本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用熒光定量PCR技術(shù)檢測HLA-B27基因的檢測試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

人類白細(xì)胞抗原(HLA)別名主要組織相容性抗原(MHC)，位于第6號(hào)染色體短臂6p21.3區(qū)域，全長約3.6Mb。HLA基因是目前已知的人類最復(fù)雜基因系統(tǒng)，根據(jù)其在染色體上的排列可分為3類：Ⅰ類基因區(qū)包含HLA-A、HLA-B與HLA-C；Ⅱ類基因區(qū)包含HLA-DR、HLA-DP與HLA-DQ；Ⅲ類基因區(qū)位于上述兩類基因區(qū)域之間，主要編碼補(bǔ)體、熱休克蛋白等產(chǎn)物。

1973年Brewerton首次報(bào)道人類組織相容性抗原HLA-B27(human leucocyte antigen B27,HLA-B27)與強(qiáng)直性脊柱炎(AS)高度相關(guān)。AS是一種以骶髂關(guān)節(jié)和脊柱慢性炎癥為主的自身免疫性疾病。該疾病病因尚未明確，一般認(rèn)為本病發(fā)生與遺傳因素和感染有關(guān)。該疾病直接診斷證據(jù)為，X線下脊柱的特征性改變及骶髂關(guān)節(jié)炎，但在該疾病發(fā)生早期，這種影像學(xué)診斷特征往往不明顯，容易發(fā)生誤診和漏診。近來，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，證實(shí)HLA-B27基因與AS發(fā)生高度相關(guān)。HLA-B27是目前發(fā)現(xiàn)的與AS關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的基因，對(duì)AS易感性貢獻(xiàn)率為16％。國內(nèi)外學(xué)者大量的研究表明90％以上AS患者為HLA-B27陽性，而正常人群中只有5％～10％的個(gè)體為HLA-B27陽性。即便HLA-B27陽性是AS確診的既非必要也非充分條件，但HLA-B27對(duì)AS的早期診斷和治療具有重要價(jià)值。

與HLA I類其他分子一樣，HLA-B27具有較高的遺傳多態(tài)性。這些多態(tài)性位點(diǎn)大多數(shù)分布在第2、3外顯子區(qū)域，編碼抗原結(jié)合槽的α1和α2結(jié)構(gòu)域。截止2016年10月，已發(fā)現(xiàn)的HLA-B27亞型已達(dá)155個(gè)，命名為HLA-B*27:01～HLA-B*27:156，其中，HLA-B*27:22由于在以后的研究中，發(fā)現(xiàn)其序列錯(cuò)誤，因此被取消了該命名。

研究發(fā)現(xiàn)，不同種族、不同地區(qū)人群疾病相關(guān)HLA-B27亞型基因分布差異很大，HLA-B*27:05多見于高加索人，HLA-B*27:02多見于地中海人，HLA-B*27:04多見于中國人。在中國人群中，HLA-B*27:04、HLA-B*27:05與AS均有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，但前者關(guān)聯(lián)性強(qiáng)于后者。而另外的亞型如HLA-B*27:06和HLA-B*27:09則被認(rèn)為是對(duì)AS發(fā)生有保護(hù)作用。

