本發(fā)明涉及微生態(tài)發(fā)酵領域，具體地，涉及一種復合乳酸菌的聯(lián)合發(fā)酵工藝。

背景技術：

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細菌的通稱。是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌。種類非常豐富，常見的有雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌、糞腸球菌、屎腸球菌等。乳酸菌對人體有極佳的保健作用大量研究表明，乳酸菌能夠調(diào)節(jié)機體胃腸道正常菌群、保持微生態(tài)平衡，提高食物消化率和生物價，降低血清膽固醇，控制內(nèi)毒素，抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長繁殖和腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生，制造營養(yǎng)物質(zhì)，刺激組織發(fā)育，從而對機體的營養(yǎng)狀態(tài)、生理功能、細胞感染、藥物效應、毒性反應、免疫反應、腫瘤發(fā)生、衰老過程和突然的應急反應等產(chǎn)生作用。

但是普通的乳酸菌，活力極弱，它們只能在相對受限制的環(huán)境中存活，現(xiàn)有的乳酸菌制品中，乳酸菌菌活數(shù)通常不高，且保存條件苛刻，穩(wěn)定性差，因此研制出高菌活數(shù)、穩(wěn)定性好的乳酸菌發(fā)酵工藝十分必要。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種復合乳酸菌的聯(lián)合發(fā)酵工藝，以解決上述問題。

具體地，本發(fā)明采取如下技術方案：

一種復合乳酸菌的聯(lián)合發(fā)酵工藝，包括以下步驟：

制備種子液 采用種子培養(yǎng)基分別對嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌、屎腸球菌、糞腸球菌四種乳酸菌分別進行單獨培養(yǎng)10～25 h，制得嗜酸乳桿菌種子液、乳酸片球菌種子液、屎腸球菌種子液和糞腸球菌種子液；

聯(lián)合發(fā)酵 分別取質(zhì)量分數(shù)為1%～2%的所述嗜酸乳桿菌種子液、所述乳酸片球菌種子液、所述屎腸球菌種子液和所述糞腸球菌種子液轉(zhuǎn)至發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在溫度為37±2℃、pH值為6±0.5、攪拌速度為80～200 r/min的條件下，進行聯(lián)合發(fā)酵12 h～24 h，得到復合乳酸菌發(fā)酵物；

其中，所述種子培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖5～20 g/L、酵母膏5～20 g/L、蛋白胨1～15 g/L、檸檬酸氫二銨1～10 g/L、磷酸氫二鉀1～2.5 g/L、硫酸鎂0.01～0.34 g/L、硫酸錳0.01～0.1 g/L、乙酸鈉1～9 g/L、吐溫-80 0.5～2 ml/L，溶劑為無菌水；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖30～50g/L、酵母膏1～45 g/L、蛋白胨5～35 g/L、檸檬酸氫二銨0.3～2.5g/L、磷酸氫二鉀1～8g/L、硫酸鎂0.1～2 g/L、硫酸錳0.05～1.5 g/L、乙酸鈉0.1～6 g/L、吐溫-80 0.5～5 ml/L，溶劑為無菌水。

基于上述，所述種子培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖10～15 g/L、酵母膏10～15 g/L、蛋白胨5～10 g/L、檸檬酸氫二銨3～7 g/L、磷酸氫二鉀1.5～2.0 g/L、硫酸鎂0.22～0.30 g/L、硫酸錳0.44～0.62 g/L、乙酸鈉3～7 g/L、吐溫-80 1.0～1.5 ml/L，溶劑為無菌水；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖35～45 g/L、酵母膏15～25 g/L、蛋白胨15～25 g/L、檸檬酸氫二銨1.0～2.0g/L、磷酸氫二鉀3～6 g/L、硫酸鎂1.0～1.5 g/L、硫酸錳0.75～1.35 g/L、乙酸鈉2.1～4.2 g/L、吐溫-80 1.0～3.0 ml/L，溶劑為無菌水。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的復合乳酸菌的聯(lián)合發(fā)酵工藝，采用兩步法配合上述種子培養(yǎng)基和上述發(fā)酵培養(yǎng)基，同時對嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌、屎腸球菌、糞腸球菌四種乳酸菌進行聯(lián)合發(fā)酵，這四種乳酸菌協(xié)同作用、相互促進，極大的提高制得的復合乳酸菌中的菌活數(shù)和穩(wěn)定性；而且該復合乳酸菌的聯(lián)合發(fā)酵工藝工藝簡單，操作方便具有廣闊的應用前景。

