本發(fā)明屬于植物基因工程研究技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多基因疊加共轉(zhuǎn)化提高油菜綜合抗逆性的方法。

背景技術(shù)：

油菜屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)，是世界上最重要的油料作物之一，其應(yīng)用遍及生產(chǎn)生活的各個領(lǐng)域。當前油菜育種工作者面臨的主要問題是培育油菜高抗新品種來適應(yīng)因全球氣候變化導致的非生物和生物脅迫日漸頻繁等問題。利用遺傳工程改良油菜品種在一定程度上克服了傳統(tǒng)育種模式基因交流范圍局限性的問題，是油菜育種工作可資利用的有效途徑之一。

干旱、鹽堿化、極端氣候等非生物脅迫嚴重影響作物產(chǎn)量潛力的發(fā)揮。干旱所造成的損失幾乎是其它自然災(zāi)害所造成損失的總和。因此，如何通過提高作物的抗逆能力來增加作物產(chǎn)量，已成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)高效發(fā)展的重大需求。作物抗逆育種的主要任務(wù)就是聚合存在于不同種質(zhì)資源中的有利基因，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)培育優(yōu)良的品種。由于植物耐逆性是多基因控制的復雜的數(shù)量性狀，不同抗逆信號通路之間又存在交叉對話，因此，相對于單基因轉(zhuǎn)化，將抗逆信號通路中的關(guān)鍵節(jié)點基因采用多基因疊加共轉(zhuǎn)化的方式提高植物的抗逆性具有許多不可替代的優(yōu)點。但現(xiàn)有技術(shù)中尚未見到這一方面較好的應(yīng)用報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于一種多基因疊加共轉(zhuǎn)化以提高油菜綜合抗逆性的方法，該方法通過多基因疊加共轉(zhuǎn)化，將含五種抗逆基因表達載體同時轉(zhuǎn)入油菜，從而提高油菜對多種脅迫的綜合適應(yīng)能力。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案詳述如下。

一種多基因疊加共轉(zhuǎn)化提高油菜綜合抗逆性的方法，包括如下步驟：

（1）多基因植物表達載體的構(gòu)建

通過Gateway技術(shù)，結(jié)合Cre/Loxp重組系統(tǒng)和λ噬菌體位點特異性重組系統(tǒng)，以多輪重組疊加的方式構(gòu)建了pABA-oriT載體，該載體的T-DNA區(qū)的克隆基因表達盒包含了依次串聯(lián)的5種抗逆功能基因和3種選擇標記基因；

所述5種抗逆功能基因包括：2個ABA合成相關(guān)基因NCED3、LOS5，1個ABA信號途徑相關(guān)基因ABAR，2個抗凍調(diào)節(jié)基因ICE1、CBF3；

所述3種選擇標記基因包括潮霉素抗性基因HYG、GUS和草銨膦抗性基因BAR；

5種抗逆功能基因和3種選擇標記基因在pABA-oriT載體T-DNA區(qū)的具體排列順序為：LB-HYG–GUS-BAR-ICE1-LOS5-CBF3-ABAR-NCED3-RB；

需要解釋的是：

5種抗逆功能基因由2類啟動子進行驅(qū)動表達，具體而言：

ICE1和LOS5基因由pSuper組成型超表達啟動子驅(qū)動，該啟動子的組成元件為：在甘露堿合成酶啟動子的上游依次加入甘露堿合成酶轉(zhuǎn)錄激活域和三個章魚堿合成酶轉(zhuǎn)錄激活域（Lee at.al.，2007，Novel plant transformation vectors containing the superpromotor. Plant physiology 145: 1294-1300）；

CBF3、ABAR和NCED3三個基因由脅迫誘導型超表達啟動子pRD29A驅(qū)動；

3種選擇標記基因均由35S啟動子驅(qū)動表達，以此3種選擇標記基因作為后期轉(zhuǎn)基因植物的篩選標記；

（2）對步驟（1）中所構(gòu)建的重組表達載體的鑒定

首先，利用PCR鑒定方法對步驟（1）中所構(gòu)建的重組表達載體進行鑒定，以確保5種功能基因共存于同一表達載體中，PCR鑒定時，設(shè)計的引物序列如下：

NCED –F：5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

NCED-R：5' TAGTGTTGGATTCTTTGGCTTTGG 3'；

ABAR-F：5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

ABAR-R：5’ ACTTTAATCGCCAATTCCTCGACG 3’；

CBF–F： 5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

CBF-R： 5’ TTGAAATGTTCCGAGCCAAATCCT 3’；

LOS5-F：5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’，

LOS5-R：5’ CTATAAGGTCACTGGTGGCCGAAC 3’；

ICE1-F：5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’，

ICE1-R：5’ CTCTTCCCTTTCTCCACCACCACC 3’；

其次，對PCR鑒定正確的重組表達載體進一步進行測序驗證，以確保5種功能基因的表達框完整正確；

（3）對步驟（2）中鑒定正確的重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，制備轉(zhuǎn)化液

將步驟（2）中鑒定正確的重組表達載體質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，具體步驟參考如下：

吸取1~2μL質(zhì)粒加入到100μL農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，2.5KV電擊轉(zhuǎn)化5ms，然后迅速加入1mL SOC培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩復蘇培養(yǎng)1~2 h；

