本發(fā)明涉及一種化合物及其制備方法，尤其是一種靶向FAP-alpha酶的抗腫瘤化合物及其制備方法與應(yīng)用，屬于抗腫瘤藥物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

當(dāng)前，腫瘤的臨床化療藥物主要為細(xì)胞毒性藥物，盡管它們具備較強(qiáng)的抗腫瘤活性，然而由于這類化療藥物缺乏選擇性，往往導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用。所以，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒性藥物的靶向投遞對(duì)減少腫瘤化療的不良反應(yīng)具有顯著的意義。

丙卡巴肼(procarbazine，Pcb)臨床上主要用于治療何杰金氏病，對(duì)于其他惡性腫瘤如惡性淋巴瘤、肺癌、多發(fā)性骨髓瘤等也有一定的療效。1982年該藥的鹽酸鹽以口服膠囊劑型被FDA批準(zhǔn)在美國上市，主要用于惡性淋巴瘤的治療。然而由于這類化療藥物缺乏抗癌選擇性，往往導(dǎo)致較大的毒副作用，尤其對(duì)生殖細(xì)胞的毒化作用及骨髓抑制。眾所周知，骨髓抑制可導(dǎo)致白細(xì)胞、血小板減少，有出血傾向，亦可致貧血。這些毒副作用限制了其在臨床上的應(yīng)用。

解決抗腫瘤藥物毒副作用的有效途徑之一是對(duì)藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，使之成為前體藥物，利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間分子生物學(xué)上的差異，選擇性作用于腫瘤靶細(xì)胞的基因、酶、信號(hào)傳導(dǎo)因子等，從而達(dá)到靶向治療的目的。近年來大量的研究表明，成纖維細(xì)胞激活蛋白alpha(FAP-alpha)是由腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞特異性高表達(dá)的腫瘤間質(zhì)抗原分子，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的促進(jìn)作用。FAP-alpha具有特異性肽鏈內(nèi)切酶活性，能夠選擇性地水解N-末端封閉的甘氨酰脯氨酸二肽序列，如攜帶Z-Gly-Pro(Z-GP)二肽的底物。因此，選擇成纖維細(xì)胞激活蛋白alpha(FAP-alpha)作為靶標(biāo)是提高腫瘤治療綜合指數(shù)的有效策略之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種靶向FAP-alpha酶的抗腫瘤化合物，所述化合物能被FAP-alpha酶特異性水解切除二肽部分(Z-GP)，釋放出丙卡巴肼，命名為Z-GP-丙卡巴肼(Z-GP-Pcb)，所述Z-GP-Pcb能克服直接將丙卡巴肼作為抗癌藥物時(shí)具有嚴(yán)重毒副作用的不足，能顯著降低正常細(xì)胞的毒性和體內(nèi)毒性，能顯著抑制荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長以及降低對(duì)非靶器官毒性，有望開發(fā)成新的抗腫瘤藥物。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種靶向FAP-alpha酶的抗腫瘤化合物，其結(jié)構(gòu)如式I所示：

或者為式I所示化合物的同分異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)如式II所示：

所述化合物命名為Z-GP-丙卡巴肼(Z-GP-Pcb)，式I和式II為同分異構(gòu)體，兩者在藥物代謝、藥物用途中具有相同效果，均是腫瘤間質(zhì)成纖細(xì)胞激活蛋白酶alpha(FAP-alpha)的特異性水解底物，其分子量為509.26Dα。

另外，本發(fā)明提供一種所述化合物Z-GP-丙卡巴肼的制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)將丙卡巴肼、芐氧羰基甘氨酰脯氨酸(Z-GP-OH)和縮合試劑，在0℃～30℃下攪拌并反應(yīng)，得混合物；

(2)反應(yīng)完畢后，向步驟(1)所得混合物中加入飽和鹽溶液，進(jìn)行淬滅、分離、純化，即得化合物Z-GP-丙卡巴肼。

作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中的縮合試劑為1-羥基苯并三唑和N,N-二異丙基乙胺和2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、氯甲酸乙酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N,N’-二異丙基碳二亞胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-氯N,N,2-三甲基丙烯胺中的至少一種的混合物。

作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的最優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中的縮合試劑為2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、1-羥基苯并三唑(HOBT)和N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)的混合物。

作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中丙卡巴肼、芐氧羰基甘氨酰脯氨酸和縮合試劑的摩爾比為1:(1～3.0):(1.05～3.0)。

作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中的鹽為NaCl、KCl、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄中的至少一種。

