本發(fā)明涉及微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于捕獲和鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流控芯片。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC,Circulating Tumor Cell)，是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，因自發(fā)或者診療操作從實體瘤病灶(原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)脫落，大部分CTC進(jìn)入外周血后發(fā)生凋亡或者被吞噬，少數(shù)能夠逃逸并錨著發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶，增加惡性腫瘤患者死亡風(fēng)險。近年來的研究表明，CTC存在與否及數(shù)量多少是癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)，檢測和跟蹤外周血中CTC的數(shù)量有助于對患者進(jìn)行早期篩查、療效監(jiān)控、預(yù)后判斷和復(fù)發(fā)預(yù)測。

目前，最常用的CTC檢測方法是利用EpCAM(上皮細(xì)胞黏附分子)抗體免疫磁珠與細(xì)胞表面EpCAM蛋白的結(jié)合來富集CTC，再對癌細(xì)胞表面特異性蛋白進(jìn)行免疫標(biāo)記來鑒定。唯一被美國FDA認(rèn)證批準(zhǔn)的CellSearch就是利用該方法對CTC進(jìn)行檢測的，其檢測過程包括樣品孵育，細(xì)胞分離，免疫熒光標(biāo)記和人工鑒定這幾個主要步驟。許多實驗室為了避免采用昂貴的CellSearch系統(tǒng)，研究人員嘗試?yán)迷嚬艿攘畠r儀器進(jìn)行人工分離和計數(shù)。

多年的實驗室和臨床研究證實了上述這類的方法的有效性，但依然有三類問題有待解決:A.較大的處理腔室影響了富集效率；B.不同腔室間的樣品轉(zhuǎn)移過程損失細(xì)胞；C.人工鑒定判讀標(biāo)準(zhǔn)不一；D.檢測時間過長。前三類問題影響了CTC技術(shù)精確性，后兩類問題阻礙了CTC檢測技術(shù)的臨床推廣。

微流控技術(shù)的出現(xiàn)為CTC檢測提供了新的手段，微流控技術(shù)可以精確控制細(xì)胞以及細(xì)胞所處的環(huán)境(流場、磁場、電場等)，也可以將多個功能集成在一起以盡量避免細(xì)胞損失。因此，研究者已經(jīng)通過設(shè)計特殊流道及納米表面，控制磁場，集成片上熒光染色，結(jié)合cofocal等方法來提高富集效率，避免細(xì)胞損失和提升鑒定準(zhǔn)確率。甚至還通過檢測細(xì)胞尺寸大小，電學(xué)特性等方法，演示了無需抗體的檢測。但目前臨床實踐中最迫切需求的是：1)不受人工判讀影響的準(zhǔn)確計數(shù)；2)快速的自動化檢測。雖然微流控技術(shù)已經(jīng)在各個方面都展示了優(yōu)良的性能，但尚無一個芯片能夠同時滿足上述兩個臨床要求。

目前，關(guān)于微流控芯片中的細(xì)胞計數(shù)主要涉及到以下三類技術(shù)：

1、利用熒光顯微鏡進(jìn)行人工計數(shù)：用微流控芯片對CTC進(jìn)行捕獲，再通過熒光顯微鏡進(jìn)行人工計數(shù)。由于該技術(shù)需要樣品在不同腔室之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，造成難以預(yù)計的細(xì)胞損失，再加上人工判讀標(biāo)準(zhǔn)不一，導(dǎo)致計數(shù)精度不高。

2、利用流式細(xì)胞儀或者共聚焦熒光顯微鏡等進(jìn)行自動計數(shù)：借助微流控芯片進(jìn)行CTC捕獲，在通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行精確計數(shù)。該技術(shù)避免了人工判讀標(biāo)準(zhǔn)不一帶來的計數(shù)誤差，但是不同腔室間的樣品轉(zhuǎn)移依然無法避免，細(xì)胞損失不可預(yù)計。進(jìn)行自動計數(shù)，雖然避免了樣品損失和人工判讀，但由于設(shè)備價格昂貴，一般實驗室很難接受，普及難度高。