取200μL菌液涂布于含50 mg/L 卡那霉素、50 mg/L慶大霉素、10 mg/L四環(huán)素的YEB固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)1~2d；然后挑選陽性克隆進行PCR鑒定；

首先，挑取2~3個PCR鑒定正確的陽性單克隆菌斑混合（以防單個克隆小質(zhì)粒丟失影響轉(zhuǎn)化效率）接種于YEP液體培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L慶大霉素、10 mg/L四環(huán)素）中，28℃、220 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀ = 0.6左右；

然后，取1 mL菌液接種至500 mL的YEP液體培養(yǎng)基（含25 mg/L卡那霉素、25 mg/L慶大霉素、5 mg/L四環(huán)素）中，28℃、220 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀ = 1.0~1.5左右；

最后，4000 rpm室溫離心15 min，棄上清，將富集的菌種用轉(zhuǎn)化Buffer重懸，稀釋至OD₆₀₀ = 0.8~1.0左右，即為轉(zhuǎn)化液，備用；

所述轉(zhuǎn)化Buffer，為1/2 MS培養(yǎng)液+5%質(zhì)量分數(shù)蔗糖+0.05%體積分數(shù)Silwet-L77+0.01 mg/L的6-BA+8 mg/L的乙酰丁香酮（acetosyringone）；

需要注意的是，轉(zhuǎn)化Buffer及轉(zhuǎn)化液需現(xiàn)用現(xiàn)配；

（4）采用農(nóng)桿菌介導的浸花法（Flower-dip）轉(zhuǎn)化油菜

首先，對油菜進行預處理，將油菜種子播種后，在油菜第一朵花開放后的2~3天內(nèi)，于轉(zhuǎn)化的前一天，選擇生長健壯的植株，去掉多余分枝（即去除多余側(cè)花序），每株僅保留主花序及2~3枝生長狀態(tài)較好的側(cè)花序，摘除已開花朵以及花序頂端直徑小于5 mm的小花蕾，將保留花序套袋待轉(zhuǎn)化用；

其次，轉(zhuǎn)化時，將整個花序浸入轉(zhuǎn)化液中浸泡90~120秒，期間輕輕晃動轉(zhuǎn)化液，以防止農(nóng)桿菌沉淀，從而影響轉(zhuǎn)化效果；

轉(zhuǎn)化后套袋并掛牌標記；

優(yōu)選情況下，相同操作方式及方法，隔天轉(zhuǎn)化1次，連續(xù)轉(zhuǎn)化3次；

最后，在最后一次轉(zhuǎn)化后，繼續(xù)套袋5天后去袋，剪掉多余的正在開放的花朵和未開放花蕾，使轉(zhuǎn)化莢果正常生長，直至成熟后，按單株收獲種子；

需要說明的是，所述油菜具體例如為甘藍型油菜，室外轉(zhuǎn)化操作時為避免白天紫外線過強對農(nóng)桿菌活力造成影響，轉(zhuǎn)化操作優(yōu)選在傍晚時分進行；

（5）轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定

將步驟（4）中所收獲油菜種子播種，播種7~10天后，在油菜幼苗心葉剛長出時，噴施50 mg/L除草劑 Basta（主要成分為草銨膦），隔日一次，共三次；

對對Basta表現(xiàn)出抗性的油菜幼苗進行潮霉素抗性篩選，具體為：在四葉期時，在油菜幼苗完全舒展的第三片真葉表面涂抹50 mg/L潮霉素，進行潮霉素抗性篩選；

對對Basta和潮霉素均表現(xiàn)出抗性的油菜幼苗，取其葉片，提取基因組DNA進行PCR鑒定和測序鑒定，PCR鑒定時所用引物序列同步驟（2）中引物序列；

（6）轉(zhuǎn)化體自交獲得純合體

對步驟（5）中篩選、鑒定正確的轉(zhuǎn)化體繼續(xù)培養(yǎng)，于花期時套袋，使其自交，收獲單株種子；

對收獲的種子繼續(xù)種植，同步驟（5）操作，繼續(xù)進行Basta抗性、潮霉素抗性、PCR鑒定和測序鑒定，并對鑒定正確的轉(zhuǎn)化體繼續(xù)自交；

經(jīng)4代連續(xù)自交鑒定后獲得轉(zhuǎn)化純合體，即具有綜合抗逆特性的轉(zhuǎn)基因油菜。

（7）對篩選所獲得轉(zhuǎn)基因油菜進行抗逆特性分析

對步驟（6）中所獲得的轉(zhuǎn)基因油菜種子，在播種后，可進一步對其表型、農(nóng)藝性狀進行分析，另外可對其在不同脅迫條件下生長狀況時的葉溫、氣孔開度、失水率、脫落酸（ABA）含量、丙二醛（MDA）含量等生理指標變化情況進行測定，從而綜合判定轉(zhuǎn)基因油菜的抗逆能力和生產(chǎn)應(yīng)用潛力。

