本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)和免疫治療領(lǐng)域，特別涉及一種體外高效擴增NK細胞的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自然殺傷細胞由造血干細胞分化發(fā)育而來，屬于人體免疫細胞的一種，是具有細胞溶解作用、能夠分泌免疫調(diào)節(jié)因子的效應(yīng)淋巴細胞，醫(yī)學上稱之為“人體抗腫瘤和抗感染的第一道防線”。與T淋巴細胞和B淋巴細胞不同，NK細胞無須預(yù)先接觸抗原即可殺傷靶細胞(包括細菌、病毒感染的宿主細胞和腫瘤細胞)，且其殺傷效應(yīng)無MHC限制性，這種特性使得NK細胞在抗腫瘤反應(yīng)和免疫監(jiān)視病變細胞、癌變細胞過程中發(fā)揮著巨大的作用。大量臨床實驗數(shù)據(jù)表明，NK細胞治療在骨肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌和乳腺癌等癌癥治療中，起到了非常積極的治療效果。

然而，如何在體外獲得大量高純度高質(zhì)量的NK細胞一直限制著NK細胞免疫治療在臨床上的廣泛應(yīng)用。在健康人的外周血中，NK細胞大約占外周血淋巴細胞的5％-10％。傳統(tǒng)地，通過磁珠去除外周血淋巴細胞中的T淋巴細胞，再用高劑量的細胞因子如高劑量的白介素2或飼養(yǎng)層細胞刺激NK細胞的方法所獲得的NK細胞表現(xiàn)出低擴增倍數(shù)、細胞因子依賴性、細胞衰老等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種能獲得大量高純度高質(zhì)量的NK細胞的方法，即利用人工抗原遞呈細胞（artifical Antigen Presenting Cell, aAPC）和細胞因子聯(lián)合刺激外周血單核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC），獲得大量高純度高質(zhì)量NK細胞的方法。

本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：

一種體外高效擴增NK細胞的方法，所述方法包括如下步驟：

Step1.通過傳統(tǒng)的Ficoll-Paque密度梯度離心法從人的外周血中分離出PBMC；

Step2.將人工抗原遞呈細胞經(jīng)輻照處理后，液氮凍存；

Step3.將PBMC與輻照處理后的人工抗原遞呈細胞按質(zhì)量比為1:2的比例在添加有白介素2的RPMI 1640培養(yǎng)基的T75的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)共培養(yǎng)，每2-3天更換新鮮培養(yǎng)基；

Step4.每隔7天，計算T75的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的總細胞數(shù)目，添加等細胞數(shù)目的輻照處理后的人工抗原遞呈細胞再次刺激，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴增后的NK細胞。

通過采用上述技術(shù)方案，F(xiàn)icoll-Paque密度梯度離心法利用顆粒之間存在沉降系數(shù)差，在一定的離心力下，在對應(yīng)梯度取得純度較高的PBMC；利用輻照后的人工抗原蛋白具有不同于普通抗原蛋白新性能；按比例添加后，人工抗原遞呈細胞與低劑量的白介素2協(xié)同作用，相較于僅使用高劑量的白介素2，能夠進一步刺激PBMC，使NK細胞在體外得到擴增，得到高純度高質(zhì)量的NK細胞，通過該種方法，可進行相對大規(guī)模的NK細胞的制備，使NK細胞的臨床應(yīng)用成為可能，每隔7天對細胞進行人工抗原遞呈細胞再次刺激，使PBMC分化NK細胞的過程能夠得到源源不斷地刺激，使NK細胞具有較大的擴增量，經(jīng)上述方法制得的擴增后的NK細胞，具有高純度、高質(zhì)量的特點，延長了NK細胞的壽命，使擴增后的NK細胞相較于未擴增前具有更好的活性功能。

作為優(yōu)選，所述人工抗原遞呈細胞為K562-mb.IL21＋CD137L細胞株，其包括穩(wěn)定表達細胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體的K562細胞株。

