本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株大腸桿菌基因工程菌及利用其生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。

背景技術(shù)：
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啟動(dòng)子為RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。啟動(dòng)子就像“開關(guān)”，決定基因的活動(dòng)，但啟動(dòng)子本身并不控制基因活動(dòng)，而是通過與稱為轉(zhuǎn)錄因子的這種蛋白質(zhì)結(jié)合而控制基因活動(dòng)的。啟動(dòng)子位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的一段DNA序列，能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活化RNA聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。

目前常用的啟動(dòng)子類型有組成型啟動(dòng)子(能夠使基因在所有細(xì)胞中都能啟動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子)和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，該種類型的啟動(dòng)子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平)。組成型啟動(dòng)子不受外界條件的影響，所啟動(dòng)基因的表達(dá)具有持續(xù)性，但不表現(xiàn)時(shí)空特異性；而誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以通過外界的物理化學(xué)信號(hào)人為地調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。

現(xiàn)有技術(shù)中的組成型啟動(dòng)子，表達(dá)強(qiáng)度不具有時(shí)空特異性，不可以人為地調(diào)控；而誘導(dǎo)型啟動(dòng)子需要添加IPTG、乳糖等外源物質(zhì)，其成本較高，誘導(dǎo)劑有時(shí)候?qū)w生長還有一定的副作用；溫度誘導(dǎo)啟動(dòng)子則對(duì)溫度較為敏感，對(duì)設(shè)備溫度控制要求較高，而且溫度的改變有時(shí)候也會(huì)影響細(xì)胞的正常代謝。

大腸桿菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶由ppc基因編碼，催化磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)和CO₂反應(yīng)生成草酰乙酸(Oxaloacetate，OAA)。反應(yīng)方程式如下：PEP+CO₂＝OAA+Pi。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性增強(qiáng)，有助于增加草酰乙酸的積累，從而增加天冬氨酸的積累。天冬氨酸是L-蘇氨酸合成的直接前體物，因此磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是L-蘇氨酸合成的一個(gè)關(guān)鍵酶。另一方面，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)能固定一分子CO₂，增強(qiáng)細(xì)胞磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性，將增強(qiáng)細(xì)胞的CO₂固定反應(yīng)，從而提高細(xì)胞代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的糖酸轉(zhuǎn)化率。反之，磷酸烯醇式丙酮酸將生成丙酮酸，轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A后進(jìn)入TCA循環(huán)。TCA循環(huán)雖然有利于細(xì)胞生成ATP，但同時(shí)生成兩分子的CO₂。因此過多的TCA循環(huán)將導(dǎo)致細(xì)胞較低的糖酸轉(zhuǎn)化率。對(duì)L-蘇氨酸發(fā)酵生產(chǎn)而言，增強(qiáng)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表達(dá)是提高L-蘇氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的有效方法。但是也有研究表明，過強(qiáng)的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶表達(dá)會(huì)影響細(xì)胞的正常代謝和生長，進(jìn)而影響L-蘇氨酸的合成和積累。因此，調(diào)節(jié)細(xì)胞不同時(shí)期的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性，調(diào)整CO₂固定反應(yīng)和TCA循環(huán)的代謝流量對(duì)于L-蘇氨酸發(fā)酵至關(guān)重要。

申請(qǐng)人在研究過程中發(fā)現(xiàn)甜菜堿能夠有效地提高6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因(zwf)的啟動(dòng)子P_zwf的表達(dá)強(qiáng)度，且啟動(dòng)子P_zwf的表達(dá)強(qiáng)度隨著甜菜堿濃度的增加逐步增強(qiáng)。因此本發(fā)明嘗試將大腸桿菌染色體上的P_ppc替換為P_zwf，并采取發(fā)酵過程中流加甜菜堿的方式以調(diào)節(jié)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表達(dá)強(qiáng)度。隨著發(fā)酵時(shí)間的延伸，甜菜堿的濃度逐漸提高，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表達(dá)強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。采用這種調(diào)控方式，在不影響細(xì)胞正常生長的前提下，實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的調(diào)控，達(dá)到提高L-蘇氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一：是一株大腸桿菌基因工程菌，所述基因工程菌是將出發(fā)菌株的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的啟動(dòng)子P_ppc替換為6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因(zwf)的啟動(dòng)子P_zwf，從而達(dá)到能通過甜菜堿調(diào)節(jié)其L-蘇氨酸生產(chǎn)能力的目的；

