背景技術(shù)：
假病毒顆粒(Pseudovirus particle)也稱模擬病毒，對(duì)靶細(xì)胞只有一次感染能力，由于不能進(jìn)行病毒復(fù)制而無法產(chǎn)生新的病毒顆粒，具有很高的安全性；此外，由于假病毒表面表達(dá)病毒包膜蛋白可以模擬病毒進(jìn)入感染細(xì)胞，攜帶的報(bào)告基因還能實(shí)現(xiàn)可視化高通量快速檢測(cè)的特點(diǎn)，在高致病性病原微生物的分子生物學(xué)研究、疫苗和藥物效果評(píng)價(jià)研究中具有重要意義。

目前假病毒包裝系統(tǒng)主要包括兩大類，分別是基于鼠類白血病病毒的反轉(zhuǎn)錄病毒載體的假病毒包裝系統(tǒng)與基于慢病毒載體的假病毒包裝體系?；诼《据d體的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)由包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及轉(zhuǎn)移質(zhì)粒組成。其中，包裝質(zhì)粒表達(dá)病毒復(fù)制所需的反式激活蛋白；轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄及整合所需的順式序列，可以在其中插入靶基因或報(bào)告基因；包膜質(zhì)粒則可表達(dá)異源病毒包膜蛋白。將上述三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，可以獲得僅有一次感染能力且復(fù)制缺陷的模擬病毒或假病毒。

在傳統(tǒng)的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過改造慢病毒載體系統(tǒng)中包裝質(zhì)粒中的病毒復(fù)制元件可實(shí)現(xiàn)其安全性；通過修飾轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中的報(bào)告基因可以實(shí)現(xiàn)模擬病毒的可視化；通過更換包膜質(zhì)?？蓪?shí)現(xiàn)不同靶標(biāo)病原的模擬，如：將表達(dá)水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)作為包膜質(zhì)?？梢园b產(chǎn)生VSVG模擬病毒、將表達(dá)高致病性流感病毒的血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)作為包膜質(zhì)粒則可以包裝產(chǎn)生高致病性流感模擬病毒、將表達(dá)中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus)的棘突蛋白(Spick Protein)S作為包膜質(zhì)粒可以包裝產(chǎn)生MERS-CoV模擬病毒。

常見的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒通常只含有一種報(bào)告基因，如綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)、紅色熒光蛋白(Red Fluorescent Protein，GFP)、β-半乳糖苷酶(LacZ)或熒光素酶(Luciferase)等。GFP在長(zhǎng)波紫外或藍(lán)光波長(zhǎng)照射下可以發(fā)出綠色熒光，由于檢測(cè)時(shí)無需抗體、輔因子、酶底物等其它成分，不影響宿主細(xì)胞，可視化特點(diǎn)有利于識(shí)別活細(xì)胞中的蛋白表達(dá)，已成為生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的報(bào)告蛋白，但由于其激發(fā)后發(fā)射的熒光特異性不夠而難以應(yīng)用于活體成像示蹤監(jiān)測(cè)。螢光素酶是自然界中能夠催化底物產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的包括螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase，F(xiàn)luc)和來源于海洋橈腳類動(dòng)物(Gaussia princeps)的分泌型螢光素酶(Gaussia luciferase，Gluc)。Gluc可以高效分泌至細(xì)胞外，不須裂解細(xì)胞即可實(shí)時(shí)檢測(cè)，具有高靈敏度，可達(dá)到自動(dòng)化高通量檢測(cè)的要求，在細(xì)胞內(nèi)感染檢測(cè)、藥物篩選、細(xì)胞標(biāo)記和示蹤以及動(dòng)物活體成像等方面都得到了廣泛的應(yīng)用。

