1.一種多基因疊加共轉(zhuǎn)化提高油菜綜合抗逆性的方法,其特征在于,包括如下步驟:
(1)多基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建,
構(gòu)建pABA-oriT載體,該載體的T-DNA中的克隆基因表達(dá)盒包含依次串聯(lián)的5種抗逆功能基因和3種選擇標(biāo)記基因;
所述5種抗逆功能基因包括:2個(gè)ABA合成相關(guān)基因NCED3、LOS5,1個(gè)ABA信號(hào)途徑相關(guān)基因ABAR,2個(gè)抗凍調(diào)節(jié)基因ICE1、CBF3;
所述3種選擇標(biāo)記基因包括潮霉素抗性基因HYG、GUS和草銨膦抗性基因BAR;
5種抗逆功能基因和3種選擇標(biāo)記基因在pABA-oriT載體T-DNA區(qū)的具體排列順序?yàn)椋篖B-HYG–GUS-BAR-ICE1-LOS5-CBF3-ABAR-NCED3-RB;
(2)對(duì)步驟(1)中所構(gòu)建的重組表達(dá)載體的鑒定,確保5種功能基因共存于同一表達(dá)載體中;
(3)對(duì)步驟(2)中鑒定正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,制備轉(zhuǎn)化液;
(4)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化油菜,轉(zhuǎn)化后,繼續(xù)培育至成熟,按單株收獲種子;
(5)轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定,將步驟(4)中所收獲油菜種子播種,依次進(jìn)行Basta抗性、潮霉素抗性篩選,并對(duì)雙抗性植株進(jìn)行PCR鑒定;
(6)轉(zhuǎn)化體自交獲得純合體,對(duì)步驟(5)中篩選、鑒定正確的轉(zhuǎn)化體繼續(xù)培養(yǎng),于花期時(shí)套袋,使其自交,收獲單株種子;
對(duì)收獲的種子繼續(xù)種植,同步驟(5)操作,繼續(xù)進(jìn)行Basta抗性、潮霉素抗性、PCR鑒定,并對(duì)鑒定正確的轉(zhuǎn)化體繼續(xù)自交,并最終獲得轉(zhuǎn)化純合體,即為具有綜合抗逆特性的轉(zhuǎn)基因油菜。
2.如權(quán)利要求1所述多基因疊加共轉(zhuǎn)化提高油菜綜合抗逆性的方法,其特征在于,步驟(2)中,重組表達(dá)載體鑒定時(shí),采用PCR鑒定法,PCR鑒定時(shí),引物序列設(shè)計(jì)如下:
NCED –F:5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3',
NCED-R:5' TAGTGTTGGATTCTTTGGCTTTGG 3';
ABAR-F:5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3',
ABAR-R:5’ ACTTTAATCGCCAATTCCTCGACG 3’;
CBF–F: 5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3',
CBF-R: 5’ TTGAAATGTTCCGAGCCAAATCCT 3’;
LOS5-F:5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’,
LOS5-R:5’ CTATAAGGTCACTGGTGGCCGAAC 3’;
ICE1-F:5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’,
ICE1-R:5’ CTCTTCCCTTTCTCCACCACCACC 3’。
3.如權(quán)利要求1所述多基因疊加共轉(zhuǎn)化提高油菜綜合抗逆性的方法,其特征在于,步驟(4)中,轉(zhuǎn)化油菜時(shí),花序在轉(zhuǎn)化液中每次浸泡90~120秒;轉(zhuǎn)化操作時(shí),隔天轉(zhuǎn)化1次,連續(xù)轉(zhuǎn)化3次。
4.如權(quán)利要求1所述多基因疊加共轉(zhuǎn)化提高油菜綜合抗逆性的方法,其特征在于,步驟(6)中,對(duì)轉(zhuǎn)化體的鑒定需經(jīng)不少于4代的連續(xù)自交鑒定。