目前，HLA-B27基因檢測方法，主要有聚合酶鏈反應(yīng)-直接測序(PCR-SBT)法、序列特異性引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-SSP)法、流式細(xì)胞儀(FCM)法等。PCR-SBT法，是基于測序分型的聚合酶鏈反應(yīng)，可直接獲得DNA序列，確定所有存在的多態(tài)性，為最直接、最直觀的方法。但是，由于基因結(jié)構(gòu)的特殊性和所設(shè)計(jì)PCR引物等因素，測序結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)套峰，不利于結(jié)果的判讀。且測序?qū)υ噭┖蛢x器有特殊要求，操作復(fù)雜，成本相對(duì)較高，速度慢、通量低，不適合臨床疾病快速輔助診斷。PCR-SSP法，其原理是根據(jù)已知HLA-B27基因片段，設(shè)計(jì)特異性引物直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，盡管該方法對(duì)儀器要求不高、操作簡單、結(jié)果直觀，在基層醫(yī)療衛(wèi)生單位易于推廣，但該方法最大的弊端是步驟多、操作易污染，易出現(xiàn)假陽性，無法實(shí)現(xiàn)批量化和自動(dòng)化。流式細(xì)胞儀法(FCM)具有快速、自動(dòng)化程度高，適合大規(guī)模樣本檢測的優(yōu)點(diǎn)，但該方法中依賴的熒光單克隆抗體特異性不高，易與多種其他HLA抗原，如HLA-B7、HLA-B22等發(fā)生干擾反應(yīng)，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。此外，流式細(xì)胞儀法屬于血清學(xué)水平檢測，無法確定樣本準(zhǔn)確的基因型。且流式細(xì)胞儀器材昂貴，維護(hù)成本高，對(duì)操作人員技術(shù)要求較高，因此限制了它在基層醫(yī)療單位的推廣與應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)檢測能力的不足，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測HLA-B27基因的檢測試劑盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于檢測HLA-B27基因的檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種用于檢測HLA-B27基因的檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括用于HLA-B*27:04基因檢測的引物對(duì)1及檢測探針1，和用于HLA-B*27:05基因檢測的引物對(duì)2及檢測探針2；其中，所述引物對(duì)1的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述檢測探針1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述引物對(duì)2的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，所述檢測探針2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

如上所述的檢測試劑盒，優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括內(nèi)部質(zhì)控，其包括質(zhì)控引物對(duì)和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

如上所述的檢測試劑盒，優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括HLA-B*27:04陽性對(duì)照物、HLA-B*27:05陽性對(duì)照物，其中，所述HLA-B*27:04陽性對(duì)照物含有如SEQ ID No.10和SEQ ID No.12所示的核苷酸序列，所述HLA-B*27:05陽性對(duì)照物含有如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。

如上所述的檢測試劑盒，優(yōu)選地，所述檢測探針1和所述檢測探針2的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)。

如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，試劑盒還包括10×PCR緩沖液、熱啟動(dòng)DNA聚合酶、dNTPs、礦物油、陰性對(duì)照物：ddH₂O。

如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述熒光基團(tuán)為FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

一種快速檢測HLA-B27基因的方法，該方法包括以下步驟：

(1)從樣品中提取DNA；

(2)對(duì)提取的所述DNA，同時(shí)進(jìn)行HLA-B*27:04基因檢測的反應(yīng)體系1和HLA-B*27:05基因檢測的反應(yīng)體系2的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；其中，在所述反應(yīng)體系1中檢測引物對(duì)1的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，檢測探針1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；在所述反應(yīng)體系2中檢測引物對(duì)2的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，檢測探針2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述檢測探針1和所述檢測探針2的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)；

(3)收集熒光信號(hào)，選擇對(duì)應(yīng)熒光基團(tuán)的熒光檢測模式，基線調(diào)整取3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；

(4)結(jié)果判定：待測樣品的所述HLA-B*27:04基因檢測的反應(yīng)體系1或所述HLA-B*27:05基因檢測的反應(yīng)體系2任一體系的熒光擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的“S”型曲線，且Ct值≤26，則該待檢樣本基因型為HLA-B27陽性，否則為HLA-B27陰性。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，所述反應(yīng)體系1和所述反應(yīng)體系2中還包括有作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對(duì)和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，該質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于所述檢測探針1和檢測探針2的熒光基團(tuán)，3＇端連接有不同于所述檢測探針1和檢測探針2的淬滅基團(tuán)。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，在所述反應(yīng)體系1和所述反應(yīng)體系2中，各自的檢測引物和檢測探針的終濃度均為300nmol/L，所述質(zhì)控引物對(duì)和質(zhì)控探針的終濃度均為200nmol/L；所述檢測探針1和檢測探針2的5＇端連接FAM，3＇端連接MGB，所述質(zhì)控探針的5＇端連接JOE，3＇端連接TAMRA。

