本發(fā)明屬于納他霉素制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高納他霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
納他霉素是一種具有活性的多烯烴大環(huán)內(nèi)酯類的抗真菌類抗生素，可由納塔爾鏈霉菌經(jīng)過發(fā)酵所得到的一種次級代謝產(chǎn)物，納他霉素分子式為C33H47NO13，可含3分子結(jié)晶水，相對分子量665.725；如式1所示，其化學結(jié)構(gòu)上含有氨基和羧基，因此納他霉素屬于兩性物質(zhì)，其分子構(gòu)造上通常存在著兩種典型構(gòu)型：酮式結(jié)構(gòu)和烯醇式結(jié)構(gòu)，其中烯醇式結(jié)構(gòu)居多，這就決定了它在許多溶劑中的溶解性較低。納他霉素屬于多烯烴大環(huán)內(nèi)酯類化合物，內(nèi)酯環(huán)上C3～C9部位是半縮醛結(jié)構(gòu)四烯系統(tǒng)是全順式的，含有由一個糖苷鍵連接的碳水化合物基團，這個基團即是氨基二脫氧甘露糖。納他霉素是一種高效廣譜的抗真菌類抗生素，抑菌機理主要是納他霉素依靠其內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)與真菌細胞膜上的甾醇化合物作用，通過形成抗生素-甾醇化合物，破壞真菌的細胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)，能夠有效抑制真菌生長，還能避免真菌毒素的產(chǎn)生。
納他霉素作為新型、安全高效的的生物防腐劑和醫(yī)用抗菌劑，滿足食品安全發(fā)展的要求，將會在食品、藥品等方面的到更加廣泛的應用和研究。雖然由于價格、規(guī)?；a(chǎn)工藝等方面的限制，目前還不能完全取代化學防腐劑，但隨著科學技術(shù)的進步生和人們對食品安全意識的增強以及生活水平的逐步提高，納他霉素將會有巨大的潛力和良好的市場前景。
目前，納他霉素仍存在產(chǎn)量較低，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)發(fā)展緩慢的問題，由此導致了其價格趨高不下，所以其主要應用于高端產(chǎn)品中，限制了納他霉素的發(fā)展。正因為其產(chǎn)量低，所以導致了其價格相對較高，這嚴重限制了納他霉素在我國的產(chǎn)業(yè)化應用。長期以來，大部分研究人員著手于從菌種選育和發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化等方面進行研究來提高納他霉素的產(chǎn)量，但是現(xiàn)在面臨的問題是仍未達到產(chǎn)業(yè)化的需求。因此，開拓出一條新的提高納他霉素的產(chǎn)量的方法，對實際應用具有很大意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種提高納他霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法，以納塔爾鏈霉菌為主要原料，依次經(jīng)菌株活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵和納他霉素的提取，得到所述納他霉素；具體的，納塔爾鏈霉菌發(fā)酵開始前向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入大孔吸附樹脂；納塔爾鏈霉菌發(fā)酵12-24h時在發(fā)酵液中添加大豆油，納塔爾鏈霉菌發(fā)酵24-48h時以流加方式向發(fā)酵液中加入纈氨酸和蘇氨酸；
其中，所述大孔吸附樹脂的添加量為每升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加80-100g的大孔吸附樹脂，所述大豆油的添加量為每升發(fā)酵液中添加40-50mL的大豆油，所述纈氨酸的添加量為每升發(fā)酵液中添加0.5-0.7g的纈氨酸，所述蘇氨酸的添加量為每升發(fā)酵液中添加0.2-0.5g的蘇氨酸。
優(yōu)選地，所述菌株活化的具體步驟為：以納塔爾鏈霉菌為原料，將納塔爾鏈霉菌培養(yǎng)于固體斜面培養(yǎng)基上，在26-30℃下培養(yǎng)3-9天，得到納塔爾鏈霉菌斜面菌株，4℃以下保藏；
所述固體斜面培養(yǎng)基的配方為：每100mL蒸餾水中含有葡萄糖1-2g，瓊脂1.5-2.0g，番茄漿1.5-2.5g，燕麥2-3g，瓊脂1.5-2.0g，pH自然。
更優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)的具體步驟為：將所述納塔爾鏈霉菌斜面菌株接種于液體種子培養(yǎng)基中，26-30℃培養(yǎng)2-3天，得到納塔爾鏈霉菌種子液；
所述液體種子培養(yǎng)基的配方為：每100mL蒸餾水中含有葡萄糖0.8-1g，胰蛋白胨0.2-0.5g，麥芽浸粉0.3-0.5g，氯化鈉0.6-1g，pH為7.0-7.5。
更優(yōu)選地，所述發(fā)酵的具體步驟為：將所述納塔爾鏈霉菌種子液以2-10％的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，得到發(fā)酵液，培養(yǎng)條件為26-30℃，轉(zhuǎn)速160-200r/min，發(fā)酵3-7天，得到納塔爾鏈霉菌發(fā)酵液；
