本發(fā)明屬于木種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用ITS序列識別黃檀屬和紫檀屬木種的方法。

背景技術(shù)：

紅木作為較為珍貴的一類木材，因具有優(yōu)良的耐腐性、穩(wěn)定性和視覺特性而被人們所青睞，而隨著優(yōu)質(zhì)的紅木資源不斷減少，價格上的巨大差異，市場上以假亂真、以次充好的現(xiàn)象較為普遍，因而對木種進行快速準確的鑒定顯得尤為重要。傳統(tǒng)的木材識別主要結(jié)合木材的宏觀構(gòu)造和微觀構(gòu)造進行，前者主要用于生產(chǎn)現(xiàn)場，但不夠準確，一般只能鑒定到大類；后者則比較準確，但需要涉及的專業(yè)知識較多，對設(shè)備和技術(shù)力量的要求較高，且流程需要經(jīng)過制片，較為復(fù)雜麻煩。

DNA條形碼(DNA Barcode)的概念最早于2003年提出(Hebert PD et al.,2003)，原理是使用一段標準的DNA片段，類似于使用條形碼掃描來不同的商品的原理對物種進行快速、準確的鑒定。目前條形碼的研究與應(yīng)用已經(jīng)迅速發(fā)展成為一項全新物種鑒定技術(shù)，為解決傳統(tǒng)分類學(xué)實際工作中遇到的難題提供了新渠道。2009年在墨西哥城召開了第三屆國際DNA條形碼大會中決定將葉綠體基因片段的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit，rbcL)、成熟酶K蛋白(maturase K，matK)、trnH和psbA間隔區(qū)序列(trnH-psbA Intergenic Spacer Region，trnH-psbA)和核基因片段核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacers，ITS)作為植物DNA條形碼的候選序列。

DNA條形碼已經(jīng)廣泛應(yīng)用到生物多樣性的鑒定檢測中，如出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T 2051-2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法實時PCR法》中檢測的靶標基因就是動物DNA條形碼基因片段COI基因。但和動物條形碼不同的是，因為進化速率的不同，目前對植物條形碼還沒有一個確切的靶標基因或靶標基因的組合，特別是對于某些特殊的物種或種屬的鑒定上。

近年來隨著分子生物學(xué)和DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展，一些研究者開始嘗試利用這一檢測手段鑒定木種樹種。伏建國等(2013)成功在黃檀屬樹種中克隆得到一些成熟蛋白的基因(maturase K，matK)，并作為植物DNA條形碼，成功鑒別黃檀屬中各個木種。

ITS片段是編碼核糖體RNA基因重復(fù)區(qū)內(nèi)的中度保守序列，可分為ITS1和ITS2兩部分。ITS序列既具有核苷酸序列的高度變異性又有長度保守性，因此提供了豐富的遺傳信息，易區(qū)分近緣類群。陳士林對涵蓋接近200個科800個屬的超4800種植物的ITS2序列進行大范圍的研究，得出ITS序列在藥用植物及其近緣種的屬和物種鑒定方面具有很大優(yōu)勢。

因此，本發(fā)明擬研究采用ITS序列識別黃檀屬和紫檀屬木種，確定其能否作為DNA條形碼識別植物物種。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種采用ITS序列識別黃檀屬和紫檀屬木種的方法，該方法可以將ITS序列作為DNA條形碼，識別黃檀屬和紫檀屬木種。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種采用ITS序列識別黃檀屬和紫檀屬木種的方法，包括以下步驟：

(1)選取黃檀屬和紫檀屬木種，采用核酸抽提試劑盒抽提，獲得黃檀屬和紫檀屬木種的DNA；

(2)以步驟(1)獲得的DNA為模板，依次加入引物ITS4和ITS5進行PCR擴增，擴增反應(yīng)程序為：94℃變性3min；94℃0.25min，52℃0.5min，72℃0.5min，30個循環(huán)；72℃10min，采用PCR回收試劑盒純化，得到PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物進行測序，獲得ITS序列，其大小為323bp；

(3)將步驟(2)得到的ITS序列，進行拼接和裁剪后比對后發(fā)現(xiàn)變異位點，從變異位點中篩選出能鑒別黃檀屬和紫檀屬的特征位點；

(4)采用NJ算法和MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明，ITS的序列信息能分辨出黃檀屬和紫檀屬的木種。

在上述采用ITS序列識別黃檀屬和紫檀屬木種的方法中：

步驟(1)中所述的黃檀屬和紫檀屬木種包括賽州黃檀Dalbergia cearensis、交趾黃檀Dalbergia cochinchinensis、刀狀黑黃檀Dalbergia cultrata、闊葉黃檀Dalbergia latifolia、東非黑黃檀Dalbergia melanoxylon、降香黃檀Dalbergia odorifera、奧氏黃檀Dalbergia oliveri、亞馬孫黃檀Dalbergia spruceana、安達曼紫檀Pterocarpus dalbergioides、刺猬紫檀Pterocarpus erinaceus、印度紫檀Pterocarpus indicus、大果紫檀Pterocarpus macrocarpus、檀香紫檀Pterocarpus santalinus和染料紫檀Pterocarpus tinctorius。