通過構(gòu)建同時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶雙報(bào)告基因的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，將其與包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，可以獲得攜帶雙報(bào)告基因模擬病毒。該研究技術(shù)將GFP和Gluc兩種報(bào)告基因優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，既能實(shí)現(xiàn)熒光顯微鏡下的感染細(xì)胞的體外可視化分析，又能實(shí)現(xiàn)對(duì)感染細(xì)胞上清進(jìn)行熒光強(qiáng)度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和定量分析，將為模擬病毒的可視化追蹤和定量分析提供有力保障。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
構(gòu)建可同時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶雙報(bào)告基因的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，并在此基礎(chǔ)上獲得高滴度的雙報(bào)告基因模擬病毒，為基于雙報(bào)告基因的模擬病毒的可視化追蹤和定量分析提供了有力保障。

附圖說明

圖1為表達(dá)雙報(bào)告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝體系的包裝質(zhì)粒pCMV HR’ΔR8.2；轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP以及包膜質(zhì)粒pCMV-VSVG的酶切鑒定結(jié)果。其中，M為λ-EcoT14I digest核酸分子標(biāo)準(zhǔn)；1為經(jīng)過Bam HI和Sal I雙酶切包裝質(zhì)粒pCMV HR’ΔR8.2；2為經(jīng)過Hind III酶切的切轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP；3為使用BamHI酶切包膜質(zhì)粒pVSV-G；4為未經(jīng)過酶切的包裝質(zhì)粒pCMV HR’ΔR8.2；5為未經(jīng)過酶切的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP；6為未經(jīng)過酶切的包膜質(zhì)粒pCMV-VSVG。

圖3為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染Huh7-CD81和Huh7細(xì)胞后的GFP蛋白表達(dá)結(jié)果。其中，圖A為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染Huh7-CD81細(xì)胞748h后熒光顯微鏡下觀察到的GFP表達(dá)即結(jié)果；圖B為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞和48h后熒光顯微鏡下觀察到的GFP表達(dá)結(jié)果。結(jié)果顯示，攜帶雙報(bào)告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒可實(shí)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的可視化。

圖4為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染Huh7-CD81和Huh7細(xì)胞后的Gluc熒光強(qiáng)度分析結(jié)果。其中，圖A為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染Huh7-CD81細(xì)胞48h后上清檢測(cè)到的Gluc熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果；圖B為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞48h后上清檢測(cè)到的Gluc熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示，攜帶雙報(bào)告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒可實(shí)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中的追蹤檢測(cè)和定量分析。

圖5為高滴度雙報(bào)告基因模擬病毒包裝流程圖。將包裝質(zhì)粒pCMV HR’ΔR8.2、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP以及包膜質(zhì)粒pCMV-VSVG共轉(zhuǎn)染293FT，48h后收獲上清，獲得雙報(bào)告基因可視化模擬病毒VSVpp。

圖6為雙報(bào)告基因模擬病毒VSVpp的P24定量分析結(jié)果。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算雙報(bào)告基因可視化模擬病毒VSVpp的P24含量為300ng/ml。

圖7為雙報(bào)告基因可視化模擬病毒VSVpp感染A549細(xì)胞和Huh7細(xì)胞后GFP示蹤分析結(jié)果。其中，圖A為雙報(bào)告基因模擬病毒VSVpp感染A549細(xì)胞后48h的GFP示蹤分析情況，圖B為雙報(bào)告基因模擬病毒VSVpp感染Huh7細(xì)胞48h后的GFP示蹤分析情況。模擬病毒VSVpp感染兩種細(xì)胞后均能在熒光顯微鏡下直接觀察到GFP的表達(dá)。

圖8為雙報(bào)告基因可視化模擬病毒VSVpp感染A549細(xì)胞與Huh7細(xì)胞后Gluc實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果。模擬病毒VSVpp感染兩種細(xì)胞后的上清實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明分泌型Gluc持續(xù)高水平表達(dá)。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社，2005)等本領(lǐng)域常用工具書中所述的條件，或按試劑生產(chǎn)廠家所建議的條件進(jìn)行。

實(shí)施例1：攜帶GFP和Gluc雙報(bào)告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP的構(gòu)建