在納塔爾鏈霉菌發(fā)酵開始前，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入大孔吸附樹脂；在發(fā)酵過程中，在納塔爾鏈霉菌發(fā)酵12-24h時，往發(fā)酵液中添加大豆油；在納塔爾鏈霉菌發(fā)酵24-48h時，往發(fā)酵液中以流加的方式添加纈氨酸和蘇氨酸。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：每1000mL蒸餾水中含有葡萄糖30-45g，酵母浸出粉1-3g，牛肉膏5-15g，蒸餾水1L，pH為7.0-7.5。
更優(yōu)選地，所述納他霉素的提取的具體步驟為：采用甲醇提取法，將甲醇與所述納塔爾鏈霉菌發(fā)酵液以體積比為9-10：1的比例混合后，充分混合后離心，離心轉(zhuǎn)速10000r/min，離心時間為10-20min，取上清液，將上清液用0.22um濾膜過濾，所得濾液即為所述納他霉素溶液。
優(yōu)選地，所述大孔吸附樹脂為HPD450大孔樹脂。
優(yōu)選地，所述的納塔爾鏈霉菌為納塔爾鏈霉菌屬中的任何菌株。
更優(yōu)選地，所述納塔爾鏈霉菌為納塔爾鏈霉菌4.3526。
本發(fā)明提供的發(fā)酵方法通過對納塔爾鏈霉菌發(fā)酵期間按一定比例添加一些物質(zhì)，一種是氨基酸，氨基酸可作為碳源使用，也可以充當?shù)蠢?，并且氨基酸的代謝產(chǎn)物，例如乙酰CoA，丙酰CoA等物質(zhì)是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素合成的前體；第二種物質(zhì)大豆油，納塔爾鏈霉菌是好氧菌，大豆油作為氧載體，參與納塔爾鏈霉菌的發(fā)酵；最后一種物質(zhì)是大孔樹脂，大孔樹脂作為一種吸附劑提高納他霉素的回收率，并可以降低發(fā)酵產(chǎn)物反饋抑制。該發(fā)酵方法使納他霉素產(chǎn)量可提高3-4倍，達到4g/L左右，顯著提高了納他霉素的產(chǎn)量。
具體實施方式
為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案能予以實施，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。
本發(fā)明以下實施例中所用到的相關(guān)試劑，若沒有特殊說明，皆為市售商品，所涉及的制備方法，若沒有特殊說明，皆為現(xiàn)有方法或制造廠商建議的條件。
一種提高納他霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法，以納塔爾鏈霉菌為主要原料，依次經(jīng)菌株活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵和納他霉素的提取，得到所述納他霉素；具體的，發(fā)酵期間，納塔爾鏈霉菌發(fā)酵12-24h時在發(fā)酵液中添加大豆油，納塔爾鏈霉菌發(fā)酵24-48h時以流加方式向發(fā)酵液中加入纈氨酸和蘇氨酸，納塔爾鏈霉菌發(fā)酵開始前向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入大孔吸附樹脂；其中，纈氨酸的添加量為每升發(fā)酵液中添加0.5-0.7g的纈氨酸，蘇氨酸的添加量為每升發(fā)酵液中添加0.2-0.5g的蘇氨酸，大豆油的添加量為每升發(fā)酵液中添加40-50mL的大豆油，大孔吸附樹脂的添加量為每升發(fā)酵液中添加80-100g的大孔吸附樹脂。
以下就本發(fā)明的技術(shù)方案進行具體的舉例說明，需要說明的是，以下實施例中所用的菌種納塔爾鏈霉菌4.3526，購自于中國普通微生物菌種保藏管理中心。
對比例1
一種納他霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法，具體步驟如下：
(1)菌體活化培養(yǎng)
將納塔爾鏈霉菌4.3526培養(yǎng)于固體斜面培養(yǎng)基上，在28℃下培養(yǎng)7天，可得到納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株，保藏于4℃下備用。此固體斜面培養(yǎng)基配方為：蒸餾水100mL，葡萄糖2g，瓊脂2g，番茄漿2g，燕麥2g，pH值自然。
(2)搖瓶種子培養(yǎng)
將步驟(1)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株用接種環(huán)取2環(huán)接種于液體種子培養(yǎng)基中，在28℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)2天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526種子液，備用。以上納塔爾鏈霉菌的種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖10g，胰蛋白胨5g，氯化鈉10g，麥芽浸粉5g，蒸餾水1L，pH為7.2。
(3)發(fā)酵