3、利用電場進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。通過在微流控芯片中設(shè)計相應(yīng)的測量電極，當(dāng)細(xì)胞通過芯片通道時，不同細(xì)胞在電場下的阻抗或者電導(dǎo)率不同，產(chǎn)生不同的波峰，以此達(dá)到對目的細(xì)胞的計數(shù)目的。

目前，尚無能夠?qū)TC捕獲、鑒定及計數(shù)集成于一體的技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種集成化、多功能微流控芯片，該芯片具有多層結(jié)構(gòu)和多個功能區(qū)，可以進(jìn)行血液雜質(zhì)過濾、CTC捕獲和定位，并實現(xiàn)對定位細(xì)胞的原位熒光標(biāo)記和鑒定。

本發(fā)明的另一目的是提供一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲、鑒定和自動化計數(shù)系統(tǒng)及應(yīng)用方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明用于捕獲和鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流控芯片，其包括：依次疊放在一起并相互密封的三層結(jié)構(gòu)，由上至下分別為微閥控制層、微閥薄膜層以及帶有多個功能區(qū)的基板。

所述微閥控制層上設(shè)有六個貫通控制層的孔以及三條氣體通道；其中，三個孔為加樣孔，連通基板，用于樣品和試劑流入和流出；其余三個孔分別連接三條氣體通道，用于注入氣體，控制微閥的開啟與閉合。

所述微閥薄膜層上設(shè)有三個貫通薄膜層的孔，分別與上述微閥控制層的三個加樣孔對應(yīng)連通。

所述基板上設(shè)有三個功能區(qū)，呈“品”字型排布，分別為雜質(zhì)過濾區(qū)、細(xì)胞分離區(qū)以及單細(xì)胞定位和熒光鑒定區(qū)；所述三個功能區(qū)由三條主流體通道連通，每條主流體通道的開啟與閉合由單獨的氣體微閥控制；其中，所述雜質(zhì)過濾區(qū)包括前、中、后三個區(qū)域，入口處分為兩條分支流道，用于樣品分流，過濾區(qū)內(nèi)設(shè)置有陣列化平行排布的微柱，不同區(qū)域相鄰兩微柱之間間隔不同；所述細(xì)胞分離區(qū)為一條漸寬的微流體通道，通道寬度從入口至出口逐漸加寬；所述單細(xì)胞定位和熒光鑒定區(qū)，入口處分為兩條分支流道，用于樣品分離，該功能區(qū)內(nèi)設(shè)置有陣列化平行排布的V形或U形定位單元，用于單細(xì)胞的捕獲定位及熒光鑒定。

所述微閥控制層厚度為2-5毫米，所述氣體通道深度為30-100微米。優(yōu)選地，所述微閥控制層厚度為5毫米，所述氣體通道深度為30微米。

所述微閥薄膜層的厚度為30-50微米。

所述基板上雜質(zhì)過濾區(qū)的微柱高度為20-30微米，直徑為10-40微米。所述微柱為高度20微米，直徑40微米的圓柱體。

在所述雜質(zhì)過濾區(qū)的前、中、后三個區(qū)域，相鄰兩個微柱的間距分別為100微米、50微米和32微米。優(yōu)選所述雜質(zhì)過濾區(qū)共布置有約1500個微柱。

所述基板上細(xì)胞分離區(qū)的微流體通道，其深度為20微米，入口(最窄處)寬度為1毫米，出口(最寬處)寬度為7毫米，從入口到出口流道寬度逐漸變寬。

所述基板上單細(xì)胞定位和熒光鑒定區(qū)，其V形定位單元的高度為20-30微米，最大開口15微米，最小開口3微米，相鄰兩個定位單元行間距為35微米，列間距為40微米，前后定位單元采用交替式陣列排布。優(yōu)選地，每個V形定位單元整體長25微米，寬20微米。更優(yōu)選地，所述單細(xì)胞定位和熒光鑒定區(qū)共布置有約6000個V形定位單元。

所述微閥控制層由透明材質(zhì)制成，所述透明材質(zhì)包括玻璃、PDMS。所述微閥薄膜層由PDMS材料制成，在氣體通道對應(yīng)的薄膜層區(qū)域，在氣壓控制下可發(fā)生彎曲形變。所述基板的材質(zhì)為硅或硅-玻璃。