優(yōu)選地，所述出發(fā)菌株為E coli THRD，編號(hào)CGMCC No.11074，所述菌株已在申請(qǐng)?zhí)枮?01510579005.9的中國發(fā)明專利中公布；

所述基因工程菌的構(gòu)建方法如下：

(1)ppc基因啟動(dòng)子P_ppc上、下游同源臂(ppc-up和ppc-down)、Cm基因和zwf基因啟動(dòng)子P_zwf的擴(kuò)增；

(2)構(gòu)建包含上述片段的連接片段ppc-up-Cm-P_zwf-ppc-down；

(3)將上述連接片段轉(zhuǎn)化入大腸桿菌THRD感受態(tài)細(xì)胞即得所述基因工程菌。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二：是利用上述基因工程菌生產(chǎn)L-蘇氨酸的搖瓶發(fā)酵方法，具體如下：

(1)將上述菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)活化，37℃培養(yǎng)14-16h，轉(zhuǎn)接一次，37℃培養(yǎng)8-10h；

(2)將斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀為6-8；

(3)按照10％的接種量將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)，發(fā)酵過程中，缺糖后開始流加糖，甜菜堿隨葡萄糖進(jìn)行流加，發(fā)酵28-32h結(jié)束；

所述缺糖標(biāo)準(zhǔn)為：培養(yǎng)基超過20min沒有顏色變化，即pH沒有發(fā)生變化，即可確定是缺糖；

所述流加的糖為80％的葡萄糖，含2.5g/L甜菜堿，每次每30mL發(fā)酵體系流加1mL；

所述種子培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)：葡萄糖20-40，酵母粉5-20，蛋白胨2-10，磷酸二氫鉀0.75-2.5，硫酸鎂0.25-1.0，硫酸亞鐵0.005-0.02，硫酸錳0.005-0.02，V_B10.001-0.003，V_H 0.0001-0.0005，苯酚紅15-30，其余為水，pH 7.0-7.2；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)：葡萄糖15-45，酵母粉1-5，蛋白胨1-8，磷酸二氫鉀1-4，檸檬酸鈉0.5-2.5，硫酸鎂0.5-1.5，V_B1 0.0004-0.002，V_H 0.01-0.04，硫酸錳0.05-0.2，硫酸亞鐵0.05-0.2，甜菜堿0.4-0.6，苯酚紅15-30，其余為水，pH 7.0-7.2；

發(fā)酵結(jié)束后，L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到50-55g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率提高至38-42％；

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三：利用上述基因工程菌生產(chǎn)L-蘇氨酸發(fā)酵罐發(fā)酵方法，具體如下：

(1)將上述菌株進(jìn)行斜面活化，37℃培養(yǎng)14-16h，轉(zhuǎn)接一次，37℃培養(yǎng)8-10h；

(2)將斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中，37℃，DO控制在25％-40％，培養(yǎng)至OD₆₀₀為12-16，按照14-18％的接種量將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基；

(3)發(fā)酵過程中利用氨水(25％)調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2，DO控制在30％-40％，待底糖耗盡，流加80％的葡萄糖(含2.5g/L的甜菜堿)，整個(gè)發(fā)酵過程葡萄糖濃度控制在5g/L以下；

