(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種凝乳酶的制備，特別涉及一種利用裂殖壺菌生產(chǎn)凝乳酶的方法。

(二)

背景技術(shù)：

裂殖壺菌(aurantiochytriumsp.)是一種海洋類(lèi)真菌的異養(yǎng)型微生物，其細(xì)胞中富含dha等重要多不飽和脂肪酸，已成為世界上最常用的dha高產(chǎn)菌株。裂殖壺菌分布于海洋生境，能夠利用自身的多酶體系高效分解環(huán)境基質(zhì)，滿足自身快速生長(zhǎng)的需求，其數(shù)量級(jí)甚至超過(guò)細(xì)菌，而且作為分解者參與海洋環(huán)境物質(zhì)循環(huán)，具有重要的生態(tài)學(xué)意義。

凝乳酶是奶酪生產(chǎn)中使牛奶凝固的關(guān)鍵酶，屬于酸性蛋白酶，又稱(chēng)天冬氨酸蛋白酶，其產(chǎn)值占整個(gè)酶制劑總產(chǎn)值的15.5％，市場(chǎng)需求量巨大。凝乳酶的傳統(tǒng)來(lái)源是哺乳期小牛的皺胃，因其具有較高的凝乳和蛋白水解能力而成為奶酪制作的首選酶。然而動(dòng)物來(lái)源的酶成本昂貴，且提取程序和工藝較為復(fù)雜，已不能滿足現(xiàn)代工業(yè)對(duì)于凝乳酶的要求。所以，研究者不斷尋求新的凝乳酶資源。微生物具有生長(zhǎng)速度快、生產(chǎn)成本低、占地面積小和易于控制生產(chǎn)條件等優(yōu)點(diǎn)，而且微生物凝乳酶多屬胞外酶，提取方便，使其具有較好的發(fā)展前景。目前微生物凝乳酶主要由米黑毛霉、微小毛霉和粟疫霉等霉菌通過(guò)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)，霉菌容易產(chǎn)生菌絲體，影響產(chǎn)酶；另外與固態(tài)發(fā)酵相比，液態(tài)發(fā)酵技術(shù)具有發(fā)酵時(shí)間短、過(guò)程易于控制和產(chǎn)量高等優(yōu)勢(shì)。而關(guān)于裂殖壺菌來(lái)源的凝乳酶及其液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的研究并未見(jiàn)報(bào)道。裂殖壺菌已通過(guò)fda安全認(rèn)證，中國(guó)衛(wèi)生部也將其加入安全的食品添加劑名錄，故廣泛應(yīng)用于食品和飼料工業(yè)。該菌能夠利用廉價(jià)基質(zhì)快速生長(zhǎng)，很大程度上降低了其發(fā)酵產(chǎn)品的成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種新菌株--裂殖壺菌(aurantiochytriumsp.)wzyu011及利用裂殖壺菌wzyu011高效生產(chǎn)凝乳酶的方法。本發(fā)明首次使用已通過(guò)食品安全認(rèn)證的海洋微生物裂殖壺菌，采用廉價(jià)原料高效生產(chǎn)凝乳酶，有效降低了凝乳酶的生產(chǎn)成本，且整個(gè)工藝流程簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低，可控性強(qiáng)，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一株新菌株--裂殖壺菌(aurantiochytriumsp.)wzyu011，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)：cctccno:m2016619，保藏日期為：2016年11月7日，保藏地址為中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，郵編430072。

本發(fā)明還提供一種利用裂殖壺菌wzyu011生產(chǎn)凝乳酶的方法，所述方法為：將裂殖壺菌wzyu011接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25-35℃下，50-600rpm振蕩培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心，棄細(xì)胞沉淀，得到含凝乳酶的粗酶液，將粗酶液分離純化，獲得凝乳酶；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖40-120g/l，酵母粉10-20g/l，蛋白胨5-20g/l，海鹽20g/l，溶劑為水，ph值自然。