由于對細(xì)胞進(jìn)行鑒定時，需要光線透過微閥控制層和微閥薄膜層，所以微閥控制層和微閥薄膜層需要采用透明材質(zhì)；同時，控制層和薄膜層需要制作流體進(jìn)入和流出的接口，所以需要能夠開孔；另外，由于是通過氣體擠壓薄膜產(chǎn)生彎曲形變，達(dá)到微閥開關(guān)的目的，所以微閥薄膜層材質(zhì)必須是彈性較好的軟材料；最后，控制層需要和薄膜層封接在一起，并且實現(xiàn)密封，所以材質(zhì)的選擇上要考慮和薄膜層的兼容性。優(yōu)選的材料是那些可以通過蒸鍍、切割及熱塑成型制成特定規(guī)格及形狀的材料。特別優(yōu)選的是較薄并透明的聚合物。微閥控制層和微閥薄膜層的外廓尺寸應(yīng)與基板相匹配。

本發(fā)明還提供循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲、鑒定和自動化計數(shù)系統(tǒng)，包括上述微流控芯片，熒光探針，熒光顯微鏡(熒光成像系統(tǒng))、自主開發(fā)的圖像分析軟件(分析計數(shù)系統(tǒng))，泵，單片機(jī)控制的氣壓控制裝置等。

本發(fā)明還提供一種用于鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的上述微流控芯片，以及設(shè)在盒體內(nèi)的熒光探針，所述熒光探針為多種帶有熒光標(biāo)記的抗體或多肽，所述抗體或多肽可識別腫瘤細(xì)胞表面特定的抗原。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲、鑒定和自動化計數(shù)的方法，包括以下步驟：

S1、將癌癥患者血液與結(jié)合有上皮細(xì)胞黏附因子(EpCAM)抗體的免疫磁珠混合孵育之后，通過微泵注入到微流控芯片中，同時關(guān)閉單細(xì)胞定位及熒光鑒定模塊微閥，打開雜質(zhì)過濾和細(xì)胞分離模塊微閥。當(dāng)血液流經(jīng)雜質(zhì)過濾模塊時，由于尺寸大小作用，血液中不同尺寸的雜質(zhì)(大于32微米)會被微柱阻擋在該模塊，而尺寸較小的血細(xì)胞則很容易流入下一模塊。

S2、經(jīng)微柱過濾過的血液進(jìn)入細(xì)胞分離模塊時，血液中與免疫磁珠特異結(jié)合的EpCAM陽性細(xì)胞在磁場(所述磁場來自于外加磁鐵)作用下將會被捕獲在微流道中，其他血細(xì)胞將隨著血液流動從細(xì)胞分離區(qū)流出并被收集。

S3、當(dāng)全部血液全都注入到微流控芯片之后，關(guān)閉雜質(zhì)過濾模塊微閥，打開定位模塊微閥，從細(xì)胞分離模塊的出口注入磷酸緩沖溶液，將該模塊中被捕獲的細(xì)胞沖到下一模塊中，即單細(xì)胞定位及熒光鑒定模塊。進(jìn)入這一模塊的細(xì)胞將被V形捕獲結(jié)構(gòu)以單細(xì)胞形式捕獲、定位。之后，再向該模塊通入多種帶有熒光標(biāo)記的抗體或多肽，抗體(或多肽)會和某些細(xì)胞表面特定的抗原(或蛋白)結(jié)合，使用熒光顯微鏡從芯片正面對整個定位模塊進(jìn)行全覆蓋自動化熒光成像，獲取熒光圖像。利用自主研發(fā)的圖像處理軟件，對獲取的熒光圖像進(jìn)行自動化分析，從而得到癌癥患者血樣中CTC的數(shù)目。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