一種培育具有綜合抗逆性油菜新品種的方法，該方法通過多基因疊加共轉(zhuǎn)化法實現(xiàn)。

和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法的有益效果：

植物的許多性狀如產(chǎn)量、抗逆性等由多基因控制，運用遺傳工程方法改良這些由多基因控制的性狀，必須進行多基因的疊加組合。傳統(tǒng)的多基因轉(zhuǎn)化方法主要有：1）將多個基因分別轉(zhuǎn)化不同植株，然后通過雜交成功獲得多基因轉(zhuǎn)化體；2）多個基因分別構(gòu)建于不同表達載體，通過重轉(zhuǎn)化獲得多基因轉(zhuǎn)化植株。這些方法費時費力、周期較長，限制了它們在應(yīng)用領(lǐng)域的優(yōu)勢。

本發(fā)明通過優(yōu)化抗性基因組合，并將多個抗逆關(guān)鍵節(jié)點基因構(gòu)建于同一表達載體中。在將該載體轉(zhuǎn)化植物體例如油菜后，一次轉(zhuǎn)化即可使植物體能夠同時獲得多種抗逆性，即：可使植物在多種逆境脅迫條件下高效快速的啟動機體抗逆反應(yīng)，降低逆境脅迫對機體的損傷；而且，由于多種抗性基因具有一定協(xié)同作用，可高效改良作物的多基因控制的數(shù)量性狀，提高植物的綜合抗逆能力，使其在營養(yǎng)生長和生殖生長階段均表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢，具有較好的生產(chǎn)應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為油菜遺傳轉(zhuǎn)化流程，其中a.初花期轉(zhuǎn)化；b.轉(zhuǎn)化后套袋；c.轉(zhuǎn)化株結(jié)實；

圖2為轉(zhuǎn)化體Basta和潮霉素抗性篩選；

圖3 為高溫脅迫處理生長表型，其中a、b. 苗期；c. 花期；d. 結(jié)實期；

圖4為干旱脅迫處理生長表型；

圖5為冷脅迫處理生長表型；

圖6為 15% PEG 6000干旱脅迫處理下5種功能基因的表達分析，其中**：兩個樣本平均數(shù)t 檢驗P值≦0.01；*：兩個樣本平均數(shù)t 檢驗P值≦0.05；誤差值：平均數(shù)+s.e；

圖7為150 mM NaCl鹽脅迫處理下5種功能基因的表達分析，其中**：兩個樣本平均數(shù)t 檢驗P值≦0.01；*：兩個樣本平均數(shù)t 檢驗P值≦0.05；誤差值：平均數(shù)+s.e；

圖8 為幼苗根長和株高比較，其中(A) 不同脅迫處理下幼苗根長差異；(B) 不同脅迫處理下幼苗株高差異；Mock：空白對照；NaCl：100 mM NaCl；甘露醇：200mM甘露醇；ABA：5 μM ABA；**：兩個樣本平均數(shù)t 檢驗P值≤0.01；*：兩個樣本平均數(shù)t 檢驗P值≤0.05；誤差值：平均數(shù)+s.d；

圖9 為多基因轉(zhuǎn)化體K15與非轉(zhuǎn)基因植株WT的葉面溫度比較，其中(A) 第二片真葉葉面溫度；(B) 第三片真葉葉面溫度 a. 土壤含水量35%；b. 土壤含水量5%；

圖10為 氣孔開度和失水率，其中(A) 氣孔開度觀察；(B) 氣孔開度測量；(C) 葉片失水率；**：兩個樣本平均數(shù)t 檢驗P值≤0.01；*：兩個樣本平均數(shù)t 檢驗P值≤0.05；誤差值：平均數(shù)+s.d；

圖11為ABA含量測定和MDA含量測定，其中(A) 幼苗中ABA含量；(B) 葉片中ABA含量 35%、0%：土壤含水量；(C) 葉片中MDA含量 Mock：空白對照；**：兩個樣本平均數(shù)t 檢驗P值≤0.01；*：兩個樣本平均數(shù)t 檢驗P值≤0.05；誤差值：平均數(shù)+s.d。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本申請的技術(shù)方案做進一步的解釋說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中所涉及部分物料、實驗設(shè)備、實驗場地等情況簡要介紹如下。

生物材料：

需要解釋的是，本申請中所采用的5種抗逆功能基因和3種選擇標記基因PCR擴增引物組合，由發(fā)明人設(shè)計，由上海生工生物工程公司合成提供，pABA-oriT載體的構(gòu)建，按照現(xiàn)有技術(shù)操作，通過Gateway技術(shù)，結(jié)合Cre/Loxp重組系統(tǒng)和λ噬菌體位點特異性重組系統(tǒng)構(gòu)建而成，由于相關(guān)操作屬于現(xiàn)有基因重組技術(shù)中較為常規(guī)操作，故此不再詳細說明；

下述實施例中所采用的轉(zhuǎn)基因受體材料為甘藍型油菜Y42，屬于一種公開型的雜交油菜細胞質(zhì)雄性不育恢復系，但本發(fā)明的實現(xiàn)并不依賴于該特定油菜品種，也可采用其他油菜品種（品系）進行相關(guān)操作；

下述實施例中相關(guān)引物合成、測序工作均由上海生工生物工程公司進行完成；

主要實驗設(shè)備：

遠紅外熱成像儀SC-3000 ，美國熱電產(chǎn)品；

失水測量系統(tǒng) (QUIN TIX-224-1CN)，德國賽多利斯產(chǎn)品；

實驗場地：

油菜材料的室內(nèi)種植在河南大學的相關(guān)人工氣候室內(nèi)進行，室外種植在河南大學校內(nèi)試驗田內(nèi)進行；日常管理參考現(xiàn)有育種試驗田條件常規(guī)操作；