如上所述的方法，優(yōu)選地，步驟(2)中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

第一階段：95℃變性10min；

第二階段：94℃30s，58℃30s，10個(gè)循環(huán)；

第三階段：94℃30s，60℃30s，30個(gè)循環(huán)；

信號(hào)收集：第三階段收集熒光信號(hào)。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在所述步驟(4)中，檢測樣本的所述內(nèi)部質(zhì)控的JOE信號(hào)應(yīng)有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，且Ct值<25，再確定所述樣本DNA的陰陽性；否則應(yīng)重新進(jìn)行檢測。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，還設(shè)有陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽性對(duì)照為以含有如SEQ ID No.10和SEQ ID No.12核苷酸序列所示的HLA-B*27:04陽性對(duì)照物、含SEQ ID No.11和SEQ ID No.12核苷酸序列所示的HLA-B*27:05陽性對(duì)照物為模板，進(jìn)行所述反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；

所述陰性對(duì)照為以ddH₂O為模板，進(jìn)行所述反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；

在步驟(4)中，所述陽性對(duì)照的反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的FAM均有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，F(xiàn)AM信號(hào)的Ct值≤26，且JOE有典型的“S”型擴(kuò)增曲線且JOE信號(hào)的Ct值<25，符合要求；

所述陰性對(duì)照的反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的FAM、JOE均沒有擴(kuò)增曲線或Ct值，符合要求；否則，應(yīng)重新進(jìn)行體系配置，重新檢測。

本發(fā)明公開了一種用于快速檢測HLA-B27基因的檢測試劑盒，同時(shí)建立了一種比較高效、靈敏的HLA-B27基因快速檢測方法。其檢測試劑盒，使用方便，操作簡單，大大簡化了操作過程，并減少了在操作過程的污染，檢測效果好，具有高靈敏度、高特異性、高選擇性的特點(diǎn)，并實(shí)現(xiàn)對(duì)HLA-B27基因的分型檢測。提供的檢測方法采用完全閉管操作，操作簡單、方便快捷，通過直接檢測PCR過程中熒光信號(hào)Ct值獲得檢測結(jié)果，不需要PCR電泳檢測等后處理，克服了常規(guī)PCR技術(shù)的易污染、假陽性率高的缺點(diǎn)，能有效避免非特異性擴(kuò)增，并且適合大批量樣本的檢測。

本發(fā)明提供的檢測試劑盒及方法，用于檢測HLA-B27基因時(shí)，為了避免漏檢、及初步判斷樣本DNA加入量是否在允許范圍內(nèi)，設(shè)有內(nèi)部質(zhì)控；為了判斷檢測體系是否正常，還設(shè)有陰性對(duì)照和檢測引物的陽性對(duì)照；為了避免假陰性，設(shè)有陽性對(duì)照，其陽性對(duì)照檢測呈陽性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果及漏檢，如陽性對(duì)照檢測呈陰性結(jié)果，說明檢測體系有問題，或試劑已經(jīng)失效，應(yīng)重新配置體系進(jìn)行檢測；為了避免假陽性，設(shè)有陰性對(duì)照，其陰性對(duì)照檢測呈陰性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，如陰性對(duì)照檢測呈陽性結(jié)果，說明檢測體系有問題，已被污染，應(yīng)重新配置體系進(jìn)行檢測；本發(fā)明提供檢測試劑盒及方法設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，有效避免漏檢、錯(cuò)檢的可能。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有如下有益效果和顯著進(jìn)步：

(1)本發(fā)明基于Taqman-MGB探針的熒光定量PCR法，操作簡單，PCR結(jié)束后無需開蓋進(jìn)一步分析，因此減少了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)；

(2)本發(fā)明針對(duì)中國人群HLA-B27亞型基因的分布特點(diǎn)，選取了中國人群中與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)性最高的2個(gè)基因，即HLA-B*27:04和HLA-B*27:05。針對(duì)這2個(gè)基因特異性保守序列分別設(shè)計(jì)了一套引物，且這些特異性位點(diǎn)與引物3'末端互補(bǔ)配對(duì)，而陰性DNA樣本由于與引物3'末端存在幾個(gè)堿基的錯(cuò)配，限制了其PCR擴(kuò)增。在靠近上游引物位置上，設(shè)計(jì)了一段Taqman-MGB探針，該探針只與HLA-B*27:04或HLA-B*27:05陽性DNA保守位點(diǎn)結(jié)合，保證了檢測結(jié)果的特異性。本發(fā)明方法檢測結(jié)果與測序法100％吻合，結(jié)果可靠，特異性強(qiáng)；