作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中的丙卡巴肼的合成路線為：

具體采用如下方法制備而成：

(a)將對(duì)甲基苯甲酸溶于有機(jī)試劑，加入過量二氯亞砜，于60-80℃油浴加熱回流1-3h，旋蒸除去過量二氯亞砜，得對(duì)甲基苯甲酰氯，然后將對(duì)甲基苯甲酰氯重新溶于有機(jī)試劑中，緩慢加入異丙胺，控制溫度在30℃下，加料完畢繼續(xù)在室溫下攪拌反應(yīng)2-4h，然后升溫至40℃，繼續(xù)反應(yīng)20-40min，反應(yīng)結(jié)束后分離純化，得N-異丙基對(duì)甲基苯甲酰胺；

(b)將步驟(a)所得的對(duì)甲基苯甲酰氯溶于有機(jī)試劑，緩慢加入硝酸鈰銨混懸液，加料完畢，置于90-100℃油浴鍋中反應(yīng)20-30h，反應(yīng)結(jié)束后分離純化，得4-甲酰基-N-異丙基苯甲酰胺；

(c)將步驟(b)所得的N-異丙基對(duì)甲基苯甲酰胺與甲基肼硫酸鹽溶于有機(jī)試劑，加入三乙胺，將反應(yīng)裝置置于50-70℃油浴鍋中反應(yīng)5-7h，旋干溶劑，將混合物重新溶于有機(jī)試劑中，在0℃的低溫恒溫器中緩慢加入氰基硼氫化鈉，加料完畢，反應(yīng)體系逐漸升至室溫，反應(yīng)過夜，反應(yīng)結(jié)束后分離純化，即得丙卡巴肼。

作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述Z-GP-丙卡巴肼的合成路線為：

作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(a)中的有機(jī)溶劑為干燥的二氯甲烷或氯仿，所述對(duì)甲基苯甲酸與二氯亞砜的摩爾比為1.0:(5.0～100)，所述對(duì)甲基苯甲酸與異丙胺的摩爾比為1:(5.0～10)。

作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(b)中的有機(jī)溶劑為硝酸溶液或醋酸溶液，所述硝酸鈰銨混懸液中硝酸溶液的濃度為3.0-5.0mmol/L，所述N-異丙基對(duì)甲基苯甲酰胺與硝酸鈰的摩爾投料比為1:(3.0～5.0)。

作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(c)中的有機(jī)溶劑為無水乙醇或DMF，所述4-甲?；?N-異丙基苯甲酰胺與甲基肼硫酸鹽的摩爾比為1:(3.0～5.0)。

另外，本發(fā)明提供一種靶向FAP-alpha酶的抗腫瘤化合物，所述化合物為上述所述化合物Z-GP-丙卡巴肼的衍生物或生理上可接受的鹽。Z-GP-丙卡巴肼或Z-GP-丙卡巴肼生理上可接受的鹽在藥用中可以游離態(tài)形式存在。

作為本發(fā)明上述所述化合物的優(yōu)選實(shí)施方式，所述化合物Z-GP-丙卡巴肼生理上可接受的鹽為酒石酸鹽、硫酸鹽、鹽酸鹽。優(yōu)選地，所述Z-GP-丙卡巴肼生理上可接受的鹽的制備方法包括以下步驟：將Z-GP-丙卡巴肼溶于含1.05～3.0摩爾量酸(HA)的有機(jī)溶劑中，于-10℃～40℃溫度下攪拌反應(yīng)3～20小時(shí)，分離固體化合物，洗滌，再將固體化合物重新溶于水中，冷凍干燥，即得化合物Z-GP-丙卡巴肼生理上可接受的鹽。優(yōu)選地，上述所述有機(jī)溶劑為體積比為1:1的甲醇和二氯甲烷的混合溶液。

另外，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包括上述所述化合物Z-GP-丙卡巴肼和/或Z-GP-丙卡巴肼的衍生物和/或或Z-GP-丙卡巴肼在生理上可接受的鹽。

另外，本發(fā)明提供一種上述所述化合物或所述藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

作為本發(fā)明所述應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方式，所述化合物或藥物組合物為腫瘤間質(zhì)成纖細(xì)胞激活蛋白酶α的特異性水解底物。

作為本發(fā)明所述應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方式，所述腫瘤為惡性淋巴瘤、肺癌、肝癌或多發(fā)性骨髓瘤。