人工氣候室材料種植在7cm×7cm×8cm（長×寬×高）的營養(yǎng)缽中，基質(zhì)材料為擬南芥營養(yǎng)土；

水培材料種植在1/2 Hoagland中。

實施例1

本發(fā)明所提供的多基因疊加共轉(zhuǎn)化提高油菜綜合抗逆性的方法，其以構(gòu)建含有多基因植物重組表達載體作為基礎(chǔ)，因而本實施例僅就該重組表達載體的構(gòu)建過程及其鑒定過程簡要介紹如下。

需要說明的是，下述實施例中所用重組載體pABA-oriT載體，通過Gateway技術(shù)，結(jié)合Cre/Loxp重組系統(tǒng)和λ噬菌體位點特異性重組系統(tǒng)，以多輪重組疊加的方式構(gòu)建而成，相關(guān)技術(shù)操作具體例如可參考專利《一種構(gòu)建同時表達多個基因的重組表達載體的方法》（專利申請?zhí)枺?010102949516）中相關(guān)操作即可，本申請不再重復。

需要強調(diào)的是，本申請中所采用的重組載體pABA-oriT載體，該載體的T-DNA中的克隆基因表達盒所包含基因序列是經(jīng)過特定設(shè)計和組合的，共包含了依次串聯(lián)的5種抗逆功能基因和3種選擇標記基因；

所述5種抗逆功能基因包括：2個ABA合成相關(guān)基因NCED3、LOS5，1個ABA信號途徑相關(guān)基因ABAR，2個抗凍調(diào)節(jié)基因ICE1、CBF3；

所述3種選擇標記基因包括潮霉素抗性基因HYG、GUS和草銨膦抗性基因BAR；

5種抗逆功能基因和3種選擇標記基因在pABA-oriT載體T-DNA區(qū)的具體排列順序為：LB-HYG–GUS-BAR-ICE1-LOS5-CBF3-ABAR-NCED3-RB。

需要解釋的是：

5種抗逆功能基因由2類啟動子進行驅(qū)動表達，具體而言：

ICE1和LOS5基因由pSuper組成型超表達啟動子驅(qū)動，該啟動子的組成元件為：在甘露堿合成酶啟動子的上游依次加入甘露堿合成酶轉(zhuǎn)錄激活域和三個章魚堿合成酶轉(zhuǎn)錄激活域；

CBF3、ABAR和NCED3三個基因由脅迫誘導型超表達啟動子pRD29A驅(qū)動；

3種選擇標記基因均由35S啟動子驅(qū)動表達，以此3種選擇標記基因作為后期轉(zhuǎn)基因植物的篩選標記。

利用PCR鑒定方法對所構(gòu)建的pABA-oriT重組表達載體進行鑒定，以確保5種抗逆功能基因共存于同一表達載體中，PCR鑒定時，引物序列設(shè)計如下：

NCED–F：5' –AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT- 3'，

NCED-R：5' –TAGTGTTGGATTCTTTGGCTTTGG-3'；

ABAR-F：5' –AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT- 3'，

ABAR-R：5'-ACTTTAATCGCCAATTCCTCGACG -3’；

CBF–F： 5'–AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT-3'，

CBF-R： 5'–TTGAAATGTTCCGAGCCAAATCCT-3'；

LOS5-F：5'–ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC-3'，

LOS5-R：5'–CTATAAGGTCACTGGTGGCCGAAC-3'；

ICE1-F：5'–ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC-3'，

ICE1-R：5' –CTCTTCCCTTTCTCCACCACCACC-3'；

進一步地，對PCR鑒定正確的重組表達載體進一步進行測序驗證，以確保5種功能基因的表達框完整正確。

實施例2

利用實施例1所制備的pABA-oriT重組載體，發(fā)明人進一步制備了轉(zhuǎn)化液，并利用農(nóng)桿菌介導的浸花法（flower-dip）對油菜進行了轉(zhuǎn)基因操作，相關(guān)實驗過程簡要介紹如下。

制備轉(zhuǎn)化液

將鑒定正確的重組載體pABA-oriT電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，具體過程為：

吸取1 μL質(zhì)粒加入到100 μL農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，2.5 KV電擊轉(zhuǎn)化5 ms，然后迅速加入1mL SOC培養(yǎng)基，28℃、200 rpm振蕩復蘇培養(yǎng)1.5 h；

取200 μL菌液涂布于含50 mg/L 卡那霉素、50 mg/L慶大霉素、10 mg/L四環(huán)素的YEB固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)2 d；然后挑選陽性克隆進行PCR鑒定；

首先，挑取2個PCR鑒定正確的陽性單克隆菌斑混合接種于YEP液體培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L慶大霉素、10 mg/L四環(huán)素）中，28℃、220 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀ = 0.6左右；

然后，取1 mL菌液接種至500 mL的YEP液體培養(yǎng)基（含25 mg/L卡那霉素、25 mg/L慶大霉素、5 mg/L四環(huán)素）中，28℃、220 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀ = 1.0左右；