(一)實現(xiàn)了對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的精確捕獲、鑒定和自動化計數(shù)。首先，與傳統(tǒng)技術(shù)相比，本發(fā)明通過設(shè)計寬度逐漸增加的微流道來分離血液中的CTC，由于樣品需要在僅有20微米深的微流道中流動，其所受到的磁場力高于傳統(tǒng)方式，更多的細(xì)胞將會被捕獲到。同時，樣品在微流道中的流速從入口到出口逐漸減慢，使得結(jié)合有不同磁珠數(shù)量的EpCAM陽性細(xì)胞可以在流道的不同地方被捕獲且分布均勻；另外，從樣品準(zhǔn)備到CTC自動化計數(shù)，所有操作均在芯片上執(zhí)行，避免了樣品在不同腔室間的轉(zhuǎn)移帶來的不可預(yù)計的細(xì)胞損失；最后，通過自主開發(fā)用于CTC計數(shù)的自動化分析軟件，采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)對熒光圖像中的細(xì)胞進(jìn)行自動化鑒定和計數(shù)，避免了人工鑒定和計數(shù)帶來的人為誤差。這些都大大提高了細(xì)胞計數(shù)的精確度。

(二)實現(xiàn)了對樣品高通量快速處理。本發(fā)明自動化程度高，從樣品注入到熒光成像再到圖像處理，整個過程自動化，大大減少了人工操作，節(jié)省了大量的人力和時間。另外，本發(fā)明引入了微流控技術(shù)，利用微加工技術(shù)可以根據(jù)需要設(shè)計多個并聯(lián)的功能區(qū)，可以大大提高處理速度和通量。

(三)本發(fā)明設(shè)計的芯片及相應(yīng)系統(tǒng)適用范圍廣。本發(fā)明中所涉及的微柱陣列、V形捕獲陣列，其尺寸可以根據(jù)不同的細(xì)胞進(jìn)行調(diào)整，靈活程度高，且不增加成本。

附圖說明

圖1為本發(fā)明用于捕獲和鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流控芯片的結(jié)構(gòu)分解示意圖。

圖2為本發(fā)明微流控芯片所對應(yīng)三層結(jié)構(gòu)的俯視角度透視圖。

圖3為圖1中三層結(jié)構(gòu)封裝后的俯視角度透視圖。

圖4為圖1中基板三個功能區(qū)的局部結(jié)構(gòu)放大圖。

圖5為本發(fā)明微流控芯片的基板上雜質(zhì)過濾、細(xì)胞分離、單細(xì)胞捕獲定位及鑒定的流程示意圖。

圖1-圖5僅為示意圖，未按實際比例繪制。圖中，1-微閥控制層；2-微閥薄膜層；3-帶有三個功能區(qū)的基板；4,5,6-樣品出入口；7,8,9-氣體入口；10-雜質(zhì)過濾模塊(雜質(zhì)過濾區(qū))；11-細(xì)胞分離模塊(細(xì)胞分離區(qū))；12-單細(xì)胞定位及鑒定模塊(單細(xì)胞定位和熒光鑒定區(qū))；13-氣體通道；14-用于雜質(zhì)過濾的微柱；15-分離區(qū)流道中分離的細(xì)胞；16-用于單細(xì)胞定位的V形定位結(jié)構(gòu)單元；17-定位在V形結(jié)構(gòu)中的單細(xì)胞。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實施例1用于捕獲和鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流控芯片

本實施例提供的用于捕獲和鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流控芯片，包括：依次疊放在一起并相互密封的三層結(jié)構(gòu)，由上至下分別為微閥控制層、微閥薄膜層以及帶有多個功能區(qū)的基板。

1、微閥控制層和微閥薄膜層

微閥控制層上設(shè)有六個貫通控制層的孔以及三條氣體通道；其中，三個孔為加樣孔，連通基板，用于樣品和試劑流入和流出；其余三個孔分別連接三條氣體通道，用于注入氣體，控制微閥的開啟與閉合。

微閥薄膜層上設(shè)有三個貫通薄膜層的孔，分別與上述微閥控制層的三個加樣孔對應(yīng)連通。

微閥控制層和微閥薄膜層的外廓尺寸應(yīng)與基板相匹配。

圖1和圖5所示的微流控芯片，微閥控制層和微閥薄膜層均采用PDMS(聚二甲基硅氧烷)材料，通過軟光刻技術(shù)獲得需要的控制層氣體通道和薄膜厚度，二者采用鍵合的方式密封連接。在其它的實施方法中，微閥控制層也可以采用玻璃材料，利用濕法刻蝕或者激光刻蝕等技術(shù)獲得氣體通道，再通過鍵和的方式將二者封接在一起。