本發(fā)明的有益效果在于：(1)本發(fā)明所述Z-GP-丙卡巴肼能顯著降低正常細(xì)胞的毒性和體內(nèi)毒性，在體內(nèi)外能被FAP-alpha酶特異性水解切除二肽部分(Z-GP)釋放出肼解產(chǎn)物；(2)所述Z-GP-丙卡巴肼能顯著抑制荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長以及降低對(duì)非靶器官毒性；(3)本發(fā)明所述Z-GP-丙卡巴肼的制備方法具有反應(yīng)條件溫和、實(shí)驗(yàn)步驟簡單、收率高、產(chǎn)品純度高、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1是FAP-alpha對(duì)本發(fā)明所述化合物Z-GP-丙卡巴肼的酶解效應(yīng)圖；

圖2是Pcb和Z-GP-Pcb對(duì)NCI-H460的細(xì)胞毒性作用影響對(duì)比圖，其中，與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；

圖3是分別采用FAP-alpha+Z-GP-Pcb共處理及Pcb處理對(duì)NCI-H460的細(xì)胞毒性作用影響對(duì)比圖，與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；

圖4是Pcb和Z-GP-Pcb對(duì)小鼠睪丸重量影響的對(duì)比圖，其中，與空白組相比，^##P<0.01，與Pcb組相比，**P<0.01；

圖5是Pcb和Z-GP-Pcb對(duì)小鼠精子數(shù)量影響的對(duì)比圖，其中，與空白組相比，^#P<0.05，與Pcb組相比，*P<0.05；

圖6是Pcb和Z-GP-Pcb在腫瘤及睪丸中的藥物分布比較圖，其中(A)為藥物在腫瘤組織的蓄積情況，(B)為藥物在睪丸組織的蓄積情況；

圖7是Pcb和Z-GP-Pcb對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠腫瘤體積大小影響的對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

本發(fā)明所述Z-GP-丙卡巴肼的制備方法的一種實(shí)施例，所述制備方法包括以下步驟：

1.1.1 N-異丙基對(duì)甲基苯甲酰胺的制備

稱取對(duì)甲苯甲酸273mg(2.0mmol)于25mL的圓底燒瓶中，加入5.0mL(68.8mmol)二氯亞砜(過量)，于78℃油浴加熱回流2h；旋蒸除去過量的二氯亞砜，得對(duì)甲基苯甲酰胺；將對(duì)甲基苯甲酰胺重新溶于2.0mL干燥的二氯甲烷(DCM)中；另取1.0mL(11.7mmol)異丙胺溶于2.0mL干燥的DCM中，得A液；控制溫度在30℃下，逐漸將A液滴加到反應(yīng)體系中，加料完畢繼續(xù)攪拌30min，室溫下攪拌反應(yīng)3h；之后升溫至40℃，繼續(xù)反應(yīng)30min，停止加熱；將反應(yīng)液傾入50mL冰水中，用二氯甲烷-乙醚(體積比1∶5)萃取4次，合并有機(jī)相，依次用水、稀鹽酸、水、稀氫氧化鈉溶液、水洗滌，無水硫酸鎂干燥；旋蒸除去溶劑，得白色固體化合物289.8mg，收率88.9％。

經(jīng)分析檢測，所得白色固體化合物的¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.67(d,J＝3.0Hz,1H),7.64(d,J＝3.0Hz,1H),7.21(d,J＝3.0Hz,1H),7.19(d,J＝3.0Hz,1H),4.22～4.33(m,1H),2.38(s,3H),1.26(s,3H),1.24(s,3H)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:166.6,141.5,132.1,129.1,129.1,126.8,126.8,41.7,22.8,21.3,21.3.ESI-MS m/z:178.2[M+H]⁺,200.3[M+Na]⁺。以上數(shù)據(jù)證明所得白色固體產(chǎn)物為N-異丙基對(duì)甲基苯甲酰胺。

1.1.2 4-甲酰基-N-異丙基苯甲酰胺的制備

取5mL重蒸餾水與6mL濃硝酸混合均勻，制成約3.5mol/L的硝酸溶液備用；稱取N-異丙基對(duì)甲基苯甲酰胺177mg(1.0mmol)于耐壓管中，加入2mL 3.5mol/L硝酸溶液，超聲震蕩溶解；取硝酸鈰銨4.4g(4.0mmol)于西林瓶中，加入8.0mL 3.5mol/L硝酸溶液，攪拌5min，即得硝酸鈰銨的硝酸混懸液；取攪拌均勻的硝酸鈰銨混懸液逐滴滴加到耐壓管中，加料完畢，置于100℃油浴鍋中反應(yīng)24h；反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液冷卻，隨后加入100mL飽和NaCl水溶液，用DCM萃取(3×100mL)，合并有機(jī)相，加入無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干有機(jī)溶劑得微黃色固體粉末，用硅膠柱色譜純化(乙酸乙酯-石油醚，體積比1:5)，得白色固體136.2mg，收率71.2％。