種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)：葡萄糖15-45，玉米漿20-50mL/L或干粉8-20，酵母粉1-5，硫酸鎂0.15-0.5，硫酸亞鐵0.005-0.025，硫酸錳0.005-0.025，磷酸二氫鉀1.0-4.0，檸檬酸1.0-5.0，硫酸銨1.0-5.0，其余為水，pH 7.0-7.2；

發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)：葡萄糖10-25，酵母粉1-5，玉米漿10-25mL/L或干粉4.0-10，硫酸鎂0.25-1.0，硫酸亞鐵0.005-0.02，硫酸錳0.005-0.02，磷酸二氫鉀1.0-5.0，甜菜堿0.4-0.6，其余為水，pH 7.0-7.2；

(4)發(fā)酵28-32h結(jié)束發(fā)酵；

發(fā)酵結(jié)束后L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到120-150g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率提高至59-61％。

有益效果：

1、本發(fā)明提供的菌株可以按照發(fā)酵不同階段的需要來調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)強(qiáng)度，從而提高糖酸轉(zhuǎn)化率。發(fā)酵前期需要菌體快速生長，糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)代謝快，提供充足的能量。發(fā)酵后期菌體不需要快速生長，此時(shí)開始添加甜菜堿以增強(qiáng)磷酸戊糖途徑，合成更多的NADPH。L-蘇氨酸合成需要大量的還原力NADPH，磷酸戊糖途徑代謝的增強(qiáng)對(duì)于L-蘇氨酸合成有益。本發(fā)明將甜菜堿促進(jìn)基因表達(dá)的機(jī)制引入到L-蘇氨酸合成的另一個(gè)關(guān)鍵蛋白磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表達(dá)中。通過將ppc基因啟動(dòng)子P_ppc替換為P_zwf，從而使磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表達(dá)隨著甜菜堿的添加逐步提高，從而增強(qiáng)L-蘇氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。在實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中可以采用流加方式進(jìn)行調(diào)控，其可操作性強(qiáng)，使用便利，效果明顯，顯著提高L-蘇氨酸生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

2、采用本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌，在發(fā)酵過程中通過添加甜菜堿，可以使L-蘇氨酸搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到50-55g/L，搖瓶糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到38-42％；發(fā)酵罐產(chǎn)量達(dá)到120-150g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到59-61％。

附圖說明：

圖1：不同濃度甜菜堿對(duì)P_zwf表達(dá)強(qiáng)度的影響；

圖2：不同濃度甜菜堿對(duì)G6PDH酶活的影響；

圖3：不同濃度甜菜堿對(duì)生物量的影響；

圖4：E.coli DH5αpUC19L-P_zwf-gfp菌株構(gòu)建各階段PCR驗(yàn)證圖

其中，M為DNA marker；

A中泳道1為反向PCR擴(kuò)增pUC19-L片段(2252bp)；

B中泳道2為PCR擴(kuò)增P_zwf片段(485bp)；

C中泳道3為PCR擴(kuò)增gfp片段(720bp)；

D中泳道4為重疊PCR擴(kuò)增P_zwf-gfp片段(1205bp)；

E中泳道5為PCR鑒定陽性菌株(2208bp)；

圖5：大腸桿菌THRD的P_ppc替換為P_zwf各階段PCR驗(yàn)證圖

其中，M為DNA marker；1為P_ppc上游同源臂；2為Cm；3為P_ppc下游同源臂；4為P_zwf；5為重疊片段；

圖6：大腸桿菌THRD的P_ppc替換為P_zwf陽性轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證圖

其中，1為原菌THRD；2為Cm片段敲除前陽性轉(zhuǎn)化子；3為Cm片段敲除后陽性轉(zhuǎn)化子。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1：甜菜堿增強(qiáng)P_zwf表達(dá)強(qiáng)度試驗(yàn)

1、包含zwf基因啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白表達(dá)基因gfp的重組載體的構(gòu)建

(1)載體pUC19的改造

對(duì)載體pUC19進(jìn)行改造，通過設(shè)計(jì)反向擴(kuò)增引物pUC19-F/pUC19-R用以去除其整個(gè)Lac操縱子(見圖4)，改造后的載體片段命名為pUC19-L(SEQ ID No.1)；