圖1和圖5所示的微流控芯片，微閥控制層的厚度為5000微米，氣體通道的深度為30～100微米，微閥薄膜層的厚度為30～50微米，這是有效控制微閥開關(guān)的最優(yōu)范圍。當(dāng)需要微閥控制開關(guān)的流道長度、寬度以及深度發(fā)生變化時，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要自行選擇合適的氣體通道和微閥薄膜尺寸。

2、帶有微柱陣列和V形定位陣列的基板

本實施例中，所述基板上設(shè)有三個功能區(qū)，呈“品”字型排布，分別為雜質(zhì)過濾區(qū)、細(xì)胞分離區(qū)以及單細(xì)胞定位和熒光鑒定區(qū)；所述三個功能區(qū)由三條主流體通道連通，每條主流體通道的開啟與閉合由單獨的氣體微閥控制；其中，所述雜質(zhì)過濾區(qū)包括前、中、后三個區(qū)域，入口處分為兩條分支流道，用于樣品分流，過濾區(qū)內(nèi)設(shè)置有陣列化平行排布的微柱，不同區(qū)域相鄰兩微柱之間間隔不同；所述細(xì)胞分離區(qū)為一條漸寬的微流體通道，通道寬度從入口至出口逐漸加寬；所述單細(xì)胞定位和熒光鑒定區(qū)，入口處分為兩條分支流道，用于樣品分離，該功能區(qū)內(nèi)設(shè)置有陣列化平行排布的V形或U形定位單元，用于單細(xì)胞的捕獲定位及熒光鑒定。

微柱陣列是用來過濾血液中不同尺寸大小的雜質(zhì)，V形捕獲結(jié)構(gòu)單元陣列則是用來對單個細(xì)胞進(jìn)行捕獲定位的，兩者都與細(xì)胞尺寸相關(guān)，是芯片有效進(jìn)行精確計數(shù)的關(guān)鍵部件。為了適應(yīng)細(xì)胞的尺寸，必須選擇能夠兼容現(xiàn)有微加工技術(shù)的材料。在圖4所示的優(yōu)選實施例中，選擇硅作為基板微結(jié)構(gòu)陣列的材料，是因為硅可以很好的兼容基于光刻和腐蝕的微加工工藝，而且加工精度易于控制，從而可以很容易的獲得和細(xì)胞尺寸相符的捕獲陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)需求選擇玻璃、PDMS等可加工的材料。需注意的是，為了實現(xiàn)快速、精確的自動化計數(shù)，該基板集成了雜質(zhì)過濾區(qū)、細(xì)胞分離區(qū)和單細(xì)胞定位及熒光鑒定區(qū)這三個功能區(qū)，而這三個功能區(qū)及其包含的微結(jié)構(gòu)加工工藝相同，可以在一塊硅片上同時一次成型。

在圖4所示的微流控芯片中，對于雜質(zhì)過濾區(qū)的微柱陣列，每個微柱都是邊直徑為40微米，高度為20微米的圓柱體，為了適應(yīng)不同尺寸大小的血液雜質(zhì)，在功能區(qū)的前、中、后三個位置，每兩個微柱之間的間距為分別為100微米、50微米和32微米。微柱陣列的整體尺寸為長7毫米，寬6毫米，整個微柱陣列共有1500個微柱(圖4中未全部示出)。對于細(xì)胞分離區(qū)的漸寬流道，從入口到出口，寬度逐漸變寬，入口處寬度最小，為1000微米，出口處最寬，為7000微米，流道全長2.5厘米，深20微米。對于單細(xì)胞定位及熒光鑒定區(qū)的V形定位陣列，每個V形定位結(jié)構(gòu)單元高20微米，最大開口為15微米，最小開口為3微米，相鄰兩個定位結(jié)構(gòu)行間距和列間距分別為35微米和40微米。上述是應(yīng)用于血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的最優(yōu)條件。當(dāng)需要處理其它細(xì)胞時，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員自行選擇合適的尺寸及微結(jié)構(gòu)數(shù)量。三個功能區(qū)的局部結(jié)構(gòu)放大圖見圖4。