步驟(2)中PCR擴增時的反應(yīng)體系包括：引物ITS4 2μL、引物ITS5 2μL、濃度為10mM的dNTP 5μL、10×buffer 5μL、ddH₂O 35μL，濃度為5U/μL的Ex Taq DNA聚合酶0.25μL。

步驟(3)中采用MUSCLE進行拼接，采用Bioedit v.7.0.9進行裁剪。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明以蝶形花科黃檀屬和紫檀屬的樹種為材料，進行植物條形碼ITS測序，PCR結(jié)果顯示ITS的擴增成功率達到100％，同源性分析結(jié)果表明各物種中的ITS序列變異顯著，共找到32個可以用來區(qū)分物種的變異位點，系統(tǒng)進化樹的結(jié)果表明利用ITS序列進行物種水平鑒定成功率達100％，能夠作為DNA條形碼識別植物物種。

附圖說明

圖1是實施例1中木材樣品ITS序列的PCR電泳圖譜；

圖2是實施例1中木材樣品ITS的序列的變異位點；

圖3是實施例1中基于ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(NJ樹)。

具體實施方式

本實施例提供的采用ITS序列識別黃檀屬和紫檀屬木種的方法，包括以下步驟：

1.1材料廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院木種博物館收藏的蝶形花科黃檀屬和紫檀屬的木種，共14個木種14個樹種(賽州黃檀、交趾黃檀、刀狀黑黃檀、闊葉黃檀、東非黑黃檀、降香黃檀、奧氏黃檀、亞馬孫黃檀、安達曼紫檀、刺猬紫檀、印度紫檀、大果紫檀、檀香紫檀和染料紫檀)。

1.2總DNA的提取木塊研磨成粉狀，取適量的樣品(約0.1g)，參照核酸抽提試劑盒(Solar，USA)使用說明進行操作。

1.3引物設(shè)計使用通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')。

1.4 DNA擴增取1μL1.1中制備的總DNA模板(100ng)，依次加入引物ITS4 2μL、3’引物ITS5 2μL、dNTP(10mM)5μL、10×buffer 5μL、ddH2O 35μL，最后加入Ex Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，按如下程序進行PCR反應(yīng)：94℃變性3min；94℃0.25min，52℃0.5min，72℃0.5min，30個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物采用PCR回收試劑盒(Solar，USA)純化。

從ITS序列的PCR電泳圖譜(圖1)可以看出，各樣品的ITS序列的PCR擴增結(jié)果都比較理想，可看到清晰規(guī)則的目的條帶，無雜帶和拖尾現(xiàn)象。

1.5測序純化產(chǎn)物由深圳華大基因公司測序，采用雙向測序；經(jīng)測序，得到約323bp長度的序列。

1.6序列分析利用MUSCLE對序列進行拼接，用Bioedit v.7.0.9對序列進行裁剪，利用MEGA6.0進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，采用Neighbour-joining(NJ)法，bootstrap重復(fù)1000次。

將得到的序列利用MUSCLE進行拼接，用Bioedit v.7.0.9進行裁剪后比對。比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)了94個變異位點，而可用于鑒別物種的特征位點則有32個(序列見圖2)。如117bp：C、145bp：G、176bp：C、216bp：C、246bp：G、247bp：T、270bp：G、292bp：A和307bp：A可用于區(qū)分黃檀屬和紫檀屬的物種；而136bp：C、224bp：G、248bp：C和253bp：G則可能可以用于鑒別名貴木材—降香黃檀。

使用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)，算法為Neighbour-joining(NJ)法，bootstrap重復(fù)1000次。由圖3可以看出，系統(tǒng)進化樹能把黃檀屬和紫檀屬顯著地區(qū)分開，且同一屬內(nèi)也能較好地區(qū)分，表明ITS的確可以作為植物條形碼應(yīng)用到蝶形花科樹種的鑒定。在黃檀屬中，闊葉黃檀和東非黑黃檀較為近緣，交趾黃檀與奧氏黃檀較為親緣，降香黃檀與賽州黃檀較為親緣；在紫檀屬中，刺猬紫檀與紫檀屬物種相對遠緣，而名貴的檀香紫檀與安達曼紫檀、印度紫檀和大果紫檀較為近緣。

本發(fā)明以蝶形花科黃檀屬和紫檀屬的14種木種為材料，擴增得到了其相應(yīng)的ITS序列，系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，ITS的序列信息能較好分辨出黃檀屬和紫檀屬的木種，也能很好分辨出屬內(nèi)各個樹種。

上面列舉一部分具體實施例對本發(fā)明進行說明，有必要在此指出的是以上具體實施例只用于對本發(fā)明作進一步說明，不代表對本發(fā)明保護范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護范圍。