1.一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:
Step1.通過(guò)傳統(tǒng)的Ficoll-Paque密度梯度離心法從人的外周血中分離出PBMC;
Step2.將人工抗原遞呈細(xì)胞經(jīng)輻照處理后,液氮凍存;
Step3.將PBMC與輻照處理后的人工抗原遞呈細(xì)胞按質(zhì)量比為1:2的比例在添加有白介素2的RPMI 1640培養(yǎng)基的T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)共培養(yǎng),每2-3天更換新鮮培養(yǎng)基;
Step4.每隔7天,計(jì)算T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的總細(xì)胞數(shù)目,添加等細(xì)胞數(shù)目的輻照處理后的人工抗原遞呈細(xì)胞再次刺激,連續(xù)培養(yǎng)21天,得到擴(kuò)增后的NK細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法,其特征在于,所述人工抗原遞呈細(xì)胞為K562-mb.IL21+CD137L細(xì)胞株,其包括穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體的K562細(xì)胞株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法,其特征在于,所述細(xì)胞膜結(jié)合型的白介素21為白介素21與跨膜蛋白或鉸鏈蛋白相連而成的融合蛋白,其結(jié)構(gòu)由GM-CSF signal peptide、白介素21、IgG4和CD4相連而形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法,其特征在于,所述輻照處理的輻照強(qiáng)度為80~150Grays。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法,其特征在于,所述白介素2的劑量為40~70IU/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法,其特征在于,所述細(xì)胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體通過(guò)T2A連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所述的一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法,其特征在于,所述K562-mb.IL21+CD137L細(xì)胞株的細(xì)胞系內(nèi)整合有慢病毒載體,所述慢病毒載體上裝載有可轉(zhuǎn)錄成上述氨基酸序列的基因序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法,其特征在于,所述細(xì)胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體都表達(dá)在K562細(xì)胞株的細(xì)胞系的細(xì)胞膜上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的平均擴(kuò)增的倍數(shù)為105~107倍,NK細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度要比擴(kuò)增之前的NK細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度長(zhǎng)8~15倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法的應(yīng)用,其特征在于,所述擴(kuò)增后的NK細(xì)胞在抗衰老中應(yīng)用具體表現(xiàn)為清除體內(nèi)衰老細(xì)胞、病變細(xì)胞的一種或多種;
所述擴(kuò)增后的NK細(xì)胞在抗病毒中的應(yīng)用具體表現(xiàn)為治療皰疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、巨細(xì)胞病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒的一種或多種;
所述擴(kuò)增后的NK細(xì)胞在抗腫瘤中的應(yīng)用具體表現(xiàn)為治療慢性髓系淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宮肌瘤、前列腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、骨肉瘤中的一種或多種。