經(jīng)分析檢測，所得白色固體化合物的¹H NMR(300MHz,CD₃OD)δ:10.03(s,1H),7.95(d,J＝9.0Hz,2H),7.58(d,J＝9.0Hz,2H),4.10～4.30(m,1H),1.26(d,J＝6.0Hz,3H),1.24(d,J＝6.0Hz,3H)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:193.5,168.4,130.6,129.0,128.1(2),127.2(2),43.4,22.5(2)；ESI-MS(m/z):192.3[M+H]⁺,224.5[M+Na]⁺。以上數(shù)據(jù)證明所得白色固體產(chǎn)物為4-甲?；?N-異丙基苯甲酰胺。

1.1.3丙卡巴肼(procarbazine)的制備

稱取191mg(1.0mmol)4-甲?；?N-異丙基苯甲酰胺和505mg(3.5mmol)甲基肼硫酸鹽于250mL反應(yīng)瓶中，加入無水乙醇20.0mL，攪拌溶解，攪拌20min后，加入三乙胺1.0mL；將反應(yīng)裝置置于60℃油浴鍋中反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束，旋干溶劑，加入10.0mL的DMF將其重新溶解，在0℃的低溫恒溫器中緩慢加入氰基硼氫化鈉126mg(2.0mmol)，加料完畢，反應(yīng)體系逐漸升至室溫，反應(yīng)過夜；反應(yīng)結(jié)束后，加水淬滅反應(yīng)；加入200.0mL的飽和NaCl水溶液，用200.0mL的乙酸乙酯萃取5次，合并有機(jī)相，加入無水硫酸鈉干燥，過濾，合并有機(jī)相，旋干得黃色油狀液體；硅膠柱色譜分離(乙酸乙酯-石油醚，體積比1:3)，得丙卡巴肼161.9mg，收率74％。

經(jīng)分析檢測，所得丙卡巴肼的¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:7.47(d,J＝7.0Hz,1H),7.43(d,J＝7.0Hz,1H),7.31(d,J＝7.0Hz,1H),7.24(d,J＝7.0Hz,1H),3.88-3.91(m,1H),3.93(s,2H),2.47(s,3H),1.25(d,J＝6.0Hz,3H),1.23(d,J＝6.0Hz,3H)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:166.2,144.4,130.1,125.8,125.8,125.7,125.7,55.2,40.4,33.7,22.3,22.3；ESI-MS(m/z):222.3[M+H]⁺,244.3[M+Na]⁺。以上數(shù)據(jù)證明所得產(chǎn)物確實(shí)為丙卡巴肼(procarbazine)。

1.1.4 Z-GP-丙卡巴肼(Z-GP-Pcb)的制備

稱取612mg(2mmol)Z-GP-OH，283mg(2.1mmol)HOBt和798mg(2.1mmol)HATU溶于10mL干燥DCM，將其倒入50mL圓底燒瓶中，加入二異丙基乙胺(DIPEA)0.3mL，將反應(yīng)瓶置于冰浴中攪拌活化30min；另稱取442mg(2.0mmol)丙卡巴肼溶于5mL干燥DCM，將其倒入西林瓶中，加入DIPEA 0.5mL，反應(yīng)30min后，將溶液緩慢滴加到活化的反應(yīng)瓶中，隨后將反應(yīng)瓶移至室溫反應(yīng)3-4h；反應(yīng)完畢后加飽和NaCl溶液淬滅，以DCM萃取多次，合并有機(jī)相，依次用水、飽和NaCl溶液洗滌，無水Na₂SO₄干燥后減壓蒸除溶劑；所得混合物經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇，體積比10:1)和RP-HPLC分離純化(淋洗劑為MeOH:Water＝50:50,V/V)，得淡黃色黏稠狀液體690mg，收率65％。