通過采用上述技術(shù)方案，K562-mb.IL21+CD137L細胞株能夠在細胞膜表面穩(wěn)定表達白介素21和CD137配體，同時，細胞膜結(jié)合型的白介素21的穩(wěn)定效果更好，以此作為PBMC擴增的飼養(yǎng)細胞，能夠直接擴增NK細胞，獲得高純度且擴增量大的NK細胞，CD137配體通過與表達在NK細胞、T細胞或其他免疫細胞表面上的公刺激分子CD137結(jié)合，起到促進NK細胞、T細胞或其他免疫細胞的活化的作用。

作為優(yōu)選，所述細胞膜結(jié)合型的白介素21為白介素21與跨膜蛋白或鉸鏈蛋白相連而成的融合蛋白，其結(jié)構(gòu)由GM-CSF signal peptide、白介素21、IgG4和CD4相連而形成。

通過采用上述技術(shù)方案， GM-CSF signal peptide 為出膜信號肽，提供出膜信號給白介素21，引導(dǎo)白介素21出細胞膜；IgG4 Hinge+Fc 段連接白介素21，使白介素21在細胞膜外流動性不會過差，提升白介素21的靈活性；CD4TM為CD4的跨膜段，負責將白介素21固定在細胞膜上，使白介素21不會呈游離態(tài)脫離細胞膜表面，完整的氨基酸序列或具備其功能的氨基酸序列片段的GM-CSF signal peptide、白介素21、IgG4、CD4和CD137配體的氨基酸表達更加穩(wěn)定。

作為優(yōu)選，所述輻照處理的輻照強度為80~150Grays。

通過采用上述技術(shù)方案，處于80~150Grays輻照強度內(nèi)進行輻照的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株具有其突變對NK擴增的效果較好，輻照強度過大，細胞株的突變過多，所擴增制得的NK細胞的純度較低，輻照強度過大，細胞株無法突變，無法起到提升NK細胞擴增的效果。

作為優(yōu)選，所述白介素2的劑量為40~70IU/mL。

通過采用上述技術(shù)方案，白介素2計量過小或過大會導(dǎo)致培養(yǎng)基濃度過低或過高，細胞擴增和分化過程對培養(yǎng)基濃度要求十分苛刻，濃度過高會導(dǎo)致細胞失水，濃度過低細胞膜則容易漲破，均不利于細胞的擴增和分化。

作為優(yōu)選，所述細胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體通過T2A連接。

通過采用上述技術(shù)方案，細胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體進通過T2A連接，當mb.IL21+CD137L細胞株的基因在細胞內(nèi)翻譯時會在T2A區(qū)域斷裂成2個獨立的片段。

作為優(yōu)選，所述K562-mb.IL21＋CD137L細胞株的細胞系內(nèi)整合有慢病毒載體，所述慢病毒載體上裝載有可轉(zhuǎn)錄成上述氨基酸序列的基因序列。

通過采用上述技術(shù)方案，慢病毒表達載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，可提供所有的轉(zhuǎn)錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白，為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應(yīng)分子。

作為優(yōu)選，所述細胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體都表達在K562細胞株的細胞系的細胞膜上。

通過采用上述技術(shù)方案，細胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體在K562細胞株的細胞膜上表達，提高了NK細胞的擴增效率，使擴增后的NK細胞具有高純度的特點。

作為優(yōu)選，所述擴增后的NK細胞的平均擴增的倍數(shù)為10⁵~10⁷，NK細胞的端粒長度要比擴增之前的NK細胞的端粒長度長8~15倍。

通過采用上述技術(shù)方案，經(jīng)擴增后的NK細胞的端粒長度較擴增之前加長，通過端粒長度可以推斷NK細胞的活力與壽命，擴增后的NK細胞具有較之擴增前更長的壽命和更好的活力，其抗癌、抗衰老的效果也能得到提升。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種體外高效擴增NK細胞的方法的應(yīng)用，擴增后的NK細胞在抗衰老、抗病毒、抗癌方面的效果都十分好。

本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：

一種體外高效擴增NK細胞的方法的應(yīng)用，所述擴增后的NK細胞在抗衰老中應(yīng)用具體表現(xiàn)為清除體內(nèi)衰老細胞、病變細胞的一種或多種；所述擴增后的NK細胞在抗衰老中應(yīng)用在抗病毒中的應(yīng)用具體表現(xiàn)為治療皰疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、巨細胞病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒的一種或多種；所述擴增后的NK細胞在抗腫瘤中的應(yīng)用具體表現(xiàn)為治療慢性髓系淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宮肌瘤、前列腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、骨肉瘤中的一種或多種。