(2)zwf基因啟動(dòng)子和gfp基因的擴(kuò)增及重疊片段的構(gòu)建

以大腸桿菌MG1655基因組中的zwf啟動(dòng)子序列(SEQ ID No.2)為模版設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物P_zwf–up和P_zwf-down；以pEGFP-N1質(zhì)粒上的gfp(SEQ ID No.3)基因序列為模版設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物gfp–up和gfp–down，引物P_zwf–down與gfp–up中間含有20bp的重疊序列，引物P_zwf–up與gfp–down的5’端各含有與載體待克隆位置上下游的同源序列。

使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase分別擴(kuò)增zwf基因啟動(dòng)子P_zwf和gfp基因，電泳驗(yàn)證得到目的條帶(見圖4)，使用廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司的OMEGA的PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收得到P_zwf和gfp基因片段；

PCR體系如下：

再通過PrimeSTAR HS DNA Polymerase酶對(duì)P_zwf片段和gfp基因片段進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，電泳驗(yàn)證得到目的條帶(見圖4)，使用試劑盒進(jìn)行回收得到P_zwf-gfp待用；

PCR體系如下：

(3)構(gòu)建載體pUC19-P_zwf-gfp

使用ClonExpress-II One Step Cloning Kit試劑盒將載體pUC19-L與重疊片段P_zwf-gfp進(jìn)行重組連接；

重組連接體系如下：

(4)重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化：

①將重組連接產(chǎn)物37℃水浴30min后冰浴5min，加入至E.coli DH5α感受態(tài)中，用移液器混勻，繼續(xù)冰浴20min；

②將EP管放置于42℃水浴鍋中，熱激60s；

③冰浴2min，加入800μL SOC復(fù)蘇液，37℃，200rpm孵育1h；

④8000rpm離心2min，留100μL液體，重懸菌體，涂布于含有氨芐青霉素抗性的LB平板中，37℃培養(yǎng)過夜。

(5)陽性克隆子的驗(yàn)證：

菌落PCR體系

在超凈臺(tái)中用牙簽尖端精確的挑取一個(gè)單菌落，作為模板進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。PCR實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行電泳驗(yàn)證(見圖4)，得到陽性菌株，將陽性突變子接種至LB搖管中，37℃培養(yǎng)過夜，甘油管保藏于-80℃中，命名為pUC19L-P_zwf-gfp。

2、熒光檢測(cè)及G6PDH的酶活力測(cè)定

(1)從甘油管中吸取20μL的pUC19L-P_zwf-gfp菌液至含氨芐青霉素抗性的5mL LB搖管中，37℃，200rpm培養(yǎng)12h；

(2)從5mL搖管中按0.1％的接種量轉(zhuǎn)接至30mL的LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)8h；

(3)按2％的接種量接種至50mL的LB培養(yǎng)基中(試驗(yàn)組中分別添加終濃度為0.05g/L、0.1g/L、0.5g/L、0.75g/L、1g/L甜菜堿；對(duì)照組中不添加甜菜堿)，37℃，200rpm培養(yǎng)，分別取6h、9h、12h的樣品測(cè)定OD₆₀₀；

(4)使用日本Hitachi公司的F-7000型熒光分光光度計(jì)測(cè)量樣品的GFP的熒光值。設(shè)定激發(fā)波長為491nm，發(fā)射波長為511nm；

試驗(yàn)結(jié)果見下表(熒光增強(qiáng)系數(shù))及圖1，可知甜菜堿的添加能夠增強(qiáng)P_zwf的表達(dá)；

(5)取甜菜堿添加量分別為0.5g/L和1g/L的12h樣品測(cè)定G6PDH的活力；

G6PDH的酶活力按照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)試劑盒進(jìn)行操作，結(jié)果見圖2。由圖2可知，甜菜堿的添加能夠提高菌體的G6PDH酶活；