(3)本發(fā)明方法靈敏度高，可準(zhǔn)確檢出低至0.1ng/μL的基因組DNA，只需少量DNA樣本即可完成檢測；

(4)本發(fā)明所提供的檢測方法能在90分鐘內(nèi)完成檢測，所需時(shí)間遠(yuǎn)低于其他法，特別適合臨床疾病快速診斷。

附圖說明

圖1為本發(fā)明優(yōu)選試劑盒中HLA-B*27:04反應(yīng)體系靈敏度檢測的擴(kuò)增曲線。

圖2為本發(fā)明優(yōu)選試劑盒中HLA-B*27:05反應(yīng)體系靈敏度檢測的擴(kuò)增曲線。

圖3為本發(fā)明優(yōu)選試劑盒對(duì)HLA-B*27:04陽性樣本的擴(kuò)增曲線。

圖4為本發(fā)明優(yōu)選地試劑盒對(duì)HLA-B*27:05陽性樣本的擴(kuò)增曲線。

圖5為本發(fā)明優(yōu)選地試劑盒對(duì)HLA-B*27:04/HLA-B*27:05雜合型樣本的擴(kuò)增曲線。

圖6為本發(fā)明優(yōu)選地試劑盒對(duì)HLA-B*27陰性樣本的擴(kuò)增曲線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，并非對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，本發(fā)明提供的核苷酸序列的互補(bǔ)序列也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，如無特殊說明，所用試劑為常規(guī)試劑，因此凡依照本公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1引物、探針、陽性參考基因序列設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫以及IPD-IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)公布的HLA-B*27:04(5個(gè)亞型)、HLA-B*27:05(31個(gè)亞型)基因序列以及其參考座位HLA-B*07:02:01基因序列，通過序列比對(duì)確定該基因的特異性保守位點(diǎn)，根據(jù)以上多態(tài)性位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)引物和探針，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物和探針均與HLA-B*27:04或HLA-B*27:05基因的保守性位點(diǎn)結(jié)合，能檢測出其所有基因亞型。經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，最終確定檢測引物和探針序列如下：

(1)用于HLA-B*27:04基因檢測的PCR引物對(duì)1及其特異性檢測探針1，核苷酸序列如下：

HLA-B*27:04基因擴(kuò)增上游引物(1F)，SEQ ID No.1：

5'-GCAAGGCCAAGGCACAGAC-3'；

HLA-B*27:04基因擴(kuò)增下游引物(1R)，SEQ ID No.2：

5'-CTCTCAGCTGCTCCGGCT-3'；

HLA-B*27:04基因檢測探針(1P)，SEQ ID No.3：

FAM 5'-CGAGAGAGCCTGCGGACCCT-3'；

(2)用于HLA-B*27:05基因檢測的PCR引物對(duì)2及其特異性檢測探針2：

HLA-B*27:05基因擴(kuò)增上游引物(2F)，SEQ ID No.4：

5'-GGAGTATTGGGACCGGGAG-3'；

HLA-B*27:05基因擴(kuò)增下游引物(2R)，SEQ ID No.5：

5'-CTCTCAGCTGCTCCGGCA-3'；

HLA-B*27:05基因檢測探針(2P)，SEQ ID No.6：

5'-CGAGAGGACCTGCGGACCCT-3'。

根據(jù)HLA數(shù)據(jù)庫公布的HLA-B*27:04(5個(gè)亞型)和HLA-B*27:05(31個(gè)亞型)基因序列，分別設(shè)計(jì)了其陽性參考基因序列。HLA-B*27:04、HLA-B*27:05陽性參考基因序列分別如SEQ ID No.10、SEQ ID No.11所示。

SEQ ID No.10：

5'-GCAAGGCCAAGGCACAGACTGACCGAGAGAGCCTGCGGACCCTGCTCCGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGGTCTCACACCCTCCAGAATATGTATGGCTGCGACGTGGGGCCGGACGGGCGCCTCCTCCGCGGGTACCACCAGGACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGAGCTCCTGGACCGCCGCGGACACGGCGGCTCAGATCACCCAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCGTGAGGCGGAGCAGCTGAGAG-3'