最后，4000 rpm室溫離心15 min，棄上清，將富集的菌種用轉(zhuǎn)化Buffer重懸，稀釋至OD₆₀₀ = 1.0左右，即為轉(zhuǎn)化液，備用；

所述轉(zhuǎn)化Buffer，為1/2 MS培養(yǎng)液+5%質(zhì)量分數(shù)蔗糖+0.05%質(zhì)量分數(shù)Silwet-77+0.01 mg/L的6-BA+8 mg/L的乙酰丁香酮（acetosyringone）；

需要注意的是，轉(zhuǎn)化Buffer及轉(zhuǎn)化液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

轉(zhuǎn)化油菜

本實施例主要是采用農(nóng)桿菌介導的浸花法（Flower-dip）將含ABAR、NCED3、LOS5、CBF3、ICE1五種抗逆功能基因的真核表達雙元載體（重組載體pABA-oriT）轉(zhuǎn)化油菜；轉(zhuǎn)化受體材料為甘藍型油菜Y42，轉(zhuǎn)化于油菜初花期進行，部分實驗操作如圖1所示，具體過程簡要介紹如下。

首先，對油菜進行預處理，將油菜種子播種后，在油菜第一朵花開放后的2~3天內(nèi)，于轉(zhuǎn)化的前一天，選擇生長健壯的植株，去掉多余分枝（即去除多余側(cè)花序），每株僅保留主花序及2~3枝生長健壯的側(cè)花序，摘除已開花朵以及花序頂端直徑小于5 mm的小花蕾，將保留花序套袋待轉(zhuǎn)化用。

其次，選擇下午17:00左右進行轉(zhuǎn)化操作，轉(zhuǎn)化時，將整個花序浸入轉(zhuǎn)化液中浸泡90~120秒左右，期間輕輕晃動轉(zhuǎn)化液，以防止農(nóng)桿菌沉淀，從而影響轉(zhuǎn)化效果；

轉(zhuǎn)化后套袋保濕并掛牌標記；

相同操作，隔天轉(zhuǎn)化1次，連續(xù)轉(zhuǎn)化3次；

最后一次轉(zhuǎn)化后，繼續(xù)套袋5天后去袋，剪掉多余的正在開放的花朵和未開放花蕾，使轉(zhuǎn)化莢果正常生長，直至成熟后，按單株收獲種子。

最終，在5株轉(zhuǎn)化受體油菜上收獲T0代種子約4100粒，平均結(jié)實率為820粒/株。

實施例3

對實施例2所獲得的轉(zhuǎn)基因油菜種子，由于存在一部分假陽性種子，因而尚需進一步進行抗性篩選和鑒定，同時為便于生產(chǎn)使用，還需進一步制備純合體，本實施例就相關(guān)的篩選、鑒定及純合體的獲得過程簡要介紹如下。

轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定

將實施例2中所收獲的T0代種子播種于溫室中，播種7~10天后，在油菜幼苗心葉剛長出時（即第一片真葉出線時），葉面噴施50 mg/L 除草劑 Basta（主要成分為草銨膦），隔日一次，共噴施三次。一周后，非轉(zhuǎn)化體植株對Basta敏感而葉緣發(fā)黃、葉片皺縮、新生真葉失綠、植株逐漸干枯死亡；而轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出對Basta抗性而生長正常 (如圖2所示)。

對對Basta表現(xiàn)出抗性的油菜幼苗繼續(xù)培養(yǎng)其至四葉期，在幼苗完全舒展的第三片真葉表面涂抹50 mg/L潮霉素，5天后觀察幼苗的潮霉素抗性，非轉(zhuǎn)基因植株葉片涂抹潮霉素區(qū)域密布褐色斑點，并逐漸失綠干枯；而轉(zhuǎn)基因植株葉片生長正常 (如圖2所示)。

對Basta和潮霉素均表現(xiàn)出抗性（雙重抗性）的油菜幼苗，取其葉片，提取基因組DNA，分別用Basta抗性基因引物和潮霉素抗性基因引物進行兩輪PCR鑒定；

PCR鑒定時，Basta抗性基因引物設(shè)計為：

BAR-F：5'-CGGTCTGCACCATCGTCAACCACT-3'，

BAR-R：5' –ACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTC- 3'；

潮霉素抗性基因引物設(shè)計為：

HYG-F：5'- TGCTGCTCCATACAAGCCAA- 3'，

HYG-R：5'-ACCGCAAGGAATCGGTCAAT-3'；

PCR反應(yīng)程序設(shè)計為：95℃、5min；95℃、40s，55℃~65℃、30s，72℃、30~60s，35個循環(huán)，72℃、10min。

對兩輪PCR鑒定均呈陽性的植株移至田間培養(yǎng)，于花期套袋自交，成熟后按單株收獲種子并繼續(xù)重復上述鑒定工作，進行Basta抗性、潮霉素抗性、PCR鑒定，直至獲得轉(zhuǎn)化純合體。