(6)測(cè)定添加甜菜堿的培養(yǎng)體系對(duì)菌體生物量的影響，見圖3，可知添加甜菜堿對(duì)于菌體的生長(OD₆₀₀)有一定的影響，高濃度的抑制作用比較明顯，綜合圖1中甜菜堿對(duì)P_zwf表達(dá)量的影響，確定在表達(dá)或發(fā)酵體系中甜菜堿的添加量為0.5-1g/L，可在目的產(chǎn)物生產(chǎn)高峰期通過流加的方式補(bǔ)充甜菜堿，這樣可以減少甜菜堿對(duì)菌體生長的不利影響，也可以提高P_zwf表達(dá)強(qiáng)度。

實(shí)施例2：大腸桿菌THRD的P_ppc替換為P_zwf

1、ppc基因啟動(dòng)子P_ppc上、下游同源臂、Cm基因和zwf基因啟動(dòng)子P_zwf的擴(kuò)增

以大腸桿菌MG1655基因組上ppc基因(SEQ ID No.20)啟動(dòng)子P_ppc上、下游同源臂序列為模板設(shè)計(jì)引物ppc-up-1/2和ppc-down-1/2；

以大腸桿菌MG1655基因組上zwf啟動(dòng)子序列為模板設(shè)計(jì)引物zwf-1和zwf-2；

以質(zhì)粒pKD3為模板設(shè)計(jì)Cm片段引物Cm-up和Cm-down。

使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase分別擴(kuò)增ppc基因啟動(dòng)子上、下游同源臂序列和zwf啟動(dòng)子序列，電泳驗(yàn)證得到目的條帶(見圖5)，使用廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司的OMEGA的PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收得到ppc基因啟動(dòng)子上、下游同源臂和zwf啟動(dòng)子片段；再通過PrimeSTAR HS DNAPolymerase酶對(duì)P_zwf片段、ppc啟動(dòng)子上、下游同源臂和Cm片段進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，電泳驗(yàn)證得到目的條帶(見圖5)，使用試劑盒進(jìn)行回收得到ppc-up-Cm-P_zwf-ppc-down待用；

PCR體系如下：

2、將重疊片段ppc-up-Cm-P_zwf-ppc-down轉(zhuǎn)化入大腸桿菌THRD感受態(tài)細(xì)胞

首先利用CaCl₂轉(zhuǎn)化法將pKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌THRD感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。而后利用電轉(zhuǎn)化的方法將重疊片段ppc-up-Cm-P_zwf-ppc-down轉(zhuǎn)化入帶有質(zhì)粒pKD46(溫敏質(zhì)粒)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，32℃培養(yǎng)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。在42℃培養(yǎng)丟失質(zhì)粒pKD46。

利用CaCl₂轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pCP20(溫敏質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化入丟掉pKD46的重組菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行Cm片段敲除，32℃過夜培養(yǎng)，利用引物ppc-up-1和ppc-down-2進(jìn)行PCR驗(yàn)證和篩選陽性轉(zhuǎn)化子(見圖6)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子并轉(zhuǎn)接到液體LB培養(yǎng)基，42℃繼續(xù)培養(yǎng)。次日進(jìn)行對(duì)點(diǎn)平板培養(yǎng)基(分別為添加氯霉素的LB固體培養(yǎng)基和無抗性LB固體培養(yǎng)基)，篩選在添加氯霉素的平板上不可以生長，而在無抗平板上可以生長的單菌落，將篩選到的陽性菌轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，送部分菌液到金唯智生物科技有限公司測(cè)序以保證啟動(dòng)子序列沒有突變。保菌備用。

實(shí)施例3：搖瓶發(fā)酵

試驗(yàn)菌株：實(shí)施例2所得菌株；原始菌THRD；

(1)將試驗(yàn)菌株分別進(jìn)行斜面培養(yǎng)活化，37℃培養(yǎng)16h，進(jìn)行轉(zhuǎn)接一次(二代斜面活化)，37℃培養(yǎng)10h；