進(jìn)一步，所述裂殖壺菌wzyu011接種前先進(jìn)行斜面活化和種子擴(kuò)大培養(yǎng)：(1)斜面培養(yǎng)：將裂殖壺菌wzyu011接種于斜面培養(yǎng)基上，25-35℃下培養(yǎng)1-3天；所述斜面培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g/l，酵母粉10g/l，蛋白陳5g/l，海鹽20g/l，瓊脂20g/l，溶劑為水，ph值自然；(2)種子培養(yǎng)：將斜面培養(yǎng)基上的菌體接入含100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在25-35℃下，50-300rpm震蕩培養(yǎng)1-3天，得到種子液；所述種子培養(yǎng)基組為：葡萄糖60g/l，酵母粉10g/l，蛋白陳5g/l，海鹽20g/l，溶劑為水，ph值自然。

進(jìn)一步，所述裂殖壺菌wzyu011發(fā)酵培養(yǎng)方法為：將種子液接入含發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在25-35℃下，轉(zhuǎn)速50-600rpm，通氣量40-100l/min，溶氧量20-60％的條件下，培養(yǎng)時(shí)間1-6天，獲得發(fā)酵液。

進(jìn)一步，所述種子液以體積濃度的1％-10％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基。

進(jìn)一步，所述發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為1-6天。

進(jìn)一步，所述發(fā)酵液在5000rpm，4℃下離心5min，獲得粗酶液。

進(jìn)一步，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖60g/l，酵母粉20g/l，蛋白胨10g/l，海鹽20g/l，溶劑為水，ph值自然。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：

裂殖壺菌較其它凝乳酶生產(chǎn)菌株有很多優(yōu)勢(shì)：(1)生長(zhǎng)速率快，在1-3天的時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到5-20g/l生物量，并生產(chǎn)大量凝乳酶，酶活力可達(dá)50-300u/ml；(2)能夠利用葡萄糖、酵母粉和蛋白胨等傳統(tǒng)廉價(jià)的原料，發(fā)酵培養(yǎng)基中的海鹽組分能夠替代其它菌種發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶所必須的無(wú)機(jī)鹽，大大降低生產(chǎn)成本；(3)生產(chǎn)凝乳酶的方式為胞外分泌，大大簡(jiǎn)化了凝乳酶的提取和分離工藝，適合工業(yè)化生產(chǎn)；(4)安全性高，可以廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。在廉價(jià)培養(yǎng)基中，在1-5天的時(shí)間內(nèi)，裂殖壺菌的凝乳酶產(chǎn)量可達(dá)50-300u/ml。(5)用該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶過(guò)程比傳統(tǒng)的霉菌相比，縮短生產(chǎn)周期，降低發(fā)酵成本，易于控制，使凝乳酶大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用成為可能；該凝乳酶為胞外酶，易于分離、純化和應(yīng)用，且活力較高，適合工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用；裂殖壺菌已通過(guò)各級(jí)安全認(rèn)證，其來(lái)源的凝乳酶可用于食品、醫(yī)藥和飼料等各種領(lǐng)域。

(四)附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1裂殖壺菌wzyu011在牛奶平板上產(chǎn)生的透明圈。

圖2是實(shí)施例2裂殖壺菌wzyu011菌種平板菌落形態(tài)。

圖3是實(shí)施例2裂殖壺菌wzyu011菌種顯微細(xì)胞形態(tài)。

圖4是實(shí)施例6裂殖壺菌wzyu011凝乳酶沉降奶粉溶液的效果；a200μl蒸餾水與5ml100g/l脫脂奶粉水溶液反應(yīng)(對(duì)照)；b為500μl粗酶液與5ml100g/l脫脂奶粉水溶液反應(yīng)；c為200μl粗酶液與5ml100g/l脫脂奶粉水溶液反應(yīng)。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1產(chǎn)凝乳酶裂殖壺菌wzyu011的篩選