將步驟(2)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526種子液以6％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)5天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526發(fā)酵液。以上納塔爾鏈霉菌4.3526的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖45g，酵母浸出粉2g，牛肉膏10g，蒸餾水1L，pH為7.2。
(4)納他霉素的提取
采用甲醇提取的方法，以及離心的方法提取納塔爾鏈霉菌發(fā)酵液中的納他霉素。具體是：甲醇與發(fā)酵液以體積比9:1的比例混合后，搖床搖瓶2h后離心，離心轉(zhuǎn)速10000r/min，10min，取上清液用0.22um濾膜過濾，得到濾液，最后用HPLC法測定濾液中的納他霉素含量，產(chǎn)量為0.98g/L。
實施例1
一種提高納他霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法，具體步驟如下：
(1)菌體活化培養(yǎng)
將納塔爾鏈霉菌4.3526培養(yǎng)于固體斜面培養(yǎng)基上，在28℃下培養(yǎng)7天，可得到納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株，保藏于4℃下備用。此固體斜面培養(yǎng)基配方為：蒸餾水100mL，葡萄糖2g，瓊脂2g，番茄漿2g，燕麥2g，pH值自然。
(2)搖瓶種子培養(yǎng)
將步驟(1)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株用接種環(huán)取2環(huán)接種于液體種子培養(yǎng)基中，在28℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)2天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526種子液，備用。以上納塔爾鏈霉菌的種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖10g，胰蛋白胨5g，氯化鈉10g，麥芽浸粉5g，蒸餾水1L，pH為7.2。
(3)發(fā)酵
將步驟(2)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526種子液以6％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)5天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526發(fā)酵液。
在發(fā)酵開始前，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中加入80g HPD450大孔樹脂，之后進行發(fā)酵；在納塔爾鏈霉菌4.3526發(fā)酵過程中，在發(fā)酵20h時，往發(fā)酵液中添加大豆油，大豆油的添加量為40mL/L(指的是每升發(fā)酵液中添加40mL的大豆油)；在發(fā)酵24h時，以流加的方式加入纈氨酸和蘇氨酸，纈氨酸和蘇氨酸的添加量均為0.5g/L(指的是每升發(fā)酵液中添加0.5g/L的纈氨酸和0.5g/L蘇氨酸)。
以上納塔爾鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖45g，酵母浸出粉2g，牛肉膏10g，蒸餾水1L，pH為7.2。
(4)納他霉素的提取
采用甲醇提取的方法，以及離心的方法提取納塔爾鏈霉菌發(fā)酵液中的納他霉素。具體是：甲醇與發(fā)酵液以體積比9:1的比例混合后，搖床搖瓶2h后離心，離心轉(zhuǎn)速10000r/min，10min，取上清液用0.22um濾膜過濾，得到濾液，最后用HPLC法測定濾液中的納他霉素含量，產(chǎn)量為3.32g/L，與對比例1相比，納他霉素的產(chǎn)量提高了338.8％。
實施例2
一種提高納他霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法，具體步驟如下：
(1)菌體活化培養(yǎng)
將納塔爾鏈霉菌4.3526培養(yǎng)于固體斜面培養(yǎng)基上，在30℃下培養(yǎng)3天，可得到納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株，保藏于4℃以下備用。此固體斜面培養(yǎng)基配方為：蒸餾水100mL，葡萄糖1g，瓊脂1.5g，番茄漿1.5g，燕麥2.5g，pH值自然。
(2)搖瓶種子培養(yǎng)
將步驟(1)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株用接種環(huán)取2環(huán)接種于液體種子培養(yǎng)基中，在30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)2.5天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526種子液，備用。以上納塔爾鏈霉菌4.3526的液體種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖8g，胰蛋白胨2g，氯化鈉6g，麥芽浸粉3g，蒸餾水1L，pH為7.5。