具體實施方式

下面通過具體實施方式，對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳細描述。

實施例1

一種復合乳酸菌的聯(lián)合發(fā)酵工藝，包括以下步驟：

制備種子液 采用種子培養(yǎng)基分別對嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌、屎腸球菌、糞腸球菌四種乳酸菌分別進行單獨培養(yǎng)10～25 h，制得嗜酸乳桿菌種子液、乳酸片球菌種子液、屎腸球菌種子液和糞腸球菌種子液；

聯(lián)合發(fā)酵 分別取質(zhì)量分數(shù)為1%的所述嗜酸乳桿菌種子液、所述乳酸片球菌種子液、所述屎腸球菌種子液和所述糞腸球菌種子液轉(zhuǎn)至發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在溫度為37±2℃、pH值為6±0.5、攪拌速度為80～200 r/min的條件下，進行聯(lián)合發(fā)酵，得到復合乳酸菌發(fā)酵物；

其中，所述種子培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖10 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨7 g/L、檸檬酸氫二銨5 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、硫酸鎂0.22 g/L、硫酸錳0.52 g/L、乙酸鈉4.5 g/L、吐溫-80 1.2 ml/L，溶劑為無菌水；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖40 g/L、酵母膏22 g/L、蛋白胨18 g/L、檸檬酸氫二銨1.4 g/L、磷酸氫二鉀4 g/L、硫酸鎂1.2 g/L、硫酸錳0.58 g/L、乙酸鈉3.2 g/L、吐溫-80 2.6 ml/L，溶劑為無菌水。

對比實驗

對照組：在溫度為37±2℃、pH為6±0.5、攪拌速度為80～200 r/min條件下，利用傳統(tǒng)的乳酸菌培養(yǎng)基即MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)嗜酸乳桿菌，得到嗜酸乳桿菌發(fā)酵物。

取等量的實施例1提供的復合乳酸菌發(fā)酵物和所述嗜酸乳桿菌發(fā)酵物繼續(xù)在溫度為37±2℃、pH為6±0.5、攪拌速度為80～200 r/min條件下進行發(fā)酵，分別測定其菌活數(shù)隨發(fā)酵時間變化，測試結(jié)果如表1所示；取等量的實施例1提供的發(fā)酵24 h的復合乳酸菌發(fā)酵物和發(fā)酵24 h的所述嗜酸乳桿菌發(fā)酵物常溫保存，分別測定其菌活數(shù)隨時間變化，測試結(jié)果如表2所示。

表1 菌活數(shù)隨發(fā)酵時間變化

表2 常溫下菌活數(shù)隨時間變化

注：表2中的“——”表示發(fā)酵液活菌數(shù)極少無測定意義

由表1可知，實驗組和對照組中菌活數(shù)隨著發(fā)酵時間增長，先增多，然后降低，在24 h時，達到最大；而且實驗組中的菌活數(shù)遠大于對照組；由表2可知，常溫保存，對照組中菌活數(shù)迅速降低，而實驗組中菌活數(shù)仍保持一定的數(shù)值。

實施例2

本實施例提供一種復合乳酸菌的聯(lián)合發(fā)酵工藝，其與實施例1的不同之處在于：

所述種子培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖5 g/L、酵母膏20 g/L、蛋白胨15 g/L、檸檬酸氫二銨10 g/L、磷酸氫二鉀2.5 g/L、硫酸鎂0.01 g/L、硫酸錳0.01 g/L、乙酸鈉9 g/L、吐溫-80 2 ml/L，溶劑為無菌水；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖30 g/L、酵母膏1 g/L、蛋白胨35 g/L、檸檬酸氫二銨0.3 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、硫酸鎂2 g/L、硫酸錳1.5 g/L、乙酸鈉0.1 g/L、吐溫-80 5 ml/L，溶劑為無菌水；