SEQ ID No.11：

5'-GGAGTATTGGGACCGGGAGACACAGATCTGCAAGGCCAAGGCACAGACTGACCGAGAGGACCTGCGGACCCTGCTCCGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGGTCTCACACCCTCCAGAATATGTATGGCTGCGACGTGGGGCCGGACGGGCGCCTCCTCCGCGGGTACCACCAGGACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGAGCTCCTGGACCGCCGCGGACACGGCGGCTCAGATCACCCAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCGTGTGGCGGAGCAGCTGAGAG-3'。

在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，所加待檢樣本DNA中可能存在PCR抑制劑，這些抑制劑可能嚴(yán)重影響PCR正常擴(kuò)增，產(chǎn)生假陰性結(jié)果；另外，操作過程中的樣品DNA漏加也可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，本發(fā)明還提供了一對(duì)針對(duì)人類GAPDH基因的內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物和探針，用于規(guī)避上述風(fēng)險(xiǎn)，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本發(fā)明選用的內(nèi)部質(zhì)控是人類看家基因GAPDH的一段DNA序列，看家基因高度保守并且持續(xù)表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)中有利于除去不同標(biāo)本在產(chǎn)量及質(zhì)量等上的差別，能夠?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。因此GAPDH基因作為人類基因組的保守基因，不僅可以作為試劑盒內(nèi)部的質(zhì)控，還可作為樣本DNA的質(zhì)控。通過對(duì)內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對(duì)、質(zhì)控探針的篩選和體系優(yōu)化，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR內(nèi)部質(zhì)控檢測體系，要求設(shè)計(jì)的質(zhì)控引物對(duì)、質(zhì)控探針及擴(kuò)增產(chǎn)物，不會(huì)與用于檢測HLA-B*27:04和HLA-B*27:05基因的引物對(duì)、探針等有交叉反應(yīng)，及引物二聚體的形成，優(yōu)選地，質(zhì)控引物對(duì)(3F、3R)、質(zhì)控探針(3P)如下：

質(zhì)控上游引物(3F)，SEQ ID No.7：5'-TGAGGGTTCTTTGTGCTGA-3'

質(zhì)控下游引物(3R)，SEQ ID No.8：5'-AGGAAGGGCTTTGTGAGG-3'質(zhì)控探針(3P)，SEQ ID No.9：5'-CATCCCTCACCCCTTCAATGCCC-3'。

作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其擴(kuò)增序列的大小為158bp，將擴(kuò)增序列作為內(nèi)部質(zhì)控陽性對(duì)照物，即包含如SEQ ID No.12所示序列。

SEQ ID No.12：

5’-TGAGGGTTCTTTGTGCTGAGCGGGGCCCTGCAGGGGAGAAAGGCCCATCCCTCACCCCTTCAATGCCCCCACTGTGGCATCCCTGGGACTGGGGAGGCTGATGGGGAAGGTTGAGCCTTTACTAGCTGGATCTCCCAGTTCCTCACAAAGCCCTTCCT-3’。

實(shí)施例2用于檢測HLA-B27基因位點(diǎn)的試劑盒

用于快速檢測HLA-B27基因位點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒包括以下成分：

用于HLA-B*27:04基因檢測的PCR引物對(duì)1和檢測探針1：

HLA-B*27:04基因擴(kuò)增上游引物1：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

HLA-B*27:04基因擴(kuò)增下游引物1：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

HLA-B*27:04基因檢測探針1：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

用于HLA-B*27:05基因檢測的PCR引物對(duì)2及檢測探針2：

HLA-B*27:05基因擴(kuò)增上游引物2：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

HLA-B*27:05基因擴(kuò)增下游引物2：核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

HLA-B*27:05基因檢測探針2：核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

其中，檢測探針1和檢測探針2的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)。

為了避免漏檢，錯(cuò)檢，還包括：作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對(duì)、質(zhì)控探針，其中，質(zhì)控引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，該質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于所述檢測探針1和2的熒光基團(tuán)，3＇端連接有不同于所述檢測探針1和2的淬滅基團(tuán)。