(3)發(fā)酵
將步驟(2)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526種子液以8％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，培養(yǎng)3天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526發(fā)酵液。
在發(fā)酵開始前，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中加入85g HPD450大孔吸附樹脂，之后進行發(fā)酵；在納塔爾鏈霉菌4.3526發(fā)酵過程中，在發(fā)酵12h時，往發(fā)酵液中添加大豆油，大豆油的添加量為45mL/L(指的是每升發(fā)酵液中添加45mL的大豆油)；在發(fā)酵24h時，以流加的方式加入纈氨酸和蘇氨酸，纈氨酸和蘇氨酸的添加量分別為0.6g/L和0.4g/L(指的是每升發(fā)酵液中添加0.6g/L的纈氨酸和0.4g/L蘇氨酸)。
以上納塔爾鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖30g，酵母浸出粉1g，牛肉膏5g，蒸餾水1L，pH為7.5。
(4)納他霉素的提取
采用甲醇提取的方法，以及離心的方法提取納塔爾鏈霉菌發(fā)酵液中的納他霉素。具體是：甲醇與發(fā)酵液以體積比10:1的比例混合后，搖床搖瓶2h后離心，離心轉(zhuǎn)速10000r/min，15min，取上清液用0.22um濾膜過濾，得到濾液，最后用HPLC法測定濾液中的納他霉素含量，產(chǎn)量為3.2g/L，與對比例1相比，納他霉素的產(chǎn)量提高了326.5％。
實施例3
一種提高納他霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法，具體步驟如下：
(1)菌體活化培養(yǎng)
將納塔爾鏈霉菌4.3526培養(yǎng)于固體斜面培養(yǎng)基上，在26℃下培養(yǎng)9天，可得到納塔爾鏈霉菌4.35264.3526斜面菌株，保藏于4℃下備用。此固體斜面培養(yǎng)基配方為：蒸餾水100mL，葡萄糖1.5g，瓊脂1.5g，番茄漿2.5g，燕麥3g，pH值自然。
(2)搖瓶種子培養(yǎng)
將步驟(1)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526斜面菌株用接種環(huán)取2環(huán)接種于液體種子培養(yǎng)基中，在26℃，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)3天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526種子液，備用。以上納塔爾鏈霉菌的種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖9g，胰蛋白胨4g，氯化鈉8g，麥芽浸粉4g，蒸餾水1L，pH為7.0。
(3)發(fā)酵
將步驟(2)中所得到的納塔爾鏈霉菌4.3526種子液以10％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為26℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)7天，得到納塔爾鏈霉菌4.3526發(fā)酵液。
在發(fā)酵開始前，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中加入100g HPD450大孔樹脂，之后進行發(fā)酵；在納塔爾鏈霉菌4.3526發(fā)酵過程中，在發(fā)酵24h時，往發(fā)酵液中添加大豆油，大豆油的添加量為50mL/L(指的是每升發(fā)酵液中添加50mL的大豆油)；在發(fā)酵48h時，以流加的方式加入纈氨酸和蘇氨酸，纈氨酸和蘇氨酸的添加量分別為0.7g/L和0.2g/L(指的是每升發(fā)酵液中添加0.7g/L的纈氨酸和0.2g/L蘇氨酸)。
以上納塔爾鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖40g，酵母浸出粉3g，牛肉膏15g，蒸餾水1L，pH為7.0。
(4)納他霉素的提取
采用甲醇提取的方法，以及離心的方法提取納塔爾鏈霉菌發(fā)酵液中的納他霉素。具體是：甲醇與發(fā)酵液以體積比9：1的比例混合后，搖床搖瓶2h后離心，離心轉(zhuǎn)速10000r/min，20min，取上清液用0.22um濾膜過濾，得到濾液，最后用HPLC法測定濾液中的納他霉素含量，產(chǎn)量為3.95g/L，與對比例1相比，納他霉素的產(chǎn)量提高了403.1％。
以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，其保護范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)，本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準。