1.1gluc-2A-eGFP目的基因的擴(kuò)增

根據(jù)模板質(zhì)粒pAAVneo-gluc-2A-eGFP序列設(shè)計(jì)引物G2GF(ATCACCGGTATGGGAGTCAAAGTTCTG)和G2GR(CGTCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCC)，上下游引物分別引入AgeI和XhoI酶切位點(diǎn)。將引物用無菌水稀釋至10umol/L。PCR反應(yīng)體系：pyrobest DNA聚合酶0.25uL，dNTP(10umol/L)4uL，10X緩沖液5uL，模板5ng，引物各2uL，無菌水補(bǔ)至50uL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性15min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小，片段大小預(yù)期為1360bp。

1.2轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA片段純化試劑盒純化后，與載體質(zhì)粒pCS-CG分別經(jīng)AgeI和XhoI雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳后，分別回收片段和載體，4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR，PCR陽性克隆經(jīng)HidIII單酶切鑒定，理論上可以得到5031bp、2901bp、584bp和553bp條帶。酶切正確的克隆進(jìn)行測(cè)序分析，獲得表達(dá)雙報(bào)告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，命名為pCS-gluc-2A-eGFP，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。

1.3包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大量制備

使用康為世紀(jì)質(zhì)粒DNA超級(jí)金牌無內(nèi)毒素大提試劑盒操作說明進(jìn)行三種質(zhì)粒的大量制備：將驗(yàn)證正確的菌液按照1∶1000比例轉(zhuǎn)接至300ml含有氨芐抗生素的細(xì)菌培養(yǎng)基LB中，4℃條件下5000rpm離心15min，收集菌體；加入P1溶液12ml充分重懸，裂解菌體；加入P2溶液12ml溫和混勻，室溫放置3-5min進(jìn)行堿裂解；加入P3溶液12ml上下混勻，室溫放置5min進(jìn)行中和；5000rpm離心20min，將上清轉(zhuǎn)移至內(nèi)毒素過濾器進(jìn)行內(nèi)毒素的去除；于濾過液中加入11ml異丙醇沉淀DNA；并將液體按照15ml/次的量，分三次轉(zhuǎn)移至平衡好的吸附柱中，5000rpm離心5min，富集DNA；向吸附柱中加入PW溶液10ml，5000rpm離心5min進(jìn)行雜蛋白的洗滌，共洗滌2遍；將吸附柱放回收集管中5000rpm離心10min，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫干燥10min，去除殘余的乙醇；最后，將吸附柱放置于新的收集管中，向膜中間位置加入1ml去內(nèi)毒素的洗脫液EB，室溫放置2～5min，5000rpm離心10min，收集質(zhì)粒溶液，-20℃保存。

1.4包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的酶切鑒定

分別使用BamHI和SalI雙酶切包裝質(zhì)粒pCMV HR’ΔR8.2，理論上可獲得6000bp、2000bp、1900bp左右的片段；使用HindIII切轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP，理論上可獲得5031bp、2901bp、584bp和553bp條帶；使用BamHI酶切包膜質(zhì)粒pVSV-G，理論上可獲得6000bp和1553bp條帶。將大提質(zhì)粒和酶切質(zhì)粒進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖2所示，三個(gè)質(zhì)粒均能在預(yù)期大小片段處有明顯條帶，結(jié)果與預(yù)期一致。

1.5轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的可視化分析

按5×10⁵細(xì)胞/孔將Huh7-CD81細(xì)胞Huh7細(xì)胞接種于六孔板中，次日細(xì)胞換液為2ml的Optim-DMEM無血清，將2ug大提的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP與HD轉(zhuǎn)染試劑按照1∶3質(zhì)量-體積比例混勻，室溫避光反應(yīng)15min后慢慢滴加至Huh7-CD81細(xì)胞或Huh7細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染后4～6h換成含2％FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48h后觀察結(jié)果。將Huh7-CD81細(xì)胞Huh7細(xì)胞在熒光倒置顯微鏡下觀察自發(fā)綠色熒光細(xì)胞情況；將細(xì)胞培養(yǎng)上清1∶20稀釋，取20uL加入50uLGluc分析底物，使用發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定其相對(duì)熒光強(qiáng)度(Relative Luciferase Unit，RLU)。細(xì)胞體外GFP示蹤結(jié)果如圖3所示，Gluc實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，雙報(bào)告轉(zhuǎn)移質(zhì)?？衫肎FP和Gluc雙報(bào)告基因?qū)崿F(xiàn)其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的可視化定量分析。