通過采用上述技術(shù)方案，擴增后的NK細胞在抗衰老、抗病毒、抗癌方面有著多種用處，且其殺傷效應(yīng)無MHC限制性，這種特性使得NK細胞在抗腫瘤反應(yīng)和免疫監(jiān)視病變細胞、癌變細胞過程中發(fā)揮著巨大的作用。

綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：

1、該種NK細胞的擴增方法以輻照mb.IL21+CD137L細胞株作為飼養(yǎng)細胞，添加低劑量白介素2的RPMI 1640作為培養(yǎng)基，以此擴增NK細胞，相較于現(xiàn)有技術(shù)，NK細胞擴增后的純度和細胞量都有著較大的提升；

2、經(jīng)過輻照后的mb.IL21+CD137L細胞株還具有增強NK細胞端粒的效果，使擴增后的NK細胞回復(fù)活性，并增長了NK細胞的壽命，減緩了NK細胞的衰老過程；

3、該種擴增后的NK細胞除了對腫瘤細胞以及病毒細胞有著突出的清除率之外，在抗衰老方面同樣有著極佳的效果。

附圖說明

圖1是全基因合成的mb.IL21＋CD137L的基因序列示意圖；

圖2是mb.IL21+CD137L細胞株在K562細胞上表達的流式細胞圖；

圖3是擴增前后NK細胞純度的流式細胞圖，主要示出了擴增21天后，擴增細胞中CD3和CD56的表達；

圖4是NK細胞擴增倍數(shù)圖，主要示出了NK細胞在K562-mb.IL21+CD137L細胞株和低劑量白介素2共同刺激下細胞數(shù)目的變化；

圖5是擴增后NK細胞表面受體流式細胞圖；

圖6是NK細胞殺死腫瘤細胞系的殺傷圖；

圖7是擴增后NK細胞端粒長度的變化。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。

密度梯度離心法分離PBMC

Step1.抽取40歲中年志愿者的外周血5mL置于無菌離心管中，加入0.5mL的檸檬酸鈉混勻；

Step2.加入5mL1640細胞培養(yǎng)液再次混勻，稀釋；

Step3.取5mL淋巴細胞分離液置于離心管中，用滴管將Step1中稀釋的血液沿管壁緩慢加入分離液上，并使血液與分離液保持兩相分離；

Step4.將離心管1800rpm/min離心25min；

Step5.用毛細吸管沿管壁插入單個核細胞層，洗出單個核細胞置于另一無菌離心管內(nèi)；

Step6.加入5倍體積的1640細胞培養(yǎng)液，1500rpm/min，離心10分鐘，取沉淀；

Step7.重復(fù)Step6兩次后，用1640細胞培養(yǎng)液重懸細胞，制成細胞懸液備用。

＋CD137L細胞株的構(gòu)建

參見圖1，以K562細胞株作為載體，選取包含GM-CSF signal peptide完整氨基酸序列的GM-CSF signal peptide、包含IgG4完整氨基酸序列的IgG4、包含CD4完整氨基酸序列的CD4與包含白介素21完整氨基酸序列的白介素21（IL-21）相連形成融合蛋白，該融合蛋白為細胞膜結(jié)合型的白介素21。選取包含CD137配體(CD137L)完整氨基酸序列的CD137配體，通過T2A連接細胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體，合成mb.IL21＋CD137L的基因。

GM-CSF signal peptide 為出膜信號肽，引導(dǎo)白介素21出細胞膜； IgG4 Hinge+Fc 段連接白介素21，使其在細胞膜外具有一定靈活性；CD4中包含有跨膜段CD4TM，負責將白介素21固定在細胞膜上；T2A連接白介素21和CD137配體，當mb.IL21＋CD137L的基因在細胞內(nèi)翻譯時，T2A會斷裂使mb.IL21＋CD137L形成2個獨立的片段；CD137配體能夠與表達在NK細胞、T細胞或其他免疫細胞表面上的公刺激分子CD137結(jié)合，促進NK細胞、T細胞或其他免疫細胞的活化。