經(jīng)分析檢測，所得淡黃色黏稠狀液體的¹H NMR(300MHz,CD₃OD)δ:7.83～7.78(m,2H),7.52～7.47(m,2H),7.38～7.30(m,5H),5.10(d,J＝6.6Hz,2H),4.29～3.96(m,5H),3.57(m,2H),3.22(s,1H),3.17(s,2H),2.05(m,3H),1.87～1.66(m,2H),1.26(d,J＝6.7Hz,6H)；¹³C NMR(75MHz,CD₃OD)δ:173.58,166.38,165.55,156.31,140.79,137.39,134.46,129.11,128.77(2),128.31,127.75,127.71,127.48,127.27(2),65.88,65.84,56.59,52.32,48.91,45.92,41.43,29.76,24.29,21.89(2)；ESI-MS(m/z):532.5[M+Na]⁺，以上數(shù)據(jù)證明所得淡黃色黏稠狀液體產(chǎn)物確實(shí)為Z-GP-丙卡巴肼(Z-GP-Pcb)，其結(jié)構(gòu)如式I所示：

或者為式I所示化合物的同分異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)如式II所示：

實(shí)施例2 Z-GP-Pcb靶向釋放特性的考察實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法：HPLC色譜條件如下：高效液相色譜儀Agilent 1200；色譜柱Cosmosil C18反相色譜柱(4.6×250mm，5μm)；流動(dòng)相(0min，55％甲醇和45％水(含2mM甲酸銨)；10min，65％甲醇和35％水(含2mM甲酸銨)；15min，75％甲醇和25％水(含2mM甲酸銨)；30min，85％甲醇和15％水(含2mM甲酸銨)；40min，85％甲醇和15％水(含2mM甲酸銨)；流速1mL/min；檢測波長：254nm；進(jìn)樣量2μL。

建立Z-GP-丙卡巴肼檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線方法如下：將Z-GP-丙卡巴肼溶解于酶解緩沖液(50mM Tris-HCl,1.0M NaCl,pH 7.4)，設(shè)置5個(gè)濃度梯度分別為0.012725、0.006363、0.003181、0.001591、0.000795μg/ml，以峰面積為縱坐標(biāo)，藥物濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，將終濃度為30mM的Z-GP-丙卡巴肼孵育于含2μg/ml和5μg/ml的rhFAP-alpha的緩沖液中，反應(yīng)溫度為37℃，在孵育0、4、8、12、16、24h時(shí)間點(diǎn)，取上清液用HPLC法檢測游離丙卡巴肼。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)AP-alpha能催化Z-GP-Pcb水解釋放Pcb，且其酶解效率與酶濃度呈正相關(guān)(圖1)。

實(shí)施例3 Z-GP-Pcb酶解前后細(xì)胞毒性變化的考察實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法：將Z-GP-Pcb與Pcb分別在0.1-50μM的藥物濃度范圍內(nèi)對(duì)NCI-H460細(xì)胞株(購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)處理48h，采用MTT法比較兩者的細(xì)胞毒性；將Z-GP-Pcb與FAP-alpha共孵育，取孵育上清液處理NCI-H460細(xì)胞株48h，采用MTT法分析FAP-alpha酶解作用對(duì)Z-GP-Pcb細(xì)胞毒性的影響，在FAP-alpha酶解作用下Z-GP-Pcb是否可恢復(fù)其潛在的細(xì)胞毒性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Z-GP-Pcb對(duì)NCI-H460的細(xì)胞毒性明顯低于Pcb(圖2)；在FAP-alpha酶解作用下，Z-GP-Pcb恢復(fù)其細(xì)胞毒作用(圖3)。

實(shí)施例4 Z-GP-Pcb精子毒性研究實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法：18-22g雄性昆明小鼠60只，隨機(jī)分為5組，分別腹腔注射75mM Pcb/Z-GP-Pcb和150mM Pcb/Z-GP-Pcb，18天后取左側(cè)睪丸，稱重(g)，加入生理鹽水制備精子懸液，吸取制備好的上清精子懸液移入另一離心管中,將其置于60～80℃的水浴中使精子死亡；取懸液1滴,滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板,計(jì)數(shù)懸液中的精子數(shù)，精子數(shù)＝懸液精子數(shù)×稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：從表1和表2中可知，與對(duì)照組比較，75mM和150mM的丙卡巴肼分別單次注射18天后,睪丸重量分別降低29.5％和55.4％；精子數(shù)分別顯著降低42.2％和52.7％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而Z-GP-Pcb 75mM和150mM分別單次注射18天后，與對(duì)照組相比，睪丸重量幾乎無變化，精子數(shù)量降低較不明顯，分別為33.4％和35.3％，Z-GP-Pcb分別與對(duì)應(yīng)劑量丙卡巴肼比較，睪丸重量和精子數(shù)量明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4和圖5)。