(1)菌株wzyu011篩選

在浙江省溫州市樂(lè)清灣海邊采集腐葉樣品，洗凈放于表面懸浮0.1g松花粉的yp培養(yǎng)液(1g/l酵母粉，1g/l蛋白胨，50mg/l氨芐青霉素，50mg/l鏈霉素，水配制，ph6.0)中，30℃黑暗培養(yǎng)1周，取50μl培養(yǎng)物涂布于yp平板(1g/l酵母粉，1g/l蛋白胨，50mg/l氨芐青霉素，50mg/l鏈霉素，瓊脂20g/l，水配制，ph值6.0)上，28℃培養(yǎng)3天，直到長(zhǎng)出單菌落，重復(fù)劃線gyp平板純化培養(yǎng)三次，得到純的菌株。將純的菌落點(diǎn)種于牛奶-gyp平板上，30℃倒置靜止培養(yǎng)3天，觀察透明圈(圖1)，記為菌株wzyu011。

gyp平板培養(yǎng)基組分為(g/l):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白陳5，海鹽20，瓊脂20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min，倒制平板。

牛奶-gyp平板組分為(g/l)：a：4％(w/v)的牛奶；b：4％(w/v)的瓊脂；c：gyp固體培養(yǎng)基(g/l):葡萄糖60，酵母粉10，蛋白陳5，海鹽20，瓊脂20，溶劑為水，ph值自然。將滅菌的a，b兩種培養(yǎng)基組分混合，倒入平板，待培養(yǎng)基凝固后倒入gyp固體培養(yǎng)基，制成牛奶-gyp雙層平板。

(2)菌株wzyu011鑒定

生理生化特征：

將菌株wzyu011接種在gyp平板上，28℃培養(yǎng)2天，菌落呈黃白色，圓形，表面濕潤(rùn)光滑，微微隆起(圖2)；在顯微鏡下細(xì)胞呈圓形或橢圓形，直徑5-20μm，細(xì)胞表面比較明亮，有鱗片狀結(jié)構(gòu)，邊緣清晰，細(xì)胞分裂增殖，有偶數(shù)個(gè)細(xì)胞聚集在一起的現(xiàn)象(圖3)。

菌株wzyu011的18srdna序列見(jiàn)seqidno.1所示。與aurantiochytriumsp.菌株krs101和st-2012等菌株的18srdna序列相似度可達(dá)99％，故將將菌株wzyu011鑒定為裂殖壺菌(aurantiochytriumsp.)，命名為裂殖壺菌(aurantiochytriumsp.)wzyu011，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)：cctccm2016619，保藏日期為：2016年11月7日，保藏地址為中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，郵編430072。

實(shí)施例2裂殖壺菌wzyu011液體發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶

將-80℃保存的裂殖壺菌wzyu011菌株轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，30℃靜止培養(yǎng)2天；將菌體接入含100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30℃，200rpm震蕩培養(yǎng)1天，得到種子液；將種子液按體積濃度4％的接種量轉(zhuǎn)到含3l發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，30℃，轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量80l/min，溶氧量60％條件下培養(yǎng)3天，得到發(fā)酵液，生物量可達(dá)10g/l；將發(fā)酵液5000rpm，4℃下離心5min，棄細(xì)胞沉淀得到粗酶液，經(jīng)測(cè)定凝乳酶活力是100u/ml。

凝乳酶活力測(cè)定方法是：取0.4ml粗酶液與1ml含40mg/l牛血紅蛋白溶液混合(牛血紅蛋白購(gòu)自美國(guó)sigma公司，溶于20mmph為3.4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液)，溫度40℃下保溫1h后迅速加入0.4ml15％(w/v)tca(三氯乙酸)水溶液終止反應(yīng)。tca加入對(duì)照管中的時(shí)間要在加入底物前面。將試管于冰浴中靜置20min，然后10000rpm離心20min，取上清，使用分光光度計(jì)，于280nm處下測(cè)定吸光度。酶活定義是在1h內(nèi)，測(cè)得溶液吸光度在280nm下每增加0.01作為一個(gè)酶活單位u。