在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，為有效監(jiān)控PCR反應(yīng)體系是否正常，本發(fā)明還分別提供了針對(duì)HLA-B*27:04和HLA-B*27:05基因檢測的陽性對(duì)照物。HLA-B*27:04陽性對(duì)照物由人工合成的含SEQ ID No.10序列的重組質(zhì)粒DNA與人工合成含SEQ ID No.12序列重組質(zhì)粒DNA按1：1等拷貝混合所得的DNA混合物；HLA-B*27:05陽性對(duì)照物由人工合成的含SEQ ID No.11序列的重組質(zhì)粒DNA與人工合成含SEQ ID No.12序列重組質(zhì)粒DNA按1：1等拷貝混合所得的DNA混合物。

為了防止反應(yīng)體系在PCR擴(kuò)增過程中揮發(fā)，影響檢測效果，試劑盒還包括有礦物油。

為了便于反應(yīng)體系的配置，試劑盒還包括10×PCR緩沖液(含Mg²⁺)；熱啟動(dòng)DNA聚合酶、dNTPs、陰性對(duì)照物：ddH₂O。其中熱啟動(dòng)DNA聚合酶可采用TaKaRa Ex Taq HS，10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)采用TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司，也可應(yīng)用市場上其他公司的緩沖液與DNA聚合酶。

實(shí)施例3采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測HLA-B27基因位點(diǎn)的方法

根據(jù)實(shí)施例1篩選設(shè)計(jì)的HLA-B*27:04基因檢測引物對(duì)及檢測探針、HLA-B*27:05基因檢測引物對(duì)及檢測探針進(jìn)行合成，可在檢測探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)，其中，熒光基團(tuán)為FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

其中，在本實(shí)施例中探針合成時(shí)，探針與熒光和淬滅基團(tuán)相連，檢測探針1和2的熒光-淬滅基團(tuán)為優(yōu)選為FAM-MGB，質(zhì)控探針的熒光-淬滅基團(tuán)優(yōu)選為JOE-TAMRA。當(dāng)然，檢測探針1、2和質(zhì)控探針采用其它熒光-淬滅基團(tuán)組合也同樣適用，比如，HEX-BHQ1、HEX-TAMRA、FAM-TAMRA、FAM-BHQ1、CY3-BHQ1、CY3-BHQ2等，檢測時(shí)選擇相應(yīng)的熒光檢測模式。

應(yīng)用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物對(duì)和檢測探針，對(duì)檢測樣品的DNA模板，進(jìn)行HLA-B*27:04、HLA-B*27:05基因的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測，采用HLA-B*27:04和HLA-B*27:05的反應(yīng)體系，均用25μL反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如表1配置，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；

表1熒光定量PCR反應(yīng)體系組成

將PCR管放入熒光定量PCR儀器中，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增檢測。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：

第一階段：95℃變性10min；

第二階段：94℃30s，58℃30s，10個(gè)循環(huán)；

第三階段:94℃30s，60℃30s(該階段收集熒光信號(hào))，30個(gè)循環(huán)。

PCR程序運(yùn)行結(jié)束后，選擇對(duì)應(yīng)熒光基團(tuán)的熒光檢測模式，基線調(diào)整取3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線。

對(duì)樣品進(jìn)行檢測時(shí)，避免漏檢，如避免有的反應(yīng)孔中未加檢測樣本的情況出現(xiàn)，在每個(gè)反應(yīng)孔中設(shè)置有內(nèi)部質(zhì)控，應(yīng)當(dāng)注意的是檢測探針與質(zhì)控探針熒光基團(tuán)標(biāo)記為不同檢測模式的熒光基團(tuán)。具體的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成按表1配置。

結(jié)果分析時(shí)，對(duì)內(nèi)部質(zhì)控分析：根據(jù)ROC分析方法將內(nèi)控信號(hào)Ct值的分界點(diǎn)定為25。每個(gè)樣品內(nèi)控JOE信號(hào)應(yīng)有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，且Ct值<25；若Ct≥25，說明反應(yīng)體系中DNA模板上樣量不足或待檢樣本DNA中可能存在PCR抑制劑，建議適量增加DNA上樣量或重新提取樣品DNA；若內(nèi)控?zé)oCt值，可能存在待檢樣本DNA漏加等。