表1 Z-GP-Pcb對(duì)小鼠睪丸重量的影響

注：與空白組相比，^##P<0.01，與Pcb組相比，**p<0.01

表2 Z-GP-Pcb對(duì)小鼠精子數(shù)量影響

注：與空白組相比，^#P<0.05，與Pcb組相比，*P<0.05

實(shí)施例5 Z-GP-Pcb靶向分布特性考察實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法：取KM小鼠150只，無菌吸取傳代H22瘤株(購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫)且生長良好的小鼠腹水，用生理鹽水稀釋成1*10⁷cells/mL，每鼠0.2mL接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下建立荷瘤小鼠模型；對(duì)模型小鼠(n＝10)一次性靜脈給予10mg/kg Z-GP-Pcb或Pcb，分別在給藥后0.25,2,8h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，采集腫瘤和睪丸組織，通過HPLC法檢測其組織的藥物濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：藥物組織分布結(jié)果顯示，在給藥1h內(nèi)Z-GP-Pcb在荷瘤小鼠睪丸的藥物蓄積顯著低于Pcb(P<0.01)，且Z-GP-Pcb在給藥0.25,1,4h時(shí)，其腫瘤的蓄積比率均明顯高于Pcb(圖6)。

實(shí)施例6 Pcb和Z-GP-Pcb抗小鼠H22肝癌作用實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法：取KM小鼠60只，無菌吸取傳代H22瘤株且生長良好的小鼠腹水，用生理鹽水稀釋成1*10⁷cells/mL，每鼠0.2mL接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，建立荷瘤小鼠模型；接種24h后，將成功接種的KM小鼠，隨機(jī)分為以下6組，每組10只，造模后第二天開始給藥，受試藥物組每天給藥，給藥方式為腹腔注射給藥10mL/kg，連續(xù)給藥14天，末次給藥24h后處死小鼠并檢測相關(guān)指標(biāo)。

測試指標(biāo)：隔日稱量動(dòng)物體重；末次給藥后眼球取血，血球儀計(jì)算白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板等；瘤重及抑瘤率：取動(dòng)物瘤組織稱瘤重；

按下式計(jì)算抑瘤率：

抑瘤率＝(模型組瘤重-給藥組瘤重)/模型組瘤重×100％

臟器指數(shù)：取肝臟、胸腺及脾臟，按下式計(jì)算肝臟、胸腺及脾重指數(shù)：

臟器指數(shù)＝臟器重量(mg)/體重(g)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：從圖7、表3和表4中可知，Pcb高劑量、Pcb低劑量、Z-GP-Pcb高劑量、Z-GP-Pcb低劑量組抑瘤率分別為：73.91％、33.93％、69.81％、35.39％，從受試藥物抑瘤率看，這2個(gè)受試藥物都表現(xiàn)出比較好的抗腫瘤作用，等摩爾劑量的Pcb和Z-GP-Pcb抑瘤效果相當(dāng)，另外除Pcb高劑量組動(dòng)物體重下降明顯外，其他各組體重沒有顯著變化；Pcb和Z-GP-Pcb兩個(gè)樣品對(duì)脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)影響不大；Pcb高、低劑量也能夠使動(dòng)物白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板含量減少，明顯產(chǎn)生骨髓抑制作用；而Z-GP-Pcb高、低劑量對(duì)血細(xì)胞數(shù)量無明顯影響；說明Z-GP-Pcb對(duì)非靶器官毒性明顯降低，改善了Pcb致白細(xì)胞和血小板減少的不良反應(yīng)。

表3 Pcb、Z-GP-Pcb對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠的影響

注：與模型組比較(降低)，*P＜0.05，**P＜0.01

表4 Pcb和Z-GP-Pcb對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠血細(xì)胞的影響

注：與模型組比較(降低)，*P＜0.05；**P＜0.01；Z-GP-Pcb低劑量組與相應(yīng)Pcb低劑量組比較(升高)，^#P＜0.05；Z-GP-Pcb高劑量組與相應(yīng)Pcb高劑量組比較(升高)，^##P＜0.01

以上結(jié)果揭示了本發(fā)明所述Z-GP-Pcb能顯著降低正常細(xì)胞的毒性和體內(nèi)毒性，在體內(nèi)外能被FAP-alpha酶特異性水解切除二肽部分(Z-GP)，釋放出丙卡巴肼，本發(fā)明所述化合物能顯著抑制荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長以及降低對(duì)非靶器官毒性，有望開發(fā)成新藥。

最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。