在所述聯(lián)合發(fā)酵的步驟中，分別取質(zhì)量分數(shù)為2%的所述嗜酸乳桿菌種子液、所述乳酸片球菌種子液、所述屎腸球菌種子液和所述糞腸球菌種子液轉(zhuǎn)至發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在溫度為37±2℃、pH值為6±0.5、攪拌速度為80～200 r/min的條件下，進行聯(lián)合發(fā)酵12 h，得到復合乳酸菌發(fā)酵物；

所述復合乳酸菌發(fā)酵物進行常溫保存，30 d后，菌活數(shù)為1.42×10⁸；60 d后，菌活數(shù)為9.13×10⁶；90 d后，菌活數(shù)為5.04×10⁵。

實施例3

本實施例提供一種復合乳酸菌的聯(lián)合發(fā)酵工藝，其與實施例1的不同之處在于：

所述種子培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖20 g/L、酵母膏5 g/L、蛋白胨1 g/L、檸檬酸氫二銨11 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、硫酸鎂0.1 g/L、硫酸錳1 g/L、乙酸鈉1 g/L、吐溫-80 0.5 ml/L，溶劑為無菌水；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖50 g/L、酵母膏45 g/L、蛋白胨5 g/L、檸檬酸氫二銨2.5 g/L、磷酸氫二鉀8 g/L、硫酸鎂0.1 g/L、硫酸錳0.05 g/L、乙酸鈉6 g/L、吐溫-8 0.5 ml/L，溶劑為無菌水；

在所述聯(lián)合發(fā)酵的步驟中，分別取質(zhì)量分數(shù)為1%的所述嗜酸乳桿菌種子液、所述乳酸片球菌種子液、所述屎腸球菌種子液和所述糞腸球菌種子液轉(zhuǎn)至發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在溫度為37±2℃、pH值為6±0.5、攪拌速度為80～200 r/min的條件下，進行聯(lián)合發(fā)酵24 h，得到復合乳酸菌發(fā)酵物；

所述復合乳酸菌發(fā)酵物進行常溫保存，30 d后，菌活數(shù)為1.52×10⁸；60 d后，菌活數(shù)為9.01×10⁶；90 d后，菌活數(shù)為4.96×10⁵。

實施例4

本實施例提供一種復合乳酸菌的聯(lián)合發(fā)酵工藝，其與實施例1的不同之處在于：所述種子培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖13 g/L、酵母膏11 g/L、蛋白胨5 g/L、檸檬酸氫二銨7 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、硫酸鎂0.22 g/L、硫酸錳0.62 g/L、乙酸鈉3 g/L、吐溫-80 1.0 ml/L，溶劑為無菌水；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖35 g/L、酵母膏15 g/L、蛋白胨25 g/L、檸檬酸氫二銨1.0 g/L、磷酸氫二鉀3 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、硫酸錳0.75 g/L、乙酸鈉4.2 g/L、吐溫-8 1.2 ml/L，溶劑為無菌水；

在所述聯(lián)合發(fā)酵的步驟中，分別取質(zhì)量分數(shù)為2%的所述嗜酸乳桿菌種子液、所述乳酸片球菌種子液、所述屎腸球菌種子液和所述糞腸球菌種子液轉(zhuǎn)至發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在溫度為37±2℃、pH值為6±0.5、攪拌速度為80～200 r/min的條件下，進行聯(lián)合發(fā)酵12 h，得到復合乳酸菌發(fā)酵物；

所述復合乳酸菌發(fā)酵物進行常溫保存，30 d后，菌活數(shù)為1.55×10⁸；60 d后，菌活數(shù)為9.17×10⁶；90 d后，菌活數(shù)為5.12×10⁵。

因此，本發(fā)明實施例提供的上述復合乳酸菌的聯(lián)合發(fā)酵工藝可以有效提高制得復合乳酸菌中的菌活數(shù)，而且菌活數(shù)穩(wěn)定性良好，具有廣闊的應用前景。

最后應當說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對其限制；盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，所屬領域的普通技術人員應當理解：依然可以對本發(fā)明的具體實施方式進行修改或者對部分技術特征進行等同替換；而不脫離本發(fā)明技術方案的精神，其均應涵蓋在本發(fā)明請求保護的技術方案范圍當中。