為了避免反應(yīng)體系受到污染或體系成分錯(cuò)加，而導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，還設(shè)有陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽性對(duì)照為以含有如SEQ ID No.10和SEQ ID No.12核苷酸序列所示的HLA-B*27:04陽性對(duì)照物、含SEQ ID No.11和SEQ ID No.12核苷酸序列所示的HLA-B*27:05陽性對(duì)照物為模板，進(jìn)行所述反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；所述陰性對(duì)照為以ddH₂O為模板，進(jìn)行所述反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；對(duì)應(yīng)的檢測結(jié)果，在步驟(4)中，所述陽性對(duì)照的反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的FAM均有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，F(xiàn)AM信號(hào)的Ct值Ct≤26，且其JOE信號(hào)有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，JOE信號(hào)的Ct值<25，符合要求；所述陰性對(duì)照的反應(yīng)體系的FAM、JOE均沒有擴(kuò)增曲線或Ct值，符合要求；否則，應(yīng)重新進(jìn)行體系配置，重新檢測。

上述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)可使用的儀器包括ABI實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(例如7300、7500、7900等)；BioRad實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)、LightCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

實(shí)施例4：檢測實(shí)施例2中制備的試劑盒的靈敏度

1、DNA梯度稀釋、上樣

選取經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證后的HLA-B*27:04和HLA-B*27:05陽性基因型DNA樣本，經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)測量濃度和純度后，用雙蒸水分別10倍等梯度稀釋到10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL。

參照實(shí)例3方法中配置PCR反應(yīng)液并加樣，設(shè)定PCR反應(yīng)程序，在ABI7500熒光定量PCR儀上運(yùn)行程序。

2、靈敏度分析

自動(dòng)設(shè)置閾值線獲取各濃度樣本Ct值。10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL的DNA上樣濃度均獲得了該位點(diǎn)陽性檢測結(jié)果，而0.01ng/μL的DNA上樣濃度由于Ct值超過陰陽性結(jié)果界定值，而判別為陰性結(jié)果。HLA-B*27:04反應(yīng)體系靈敏度檢測和HLA-B*27:05反應(yīng)體系靈敏度檢測的擴(kuò)增圖如圖1和圖2所示，因此，本發(fā)明的試劑盒能準(zhǔn)確檢測低至0.1ng/μL的DNA樣本。

實(shí)施例5：用本發(fā)明制備的試劑盒檢測臨床樣本

1、從人外周血或口腔拭子中抽提DNA樣本

從自愿者獲得20例人外周血樣本，使用天根生化科技有限公司相關(guān)DNA提取試劑盒獲取DNA樣本(詳細(xì)操作細(xì)節(jié)見相關(guān)說明書)。DNA抽提完成后，用微量紫外分光光度計(jì)檢測其濃度和純度，樣本DNA濃度不小于20ng/μL，且OD260/280在1.7～1.8之間。樣本DNA應(yīng)于-20℃長期保存，避免反復(fù)凍融。

2、PCR反應(yīng)液配制

按實(shí)施例3檢測方法中分別配制人HLA-B*27:04、HLA-B*27:05檢測體系PCR反應(yīng)液(PCR反應(yīng)體系見表1)，其中PCR反應(yīng)液包括引物、探針、熱啟動(dòng)DNA聚合酶、dNTPs混合液、PCR緩沖液(含Mg²⁺)、ddH2O。反應(yīng)液配好后分裝于PCR管中，分別向以上2個(gè)檢測體系管中加入2.0μL同一樣本DNA模板。每次實(shí)驗(yàn)均應(yīng)安排陽性對(duì)照孔和陰性對(duì)照(NTC)孔。加好樣品后蓋好管蓋，在孔板離心機(jī)上短暫離心數(shù)秒。

3、熒光PCR檢測

將PCR管放入熒光定量PCR儀器中，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增檢測。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：

第一階段：95℃變性10min；

第二階段：94℃30s，58℃30s，10個(gè)循環(huán)；

第三階段:94℃30s，60℃30s(該階段收集FAM和JOE信號(hào))，30個(gè)循環(huán)。

PCR程序運(yùn)行結(jié)束后，使用儀器自動(dòng)設(shè)置的基線和閾值線獲取各樣本Ct值。

4、結(jié)果判讀

NTC分析：正常情況下，NTC孔應(yīng)無擴(kuò)增曲線或Ct值；若NTC孔有Ct值，說明在實(shí)驗(yàn)過程中可能存在污染，應(yīng)排除污染來源后重新開始新的實(shí)驗(yàn)。