(2)用接種環(huán)劃取上述二代斜面兩環(huán)菌泥到30mL種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀為8；

(3)按照10％的接種量將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)，缺糖后開始流加糖，甜菜堿隨糖進(jìn)行流加(流加80％的葡萄糖，含2.5g/L甜菜堿，每次每30mL發(fā)酵體系流加1mL)，發(fā)酵28h結(jié)束；

缺糖標(biāo)準(zhǔn)：培養(yǎng)基超過20min沒有顏色變化(即pH沒有發(fā)生變化)，即可確定是缺糖表現(xiàn)；

所述種子培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)：葡萄糖40，酵母粉20，蛋白胨10，磷酸二氫鉀2.5，硫酸鎂1.0，硫酸亞鐵0.02，硫酸錳0.02，V_B1 0.003，V_H 0.0005，苯酚紅30，其余為水，pH 7.0-7.2；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)：葡萄糖45，酵母粉5，蛋白胨8，磷酸二氫鉀4，檸檬酸鈉2.5，硫酸鎂1.5，V_B1 0.002，V_H 0.04，硫酸錳0.2，硫酸亞鐵0.2，甜菜堿0.6，苯酚紅30，其余為水，pH 7.0-7.2；

(4)發(fā)酵結(jié)束后，利用高效液相色譜法(HPLC,C18,150mm*4.6mm/5μm,UV-VIS,Shimadzu)檢測(cè)L-蘇氨酸濃度，柱溫33℃，檢測(cè)波長360nm，流動(dòng)相0.42％乙酸鈉和50％的乙腈，流速1mL/min；

試驗(yàn)結(jié)果見下表：

由表可知，實(shí)施例2所得菌株L-蘇氨酸產(chǎn)量52.1g/L，原菌的產(chǎn)量為48.7g/L。從啟動(dòng)子替換前后菌體的OD值來看，兩者在生長上沒有明顯差異。啟動(dòng)子替換后菌株的糖酸轉(zhuǎn)化率提高到38.2％，說明代謝流更多地流向L-蘇氨酸合成的方向。

實(shí)施例4：搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)

試驗(yàn)菌株：實(shí)施例2所得菌株

(1)將上述菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)活化，37℃培養(yǎng)14h，轉(zhuǎn)接一次，37℃培養(yǎng)8h；

(2)將斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀為6；

(3)按照10％的接種量將種子培養(yǎng)液接種到30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)，發(fā)酵過程中，缺糖后開始流加糖，甜菜堿隨糖進(jìn)行流加(流加80％的葡萄糖，含2.5g/L甜菜堿，每次每30mL發(fā)酵體系流加1mL)，發(fā)酵32h結(jié)束；

所述種子培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨2，磷酸二氫鉀0.75，硫酸鎂0.25，硫酸亞鐵0.005，硫酸錳0.005，V_B1 0.001，V_H 0.0001，苯酚紅15，其余為水，pH 7.0-7.2；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)：葡萄糖15，酵母粉1，蛋白胨1，磷酸二氫鉀1，檸檬酸鈉0.5，硫酸鎂0.5，V_B1 0.0004，V_H 0.01，硫酸錳0.05，硫酸亞鐵0.05，甜菜堿0.4，苯酚紅15，其余為水，pH 7.0-7.2；

所述缺糖標(biāo)準(zhǔn)為：培養(yǎng)基超過20min沒有顏色變化，即pH沒有發(fā)生變化，即可確定是缺糖；

試驗(yàn)組即為上述試驗(yàn)，對(duì)照組為上述試驗(yàn)中去除培養(yǎng)基以及流加葡萄糖中的甜菜堿，其他均相同。試驗(yàn)結(jié)果見下表：