3、封接方法

在圖1所示的微流控芯片，微閥控制層、微閥薄膜層、基板的材料分別是PDMS、PDMS和硅。采用氧等離子輔助鍵合的方法可以很好的實現(xiàn)PDMS和PDMS、硅和PDMS之間的良好密封封接。封裝后微流控芯片三層結(jié)構(gòu)的俯視角度透視圖見圖3。

在其它的實施方法中，可以根據(jù)微閥控制層、微閥薄膜層、基板的材料來選擇合適的封接方法。

4、芯片配套系統(tǒng)

除了微流控芯片之外，還需要熒光探針(Probe)，熒光顯微鏡(熒光成像系統(tǒng))、自主開發(fā)的圖像分析軟件(分析計數(shù)系統(tǒng))、泵構(gòu)成完整的系統(tǒng)，完成對血液樣品的處理和循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離和計數(shù)。

熒光探針用于鑒定細(xì)胞，所述帶有熒光的分子探針是標(biāo)記了熒光分子的抗體或多肽，為了完成對多蛋白鑒定，需要同時使用多種熒光探針來完成對多種蛋白的多重鑒定。在一個優(yōu)選實施方案中，采用標(biāo)記了綠色熒光的CK19抗體作為熒光探針，用來識別循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面的CK19蛋白和采用標(biāo)記了紅色熒光的CD45抗體作為熒光探針，用來識別白細(xì)胞表面的CD45蛋白。在其它實施方法中，也可以針對不同的蛋白選擇不同的抗體或者多肽作為探針。

熒光顯微鏡用于檢測微V形定位陣列中的細(xì)胞是否有熒光，并對該功能區(qū)進(jìn)行全覆蓋熒光成像，獲取多通道熒光圖像。

自主開發(fā)的圖像處理軟件用于分析熒光顯微鏡獲取的圖像并獲得相應(yīng)的CTC數(shù)量。該軟件通過對圖像中細(xì)胞的大小、面積、長寬比、圓度等參數(shù)進(jìn)行精確計算，篩選出符合要求的CTC，并對CTC進(jìn)行計數(shù)。根據(jù)自主編寫的算法對定位細(xì)胞進(jìn)行篩選鑒定，鑒定出符合標(biāo)記熒光特性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并進(jìn)行計數(shù)，報告細(xì)胞位置和放大細(xì)胞圖像。

泵用于驅(qū)動血液樣品和相關(guān)試劑。

單片機(jī)控制的氮氣供給裝置用于輸出氮氣，提供控制微閥開關(guān)所需的氣壓。

5、微流控芯片的制作方法

可采用以下兩套不同的制作工藝制備所述微流控芯片。

制作方法A：

微閥控制層：采用4英寸Pyrex7740玻璃片(康寧公司)，在硅片正面光刻出微孔和氣體通道的平面位置，采用氫氟酸腐蝕玻璃，形成30微米深的氣體通道和孔，利用激光將微孔的位置打穿。最后按照長5厘米，寬3厘米的外形尺寸切成長方形小片。

微閥薄膜層：采用N型4英寸硅片，利用旋涂法在其表面涂上一層30微米厚的PDMS液體，待其凝固后脫模取出，按照長5厘米，寬3厘米的外形尺寸切成長方形薄膜。

帶有硅微柱陣列和V形定位陣列的基板：采用4英寸硅-玻璃鍵和片(上層為硅，20微米厚；下層為透明玻璃，500微米厚)，在硅層光刻出微柱、漸寬流道和V形定位結(jié)構(gòu)等其他結(jié)構(gòu)的平面形狀后，采用ICP干法刻蝕的方法獲得20微米高的微柱和V形定位結(jié)構(gòu)，以及20微米深的漸寬流道。將4英寸硅-玻璃鍵和片按照長5厘米，寬3厘米的外形尺寸切成長方形小片。