最終，經(jīng)過連續(xù)4代鑒定，獲得了9個轉(zhuǎn)基因純合株系。

實施例4

對實施例3中篩選所獲得的其中一個具有綜合抗逆特性的轉(zhuǎn)基因油菜株系命名為多基因轉(zhuǎn)化材料K15，以非轉(zhuǎn)基因原始材料（即，甘藍型油菜Y42，WT）作為對照，發(fā)明人進一步對其農(nóng)藝性狀、逆境脅迫條件下生長表型、生理變化等進行了分析，相關(guān)實驗簡要介紹如下。

大田生長環(huán)境下農(nóng)藝性狀

大田模式下（植株間距和行間距各約25 cm）分別播種K15和WT材料，于全部植株開花時測量K15及WT材料的農(nóng)藝形狀，包括分枝數(shù)、根長、株高、鮮重、干重等。測定結(jié)果如下表所示：

注：* 兩個樣本平均數(shù)t 檢驗存在顯著性差異；** 兩個樣本平均數(shù)t 檢驗存在極顯著性差異。

對上表數(shù)據(jù)進行分析，可以看出，在盛花期，K15植株分枝數(shù)、根長、株高、鮮重、干重均顯著或極顯著多于或高于WT。如K15植株的鮮重和干重分別為660.0g、99.2 g，而WT植株的鮮重和干重分別為282.5 g、45.6 g，無論是鮮重還是干重均高于WT植株兩倍多。

逆境脅迫條件下的生長表型

（1）高溫脅迫下的生長表型

分別在苗期和營養(yǎng)生長階段對K15和WT材料進行高溫脅迫 (30℃~35℃)處理，具體處理方法：

完成點種的營養(yǎng)缽按每盤15缽的數(shù)量放置于塑膠盤內(nèi)，移入人工智能調(diào)節(jié)氣候室，于16/8光/暗、30~35℃、空氣相對濕度35-40% 的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中適時澆灌1/2 Hoagland營養(yǎng)液，使營養(yǎng)土濕度始終保持在30% 左右；

5葉期移入塑料桶中在相同條件下繼續(xù)生長觀察表型。

結(jié)果表明，K15植株對高溫脅迫的耐受性明顯高于WT (圖3)。而且K15植株的耐高溫性不僅表現(xiàn)在K15植株在苗期和營養(yǎng)生長階段均具有絕對的生長優(yōu)勢；最主要的區(qū)別在于，持續(xù)高溫下，K15可以順利完成由營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變，而WT植株在持續(xù)高溫下因未進行低溫春化而不能完成營養(yǎng)生長到生殖生長的過渡。

（2）干旱脅迫下的生長表型

溫室種植的K15和WT材料，在營養(yǎng)生長兩個月后停止灌水，進行持續(xù)干旱并觀察植株長勢和表型。

實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因材料能繼續(xù)生長進入生殖生長階段，而非轉(zhuǎn)基因材料無法進入生殖生長階段而逐漸干枯死亡，轉(zhuǎn)基因材料的抗旱性明顯強于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧希▓D4）。

（3）低溫脅迫下的生長表型

首先在人工氣候室16/8 光/暗、25℃、空氣相對濕度35-40%正常條件下，營養(yǎng)缽幼苗生長至四葉期，選取生長狀況一致的K15幼苗和WT幼苗置于0℃低溫下處理12 h，之后移入人工氣候室繼續(xù)在正常條件下培養(yǎng)，觀察植株的受害程度及表型。

實驗結(jié)果表明，低溫脅迫處理后，相對于K15，WT幼苗萎蔫程度更嚴重，K15植株的抗冷能力明顯優(yōu)于WT，表現(xiàn)出絕對的生長優(yōu)勢（圖5）。

材料抗逆性的綜合分析

（1）萌發(fā)率

分別在含100 mM NaCl、200 mM甘露醇、5 μM ABA的MS固體培養(yǎng)基上點播K15和WT種子，暗處理兩天后進行萌發(fā)率統(tǒng)計實驗。分別于點種后第3天、第4天、第5天和第9天統(tǒng)計種子萌發(fā)數(shù)，統(tǒng)計時間固定在每天上午8: 00點。

脅迫處理下不同時間點種子萌發(fā)率的統(tǒng)計結(jié)果如下表所示：

注：萌發(fā)率用重復測量平均值表示。

對上表數(shù)據(jù)分析可以發(fā)現(xiàn)，相對于WT而言，K15種子具有明顯的萌發(fā)優(yōu)勢，對逆境脅迫的敏感性顯著低于WT。在100 mM NaCl、200 mM甘露醇、5 μM ABA處理條件下，K15種子分別于第5天、第7天、第9天達到最高萌發(fā)率，分別為100%、99%、98%。而WT種子在NaCl、甘露醇脅迫處理條件下，萌發(fā)率始終較低，至第9天其萌發(fā)率分別為81%、77%；ABA處理條件下，WT種子至第9天才達到最高萌發(fā)率 (97%)。

（2）幼苗根長和株高

對上述萌發(fā)率實驗中的種子繼續(xù)進行培育，在點種后第10天，測量幼苗根長和株高，以每培養(yǎng)皿內(nèi)某樣品所有植株根長、株高的平均數(shù)代表一個有效數(shù)據(jù) (cm/株)。

結(jié)果表明 (圖8)，3種脅迫處理條件下，K15幼苗的根長均顯著高于WT。在100 mM NaCl、200 mM甘露醇處理條件下，K15幼苗的株高略高于WT幼苗，并沒有達到顯著性差異；5 μM ABA處理條件下，K15幼苗的株高顯著高于WT。