實(shí)施例2：攜帶GFP和Gluc雙報(bào)告基因的模擬病毒VSVpp的包裝與生物特性分析

2.1模擬病毒VSVGpp的包裝

將293FT細(xì)胞按照5X10⁵cell/孔的量接種6孔板，24h后吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，換成1ml無血清無抗生素的Optim-MEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO₂孵箱培養(yǎng)；將包裝質(zhì)粒pCMV HR’ΔR8.2、包膜質(zhì)粒pVSV-G和含雙報(bào)告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP按照2∶2∶1質(zhì)量比例3ug與9ul轉(zhuǎn)染試劑HD室溫避光孵育15min后，逐滴加入至293FT細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后4～6h換成含2％FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48-72h收上清獲得表達(dá)VSV包膜G蛋白的雙報(bào)告基因模擬病毒，命名為VSVpp，1000rpm離心5min，用0.45μm濾器過濾，可直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-70℃保存。模擬病毒構(gòu)建流程如圖5所示。

2.2模擬病毒VSVpp的滴定

用BIOMERIEUX的Vironostika HIV-1抗原微量ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行P24測(cè)定。計(jì)算試驗(yàn)所需的檢測(cè)孔數(shù)，每次試驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照3孔，陽性對(duì)照5孔，將標(biāo)準(zhǔn)樣品倍比稀釋5個(gè)稀釋度。取出包被條5min內(nèi)，每孔加入25ul裂解液，然后依次加入100μl待測(cè)樣品及對(duì)照，用膠紙封好。37℃孵育60min。洗滌4次，每次浸泡30秒。加入100μl酶標(biāo)抗體，37℃孵育60min。洗滌4次，每次浸泡30秒。加入100ul底物液，室溫放置30min后加入100ul 1M硫酸終止反應(yīng)，置于酶標(biāo)儀測(cè)定OD₄₅₀或OD_450/630。利用標(biāo)準(zhǔn)樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)上清OD值及稀釋度計(jì)算p24含量。P24定量標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，測(cè)得雙報(bào)告基因模擬病毒VSVpp的P24含量為300ng/ml。

2.3模擬病毒VSVpp感染細(xì)胞

按1×10⁴細(xì)胞/孔將Huh7細(xì)胞或A549細(xì)胞接種于96孔板，同時(shí)設(shè)置對(duì)照。24h后，每孔加入50ul模擬病毒；37℃吸附3～4h，每0.5h～1h輕輕搖動(dòng)3～5次。陰性對(duì)照使用無血清培養(yǎng)基替代VSVpp。PBS洗滌3次后換成100uL新鮮的2％FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4模擬病毒VSVpp的示蹤分析

將VSVpp感染的Huh7細(xì)胞和A549細(xì)胞在熒光倒置顯微鏡下觀察自發(fā)綠色熒光細(xì)胞；在感染后3h、6h、9h、12h、20h、26h、32h、48h、60h、72h、84h、86h及120h等不同時(shí)間點(diǎn)取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行1∶20稀釋，然后取20uL加入50uLGluc分析底物，使用發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定其相對(duì)熒光強(qiáng)度RLU。細(xì)胞體外GFP示蹤結(jié)果如圖7所示，模擬病毒感染Huh7細(xì)胞和A549細(xì)胞后48h即可觀察到GFP蛋白的表達(dá)，感染陽性率可達(dá)80％以上。Gluc實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果如圖8所示，Gluc的表達(dá)水平從感染后6h開始檢測(cè)到，并在感染后第5天還能檢測(cè)到，靈敏度高達(dá)10⁶RLU/20ul以上。結(jié)果表明，模擬病毒可利用GFP和Gluc雙報(bào)告基因?qū)崿F(xiàn)可視化高靈敏度定量分析。