斜面培養(yǎng)基組分為(g/l):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白陳5，海鹽20，瓊脂20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min；種子培養(yǎng)基為(g/l):葡萄糖60，酵母粉10，蛋白陳5，海鹽20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min；發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/l):葡萄糖40，酵母粉10，蛋白胨5，海鹽20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min。

實(shí)施例3裂殖壺菌wzyu011液體發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶

將-80℃保存的裂殖壺菌wzyu011菌株轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，25℃靜止培養(yǎng)3天；將菌體接入含100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，25℃，300rpm震蕩培養(yǎng)3天，得到種子液；將種子液按體積濃度10％的接種量轉(zhuǎn)到含3l發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，25℃，轉(zhuǎn)速600rpm，通氣量40l/min，溶氧量40％條件下培養(yǎng)6天，得到發(fā)酵液，生物量可達(dá)19.5g/l；將發(fā)酵液5000rpm，4℃下離心5min，棄細(xì)胞沉淀得到粗酶液，經(jīng)實(shí)施例2方法測(cè)定凝乳酶活力是150u/ml。

斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基組成同實(shí)施例2，發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/l):葡萄糖60，酵母粉15，蛋白胨10，海鹽20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min。

實(shí)施例4裂殖壺菌wzyu011液體發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶

將-80℃保存的裂殖壺菌wzyu011菌株轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，35℃靜止培養(yǎng)1天；將菌體接入含種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，35℃，50rpm震蕩培養(yǎng)1天，得到種子液；將種子液按體積濃度1％的接種量轉(zhuǎn)到含3l發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，35℃，轉(zhuǎn)速50rpm，通氣量100l/min，溶氧量20％條件下培養(yǎng)1天，得到發(fā)酵液，生物量可達(dá)5.1g/l；將發(fā)酵液5000rpm，4℃下離心5min，棄細(xì)胞沉淀得到粗酶液，經(jīng)實(shí)施例2方法測(cè)定凝乳酶活力是50u/ml。

斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基組成同實(shí)施例2，發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/l):葡萄糖120，酵母粉20，蛋白胨20，海鹽20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min。

實(shí)施例5裂殖壺菌wzyu011液體發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶

將-80℃保存的裂殖壺菌wzyu011菌株轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，28℃靜止培養(yǎng)2天；將菌體接入含100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃，200rpm震蕩培養(yǎng)2天，得到種子液；將種子液按體積濃度10％的接種量轉(zhuǎn)到含3l發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，28℃，轉(zhuǎn)速500rpm，通氣量70l/min，溶氧量50％條件下培養(yǎng)5天，得到發(fā)酵液，生物量可達(dá)20.3g/l；將發(fā)酵液5000rpm，4℃下離心5min，棄細(xì)胞沉淀得到粗酶液，經(jīng)實(shí)施例2方法測(cè)定凝乳酶活力是300u/ml。

斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基組成同實(shí)施例2，發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/l):葡萄糖50，酵母粉15，蛋白胨10，海鹽20，溶劑為水，ph值自然，115℃滅菌30min。

實(shí)施例6裂殖壺菌wzyu011來(lái)源凝乳酶在牛奶凝聚中的應(yīng)用

將實(shí)施例5制備的粗酶液200μl和500μl分別與5ml100g/l脫脂奶粉水溶液(脫脂奶粉購(gòu)自中國(guó)完達(dá)山公司，溶于蒸餾水中)混合，充分振蕩混勻，在溫度35℃下保溫，1分鐘后奶粉溶液便開(kāi)始凝聚，觀察拍照(圖4)。

sequencelisting

<110>浙江工業(yè)大學(xué)

<120>裂殖壺菌wzyu011及其生產(chǎn)凝乳酶的方法

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

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