內(nèi)控分析：每個(gè)樣品內(nèi)控JOE信號(hào)應(yīng)有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，且Ct值<25；若Ct≥25，說明反應(yīng)體系中DNA模板上樣量不足或待檢樣本DNA中可能存在PCR抑制劑，應(yīng)適量增加DNA上樣量或重新提取樣品DNA；若內(nèi)控?zé)oCt值，可能存在待檢樣本DNA漏加等。

樣本基因型分析：本試劑盒包含2個(gè)檢測體系，能分別檢測HLA-B*27:04、HLA-B*27:05基因型，利用這2個(gè)檢測體系對(duì)同一樣本DNA進(jìn)行檢測，根據(jù)FAM信號(hào)Ct值對(duì)樣本HLA-B27基因型進(jìn)行判斷。根據(jù)ROC分析方法將FAM信號(hào)Ct值分界點(diǎn)定為26。在以上2孔檢測體系中，當(dāng)至少有一孔體PCR反應(yīng)體系FAM信號(hào)呈現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線，且Ct值≤26時(shí)，該待檢DNA樣本才為HLA-B27陽性，否則，為HLA-B27陰性。具體可見表2樣本基因型判斷標(biāo)準(zhǔn)。

擴(kuò)增圖的結(jié)果，如圖3為HLA-B*27:04陽性樣本擴(kuò)增曲線，如圖4為HLA-B*27:05陽性樣本擴(kuò)增曲線，如圖5為HLA-B*27:04/HLA-B*27:05雜合型樣本擴(kuò)增曲線，如圖6為HLA-B*27陰性樣本擴(kuò)增曲線。

表2樣本基因型判斷標(biāo)準(zhǔn)

將提取的20例人外周血樣本基因組DNA，分別用本發(fā)明試劑盒和Sanger測序法對(duì)樣本HLA-B27基因進(jìn)行檢測，其中測序送由武漢擎科生物技術(shù)有限公司完成。檢測結(jié)果見表3，本試劑盒檢測結(jié)果與“金標(biāo)準(zhǔn)”Sanger測序法相比較，符合率100％。結(jié)果說明本試劑盒檢測準(zhǔn)確性高、操作簡單、耗時(shí)短。

表3本試劑盒檢測結(jié)果與測序法比較

以上所述實(shí)施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢海吉力生物科技有限公司

<120> 用于檢測HLA-B27基因的檢測試劑盒和方法

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaaggccaa ggcacagac 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctctcagctg ctccggct 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgagagagcc tgcggaccct 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggagtattgg gaccgggag 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctctcagctg ctccggca 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgagaggacc tgcggaccct 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgagggttct ttgtgctga 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aggaagggct ttgtgagg 18

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catccctcac cccttcaatg ccc 23

<210> 10

<211> 273

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcaaggccaa ggcacagact gaccgagaga gcctgcggac cctgctccgc tactacaacc 60

agagcgaggc cgggtctcac accctccaga atatgtatgg ctgcgacgtg gggccggacg 120

ggcgcctcct ccgcgggtac caccaggacg cctacgacgg caaggattac atcgccctga 180

acgaggacct gagctcctgg accgccgcgg acacggcggc tcagatcacc cagcgcaagt 240

gggaggcggc ccgtgaggcg gagcagctga gag 273

<210> 11

<211> 302

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggagtattgg gaccgggaga cacagatctg caaggccaag gcacagactg accgagagga 60

cctgcggacc ctgctccgct actacaacca gagcgaggcc gggtctcaca ccctccagaa 120

tatgtatggc tgcgacgtgg ggccggacgg gcgcctcctc cgcgggtacc accaggacgc 180

ctacgacggc aaggattaca tcgccctgaa cgaggacctg agctcctgga ccgccgcgga 240

cacggcggct cagatcaccc agcgcaagtg ggaggcggcc cgtgtggcgg agcagctgag 300

ag 302

<210> 12

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgagggttct ttgtgctgag cggggccctg caggggagaa aggcccatcc ctcacccctt 60

caatgccccc actgtggcat ccctgggact ggggaggctg atggggaagg ttgagccttt 120

actagctgga tctcccagtt cctcacaaag cccttcct 158