（3）幼苗干重和鮮重

幼苗根長、株高測量完成后，稱量鮮重，以每培養(yǎng)皿中某樣品編號內(nèi)所有植株總鮮重除以該編號植株總數(shù)后的平均數(shù)代表一個有效數(shù)據(jù) (mg/株)，每編號測量5皿，共得5個有效數(shù)據(jù)，每組實驗重復3次。幼苗鮮重稱量完成后，裝入對應(yīng)編號透氣性強的牛皮紙袋中。于105℃烘箱中烘焙15 min殺青；之后于75℃電熱鼓風干燥箱中，恒溫干燥24 h。稱量干重，有效數(shù)據(jù)計算方法同鮮重 (mg/株)。相對鮮重或相對干重以脅迫處理下幼苗鮮重或干重與未脅迫處理時幼苗鮮重或干重的比值表示。統(tǒng)計結(jié)果如下表所示：

注：* 兩個樣本平均數(shù)t 檢驗存在顯著性差異。

對上表統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析后，可以看出，三種脅迫處理條件下，K15幼苗的相對干重和相對鮮重均高于WT。但是只有200 mM甘露醇處理條件下K15幼苗的相對鮮重顯著高于WT (P=0.027)，其余均沒有達到顯著性差異。與正常生長幼苗相比，脅迫處理后K15幼苗干重和鮮重的下降幅度均低于WT幼苗，說明同等脅迫條件下，K15受脅迫影響較小，其持水能力及生物量積累量均高于WT。

綜上結(jié)果，從種子萌發(fā)及萌發(fā)后幼苗的生長指標來看，K15對逆境脅迫的抗性顯著高于WT。

（4）葉面溫度測量

溫室分別種植K15和WT材料，在幼苗生長至四葉期時，分別于土壤含水量為35% 和5% 時利用遠紅外熱成像儀測量幼苗第二片和第三片離體真葉的葉面溫度。

結(jié)果如圖9所示。測定結(jié)果表明，當土壤含水量為35% 左右時，兩種材料第二片和第三片離體真葉的葉面溫度差別不大；當土壤含水量降至5% 左右時，K15幼苗第二片和第三片離體真葉葉面溫度明顯高于WT，平均溫度分別高出2℃、1.5℃左右。這一結(jié)果表明，干旱脅迫后，由于K15幼苗葉面溫度高于WT，說明K15蒸騰失水速率和失水量小于WT，植株持水能力高于WT，對干旱脅迫的耐受性高于WT。

（5）氣孔開度和失水率測定

溫室分別種植K15和WT材料，在幼苗生長至四葉期時，觀測當日8: 00點左右取樣，選取第二片真葉以葉脈為中軸線，平均分為兩部分：

一部分置于油菜氣孔緩沖液中(60 mM KCl、10 mM，固體Tris調(diào)PH至6.15)，在285 μmol/m²/s光強下光照誘導氣孔開放，誘導過程中葉片下表皮面向光照；5 h后小心撕取葉片下表皮，毛筆輕輕刷去葉肉細胞，制片后于體視顯微鏡下觀察照相，并進行氣孔觀察和氣孔開度測量；

同一葉片中另一半葉片繼續(xù)生長，于觀測當日10: 00點左右，離體置于氣孔緩沖液中，葉片處理、觀察照相同上；

氣孔開度以實測氣孔寬度與實測氣孔長度比值的百分比表示 (%)。

結(jié)果如圖10。圖10A 表明，兩種材料的氣孔密度并沒有明顯差異。進一步測量氣孔開度后發(fā)現(xiàn)(圖10B)，不管有無光照處理，WT葉片的氣孔開度都極顯著大于K15。光照處理后，WT葉片的氣孔開度迅速增加 (t檢驗P值為1.34×10^-8)；K15葉片氣孔雖然也受光照誘導，但是與WT相比，其氣孔開度僅略有增大 (t檢驗P值為4.8×10^-4)。

氣孔開度直接影響到植株的持水能力，利用失水測量系統(tǒng)進一步測量K15和WT離體葉片 (第二片真葉) 的失水率。測量時，于測量當日10: 00點左右開始，測量時間持續(xù)至22: 00點，歷時12 h。

結(jié)果表明 (圖10 C)，K15葉片具有更強的持水能力。由圖10C 可知，失水測量實驗進行30 min后，K15和WT的離體葉片失水率開始出現(xiàn)明顯差異。實驗持續(xù)到350 min時，K15離體葉片的失水率僅有20% 左右 ，而此時WT離體葉片失水率已高達50% 以上。700 min 后，K15離體葉片的失水率接近35%，而WT離體葉片失水率高達80% 左右。

以上結(jié)果說明，在逆境脅迫條件下，與WT相比，K15可以更加有效的控制氣孔開度，進而降低葉片蒸騰失水，增強植株保水能力，有效提高對干旱脅迫的抵抗力。

（6）ABA和MDA含量測定

由于轉(zhuǎn)化的5個功能基因中含2個ABA合成相關(guān)基因 (NCED3、LOS5) 和1個ABA信號途徑相關(guān)基因 (ABAR)，為驗證這些功能基因超表達后的作用，發(fā)明人進一步測定了K15和WT植株中的ABA（脫落酸）含量和MDA（丙二醛）含量。