全基因合成mb.IL21＋CD137L的基因之后，將基因裝載到慢病毒載體，包裝慢病毒，感染K562細胞，培養(yǎng)4天后，通過Puro、Neo、GFP等標記基因，流式細胞儀檢測mb.IL21和CD137配體在K562細胞細胞膜表面表達情況，參見圖2，篩選具有穩(wěn)定表達mb.IL21蛋白和CD137配體蛋白的穩(wěn)定細胞株，液氮保存篩選的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株。

細胞的擴增方法

Step1.通過傳統(tǒng)的Ficoll-Paque密度梯度離心法從人的外周血中分離出PBMC；

Step2.將K562-mb.IL21＋CD137L細胞株經(jīng)100Grays輻照處理后，液氮凍存；

Step3. 在T75的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)制備50IU/mL白介素2的RPMI 1640培養(yǎng)基；

Step4.將PBMC與輻照處理后的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株按質(zhì)量比為1:2的比例在添加到T75的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)共培養(yǎng)，每2-3天更換新鮮培養(yǎng)基；

Step5.每隔7天，計算T75的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的總細胞數(shù)目，添加等細胞數(shù)目的輻照處理后的人工抗原遞呈細胞再次刺激，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴增后的NK細胞。

擴增后的NK細胞的純度檢測

參見圖3，在輻照后的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴增后的NK細胞用流式細胞儀對擴增細胞進行檢測，從圖3可知，擴增前的CD3-CD56⁺NK細胞比例僅占2.09%，擴增后，CD3-CD56⁺NK細胞的比例約占97%。

擴增后的NK細胞的數(shù)量檢測

參見圖4，在輻照后的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴增后的NK細胞用以自動細胞計數(shù)儀進行檢測，從圖4可知，CD3^-CD56⁺NK細胞平均擴增的倍數(shù)為15000倍。

擴增后的NK細胞的表型檢測

參見圖5，在輻照后的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴增后的NK細胞用流式細胞儀對NK細胞表面受體中激活型受體和抑制性受體的表達情況進行檢測，從圖5可知，幾乎所有的擴增后的NK細胞都表達激活型受體，包括有NKG2D, DNAM-1, NKp46 和 NKp30。

擴增后的NK細胞對腫瘤細胞的裂解作用

參見圖6，在輻照后的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴增后的NK細胞通過鈣黃綠素釋放試驗檢測NK細胞殺死K562(人慢性髓系白血病細胞系)，A549(人非小細胞肺癌細胞系)，MCF-7（人乳腺癌細胞系），HCT116（人結(jié)直腸癌細胞系）能力，由圖可知，擴增后的NK細胞在效：靶比為10:1時，對K562、A549的細胞溶解率均達到了85%以上，對MCF-7、HCT116的細胞溶解率也達到了70%以上，由此可知，擴增后的NK細胞對上述腫瘤細胞有較強的清除效果。

擴增后的NK細胞端粒長度檢測

參見圖7，在輻照后的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴增后的NK細胞檢測NK細胞端粒長度的變化，檢測如圖7中的實驗組所示，結(jié)果表明本發(fā)明擴增后的NK細胞的端粒長度要比擴增之前的NK細胞的端粒長度長10倍；

按照現(xiàn)有技術(shù)，將只使用200IU/ml白介素2的培養(yǎng)基作為對照組，在不添加輻照后的K562-mb.IL21＋CD137L細胞株的情況下，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴增的NK細胞端粒長度如圖7中對照組所示，要比擴增之前的NK細胞的端粒長度短15倍。

通過上述擴增方法得到的擴增后的NK細胞，具有高純度的特點，CD3-CD56⁺NK細胞的比例可以達到97%以上，且具有擴增效率高，21天左右的擴增的CD3^-CD56⁺NK細胞平均擴增的倍數(shù)能夠達到15000倍以上，且擴增后的NK細胞的端粒長度比擴增之前的NK細胞的端粒長度長10倍，從端粒長度可以推斷，擴增后的NK細胞具有較之擴增前活性更強，對衰老細胞、病毒細胞、腫瘤細胞有著較佳的清除率。

本具體實施例僅僅是對本發(fā)明的解釋，其并不是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對本實施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護。