封接：使用氧等離子體處理透明微閥控制層的底面，微閥薄膜層的兩面，硅-玻璃基板的頂面，將他們依次鍵合在一起，最終獲得完整的芯片。

芯片系統(tǒng)：在微流體芯片的基礎(chǔ)上，使用聚四氟乙烯管連接泵和微閥控制層的流體出入口，用聚四氟乙烯管連接單片機(jī)控制的氮氣供給裝置和微閥控制層的氣體通道入口，并將芯片放置在可自動進(jìn)行熒光成像的正置熒光顯微鏡下，并在計算機(jī)中配備自主研發(fā)的圖像處理軟件用于熒光圖像的自動化分析處理，即可完成整套系統(tǒng)的搭建。

制作方法B：

微閥控制層：采用N型4英寸硅片，在光刻出氣體通道的平面形狀后，使用ICP干法刻蝕出30微米高的凸體。將液態(tài)PDMS倒入槽中，待其凝固后脫模取出，按照長5厘米，寬3厘米的外形尺寸切成長方形小片，使用打孔器在所需位置打孔，這樣就得到了微閥控制層。

微閥薄膜層：采用N型4英寸硅片，利用旋涂法在其表面涂上一層30微米厚的PDMS液體，待其凝固后脫模取出，按照長5厘米，寬3厘米的外形尺寸切成長方形薄膜。

帶有硅微柱陣列和V形定位陣列的基板：采用N型4英寸硅片，在光刻出微柱、漸寬流道和V形定位結(jié)構(gòu)等其他結(jié)構(gòu)的平面形狀后，采用ICP干法刻蝕的方法獲得20微米高的微柱和V形定位結(jié)構(gòu)，以及20微米深的漸寬流道。將4英寸硅片按照長5厘米，寬3厘米的外形尺寸切成長方形小片。

封接：使用氧等離子體處理透明微閥控制層的底面，微閥薄膜層的兩面，硅基板的頂面，將他們依次鍵合在一起，最終獲得完整的芯片。

芯片系統(tǒng)：在微流體芯片的基礎(chǔ)上，使用聚四氟乙烯管連接泵和微閥控制層的流體出入口，用聚四氟乙烯管連接單片機(jī)控制的氮氣供給裝置和微閥控制層的氣體通道入口，并將芯片放置在可自動進(jìn)行熒光成像的正置熒光顯微鏡下，并在計算機(jī)中配備自主研發(fā)的圖像處理軟件用于熒光圖像的自動化分析處理，即可完成整套系統(tǒng)的搭建。

7、微流控芯片的應(yīng)用方法

從癌癥患者抽取2毫升血液，與結(jié)合有EpCAM抗體的磁珠混合孵育，然后稀釋5倍，通入微流控芯片中。待細(xì)胞捕獲完成并進(jìn)行單細(xì)胞定位后，向芯片內(nèi)通入帶有藍(lán)色熒光的DAPI，帶有紅色熒光的CD45抗體和帶有綠色熒光的CK19抗體，使用自動化熒光顯微鏡拍攝圖像并通過自主研發(fā)的圖像處理軟件分析計數(shù)。不發(fā)藍(lán)色熒光的細(xì)胞不加處理；同時發(fā)藍(lán)色熒光和紅色熒光的細(xì)胞是白細(xì)胞；同時發(fā)藍(lán)色熒光、紅色熒光和綠色熒光的同樣是白細(xì)胞；僅發(fā)藍(lán)色熒光和綠色熒光的說明是血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。該分析軟件既可以獲得血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，還可以獲得每個循環(huán)腫瘤細(xì)胞在芯片中的位置和相應(yīng)的放大圖像。

本發(fā)明通過引入微加工技術(shù)和微流控技術(shù)，并結(jié)合自動化圖像處理技術(shù)，開發(fā)了一種多層、多功能微結(jié)構(gòu)芯片，實現(xiàn)了癌癥患者血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲、鑒定和自動化計數(shù)，為循環(huán)腫瘤細(xì)胞分析領(lǐng)域提供了一種有效手段，能夠更快，更準(zhǔn)確，更高通量的獲取循環(huán)腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行計數(shù)。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。