MDA含量采用硫代巴比妥酸 (TBA)法測定，ABA含量采用酶聯(lián)免疫法（Elisa）測定。

植株中ABA含量測定時，植株材料來源有兩部分：Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)7天的幼苗澆灌15% PEG6000脅迫處理12 h后取樣；溫室營養(yǎng)缽中培養(yǎng)至四葉期的幼苗，停止灌水后用土壤水分測定儀（英國Delta-T公司，WET-2）測量土壤含水量，分別于土壤含水量35%、0% 時取第三片真葉；

植株中MDA含量測定時，溫室營養(yǎng)缽中培養(yǎng)至四葉期的正常生長幼苗，用20% PEG6000處理12 h后取第三片真葉為測量樣本。

測定結(jié)果表明：

未脅迫處理條件下，K15幼苗中的ABA含量分別為357.8 ng/g和299.3 ng/g，葉片中分別為168.3 ng/g和130.5 ng/g，幼苗和葉片中的ABA含量顯著高于WT；

脅迫處理后，K15和WT幼苗中的ABA含量分別為507.7 ng/g、380.6 ng/g，葉片中分別為267.9 ng/g、190.9 ng/g；

脅迫處理后K15幼苗和葉片中的ABA含量迅速增加，與WT相比達到極顯著差異(圖11A，B)。

MDA為膜脂過氧化產(chǎn)物，植物體內(nèi)MDA含量可直接反應(yīng)植株體內(nèi)自由基水平和脅迫條件下植物中細胞的生理損傷水平。

MDA含量測定結(jié)果表明：

未脅迫處理時，K15和WT葉片中的MDA平均含量分別為5.73 μM /g、3.20 μM /g；

脅迫處理后，K15和WT葉片中的MDA含量均急劇增加，分別高達11.16 μM /g、7.37 μM /g；此時K15中的MDA含量極顯著低于WT，其增加倍數(shù)也明顯低于WT (K15為1.9倍，WT為2.3倍) (圖11C)。

綜合上述ABA和MDA含量測定結(jié)果表明，K15體內(nèi)ABA含量極顯著高于WT，同時MDA含量極顯著低于WT，這種結(jié)果可以準確解釋K15與WT之間的一系列表型差異和抗逆性差異。

基因表達分析

上述實驗均是基于植株的表型、生理指標方面的分析，發(fā)明人進一步就K15材料中所轉(zhuǎn)化的相關(guān)基因在不同脅迫處理時的表達量變化情況進行了測定分析，相關(guān)實驗簡要介紹如下。

需要說明的是，所構(gòu)建的轉(zhuǎn)化載體中5種功能基因表達盒的表達模式不盡相同，其中，ICE1和LOS5基因表達盒中為pSuper組成型超表達啟動子；CBF3、ABAR和NCED3三個基因表達盒為脅迫誘導型啟動子pRD29A，受脅迫誘導表達。

對基因表達量進行測定時，采用qRT-PCR技術(shù)進行分析，qRT-PCR分析時，引物序列設(shè)計如下：

。

溫室內(nèi)營養(yǎng)缽中分別種植K15和WT，對生長至第7天的幼苗進行脅迫處理。脅迫處理分兩種：15% PEG6000模擬干旱脅迫處理和150 mM NaCl鹽脅迫處理。

模擬干旱脅迫處理

15% PEG6000脅迫處理后，5種功能基因的qRT-PCR表達分析表明，K15植株中5種功能基因具有不同的表達模式。

脅迫處理前，pSuper驅(qū)動的ICE1和LOS5在K15植株中的表達量已經(jīng)顯著高于WT (3倍左右)；PEG6000脅迫處理后，兩種材料中ICE1和LOS5基因表達量均上調(diào)，K15植株中基因表達量上調(diào)幅度更大。處理12 h時，K15中ICE1、LOS5基因和WT中LOS5基因的表達豐度均達到最高點，之后開始下降。

誘導型啟動子pRD29A驅(qū)動表達的CBF3、ABAR和NCED3三個基因的表達模式極為相似。脅迫處理前，兩種材料中3種基因的表達豐度幾乎沒有差異。而PEG6000脅迫處理后，在K15中3種基因的表達豐度迅速上調(diào)，并在12 h左右達到最高點 ，此時K15中NCED3表達量上調(diào)75倍左右、ABAR表達量上調(diào)45倍左右、CBF3表達量上調(diào)35倍左右，在WT中3種基因的表達豐度上調(diào)幅度甚小。PEG6000脅迫處理超過12 h ，在兩種材料中3種基因的表達量均迅速下降(圖6)。

鹽脅迫處理

150 mM NaCl處理后，K15與WT幼苗表現(xiàn)出與15% PEG6000處理類似的基因表達差異 (圖7)。鹽脅迫處理12 h ，K15植株中NCED3表達量上調(diào)20倍左右、ABAR表達量上調(diào)25倍左右、CBF3表達量上調(diào)30倍左右，且3種誘導表達基因的相對表達豐度均達到峰值，但相對于PEG6000處理后3種基因表達量的最大值明顯偏低。