yàn)40-45日齡乙腦抗體陰性仔豬8頭分為2組每組4頭，一組為免疫組，頸部肌肉接種豬乙型腦炎傳代細(xì)胞活疫苗(批號：CP-150601)，接種劑量為107.0PFU/頭；另一組為對照組，頸部肌肉注射pH7.4PBS1mL。接種后觀察14天，每天上午飼喂之前測量體溫1次；接種0、1、2、3天采集血漿，采用《GB22333-2008-T日本乙型腦炎病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法》測定乙腦病毒血癥。結(jié)果，接種豬乙型腦炎傳代細(xì)胞活疫苗的4頭豬，觀察期內(nèi)無異常臨床癥狀，注射部位無炎癥病變，體溫正常，未出現(xiàn)病毒血癥，說明疫苗安全。(6)疫苗對豬的免疫原性試驗(yàn)40-45日齡乙腦抗體陰性仔豬10頭分為A、B兩組，每組5頭，A組為免疫組，頸部肌肉接種稀釋的豬乙型腦炎傳代細(xì)胞活疫苗(批號：CP-150601)5.0LgPFU/mL，每頭注射1mL；B組為對照組，肌肉接種pH7.4PBS1mL。接種后28天，兩組動物，每頭皮下注射5×106LD50乙腦病毒強(qiáng)毒P3株，于攻毒后第1、2、3天采集所有仔豬血漿樣本，采用《GB22333-2008-T日本乙型腦炎病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法》測定乙腦病毒血癥，其中任一天檢測出病毒血癥即判為乙腦病毒感染。結(jié)果，接種5.0LgPFU豬乙型腦炎傳代細(xì)胞活疫苗即可保護(hù)豬抵抗乙腦強(qiáng)毒的攻擊，說明該疫苗對豬有較好的免疫攻毒保護(hù)作用。表5：仔豬免疫攻毒試驗(yàn)病毒血癥檢出情況雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3