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      用于檢測HLA?B27基因的檢測試劑盒和方法與流程

      文檔序號:12098007閱讀:來源:國知局

      技術(shù)特征:

      1.一種用于檢測HLA-B27基因的檢測試劑盒,其特征在于,該檢測試劑盒包括用于HLA-B*27:04基因檢測的引物對1及檢測探針1,和用于HLA-B*27:05基因檢測的引物對2及檢測探針2;其中,所述引物對1的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示,所述檢測探針1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述引物對2的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示,所述檢測探針2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

      2.如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒,其特征在于,所述引物和探針檢測試劑盒還包括內(nèi)部質(zhì)控,其包括質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針,所述質(zhì)控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示,所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

      3.如權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒,其特征在于,所述檢測試劑盒還包括HLA-B*27:04陽性對照物、HLA-B*27:05陽性對照物,其中,所述HLA-B*27:04陽性對照物含有如SEQ ID No.10和SEQ ID No.12所示的核苷酸序列,所述HLA-B*27:05陽性對照物含有如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。

      4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的檢測試劑盒,其特征在于,所述檢測探針1和所述檢測探針2的5'端連接熒光基團,3'端連接淬滅基團。

      5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒,其特征在于,該試劑盒還包括10×PCR緩沖液、熱啟動DNA聚合酶、dNTPs、礦物油、陰性對照物:ddH2O;所述熒光基團為FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一種,所述淬滅基團為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

      6.一種快速檢測HLA-B27基因的方法,其特征在于,該方法包括以下步驟:

      (1)從樣品中提取DNA;

      (2)對提取的所述DNA,同時進行HLA-B*27:04基因檢測的反應(yīng)體系1和HLA-B*27:05基因檢測的反應(yīng)體系2的實時熒光PCR擴增;其中,在所述反應(yīng)體系1中檢測引物對1的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示,檢測探針1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;在所述反應(yīng)體系2中檢測引物對2的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示,檢測探針2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示,所述檢測探針1和所述檢測探針2的5'端連接熒光基團,3'端連接淬滅基團;

      (3)收集熒光信號,選擇對應(yīng)熒光基團的熒光檢測模式,基線調(diào)整取3~15個循環(huán)的熒光信號,以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設(shè)定閾值線;

      (4)結(jié)果判定:待測樣品的所述HLA-B*27:04基因檢測的反應(yīng)體系1或所述HLA-B*27:05基因檢測的反應(yīng)體系2任一體系的熒光擴增曲線呈現(xiàn)典型的“S”型曲線,且Ct值≤26,則該待檢樣本基因型為HLA-B27陽性,否則為HLA-B27陰性。

      7.如權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,在步驟(2)中,所述反應(yīng)體系1和所述反應(yīng)體系2中還包括有作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針,所述質(zhì)控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示,所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示,該質(zhì)控探針的5'端連接有不同于所述檢測探針1和檢測探針2的熒光基團,3'端連接有不同于所述檢測探針1和檢測探針2的淬滅基團。

      8.如權(quán)利要求7所述的方法,其特征在于,在步驟(2)中,在所述反應(yīng)體系1和所述反應(yīng)體系2中,各自的檢測引物和檢測探針的終濃度均為300nmol/L,所述質(zhì)控引物對和所述質(zhì)控探針的終濃度均為200nmol/L;所述檢測探針1和2的5'端連接FAM,3'端連接MGB,所述質(zhì)控探針的5'端連接JOE,3'端連接TAMRA。

      9.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,步驟(2)中,所述實時熒光PCR擴增的反應(yīng)程序為:

      第一階段:95℃變性10min;

      第二階段:94℃30s,58℃30s,10個循環(huán);

      第三階段:94℃30s,60℃30s,30個循環(huán);

      信號收集:第三階段收集熒光信號;

      在所述步驟(4)中,檢測樣本的所述內(nèi)部質(zhì)控的JOE信號應(yīng)有典型的“S”型擴增曲線,且其Ct值<25,再確定所述樣本DNA的陰陽性;否則應(yīng)重新進行檢測。

      10.如權(quán)利要求9所述的方法,其特征在于,在步驟(2)中,還設(shè)有陽性對照和陰性對照,所述陽性對照為以含有如SEQ ID No.10和SEQ ID No.12核苷酸序列所示的HLA-B*27:04陽性對照物、含SEQ ID No.11和SEQ ID No.12核苷酸序列所示的HLA-B*27:05陽性對照物為模板,進行所述反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的實時熒光PCR擴增;

      所述陰性對照為以ddH2O為模板,進行所述反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的實時熒光PCR擴增;

      在步驟(4)中,所述陽性對照的反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的FAM均有典型的“S”型擴增曲線,F(xiàn)AM信號的Ct值≤26,且JOE有典型的“S”型擴增曲線且JOE信號的Ct值<25,符合要求;

      所述陰性對照的反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的FAM、JOE均沒有擴增曲線或Ct值,符合要求;否則,應(yīng)重新進行體系配置,重新檢測。

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