由表格數(shù)據(jù)可知，對(duì)照組L-蘇氨酸產(chǎn)量為51.2g/L，而試驗(yàn)組搖瓶發(fā)酵L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到54.7g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率從37.5％提高至40.9％。

實(shí)施例5：搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)

試驗(yàn)菌株：實(shí)施例2所得菌株

(1)將上述菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)活化，37℃培養(yǎng)14h，轉(zhuǎn)接一次，37℃培養(yǎng)8h；

(2)將斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀為6；

(3)按照10％的接種量將種子培養(yǎng)液接種到30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)，發(fā)酵過程中，缺糖后開始流加糖，甜菜堿隨糖進(jìn)行流加(流加80％的葡萄糖，含2.5g/L甜菜堿，每次每30mL發(fā)酵體系流加1mL)，發(fā)酵30h結(jié)束；

所述種子培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)：葡萄糖30，酵母粉15，蛋白胨5，磷酸二氫鉀1.0，硫酸鎂0.5，硫酸亞鐵0.0075，硫酸錳0.01，V_B1 0.0015，V_H 0.0002，苯酚紅15，其余為水，pH 7.0-7.2；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)：葡萄糖25，酵母粉2，蛋白胨1.5，磷酸二氫鉀1.5，檸檬酸鈉0.75，硫酸鎂0.75，V_B1 0.0006，V_H 0.015，硫酸錳0.075，硫酸亞鐵0.075，甜菜堿0.5，苯酚紅25，其余為水，pH 7.0-7.2；

所述缺糖標(biāo)準(zhǔn)為：培養(yǎng)基超過20min沒有顏色變化，即pH沒有發(fā)生變化，即可確定是缺糖；

試驗(yàn)組即為上述試驗(yàn)，對(duì)照組為上述試驗(yàn)中去除培養(yǎng)基以及流加葡萄糖中的甜菜堿，其他均相同。試驗(yàn)結(jié)果見下表：

由表中數(shù)據(jù)可知，對(duì)照組L-蘇氨酸的產(chǎn)量是50.2g/L，試驗(yàn)組L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到53.9g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率從37.6％提高至41.2％。

實(shí)施例6：5L罐發(fā)酵試驗(yàn)

試驗(yàn)菌株：實(shí)施例2所得菌株；

(1)進(jìn)行斜面培養(yǎng)活化，37℃培養(yǎng)14h，進(jìn)行轉(zhuǎn)接一次(二代斜面活化)，37℃培養(yǎng)10h。

(2)轉(zhuǎn)接6根上述二代斜面到種子培養(yǎng)基，37℃，DO控制在25-40％。培養(yǎng)至OD₆₀₀為16，按照16.6％的接種量將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，定容至3L。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖35，玉米漿30mL/L，酵母粉3，硫酸鎂0.25，硫酸亞鐵0.01，硫酸錳0.01，磷酸二氫鉀1.5，檸檬酸2，硫酸銨2，其余為水，pH 7.0-7.2；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉2，玉米漿12mL/L，硫酸鎂0.5，硫酸亞鐵0.01，硫酸錳0.01，磷酸二氫鉀2，甜菜堿0.4，其余為水，pH 7.0-7.2。

(3)發(fā)酵過程中利用氨水(25％)調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2，DO控制在30％-40％，待底糖耗盡，流加80％的葡萄糖(含2.5g/L的甜菜堿)，整個(gè)發(fā)酵過程葡萄糖濃度控制在5g/L以下。

(4)發(fā)酵30h結(jié)束發(fā)酵，統(tǒng)計(jì)、分析相關(guān)數(shù)據(jù)并測(cè)定L-蘇氨酸產(chǎn)量；

試驗(yàn)組即為上述試驗(yàn)，對(duì)照組為上述試驗(yàn)中去除培養(yǎng)基以及流加葡萄糖中的甜菜堿，其他均相同。試驗(yàn)結(jié)果見下表；

由表中數(shù)據(jù)可知，添加甜菜堿前后菌體生長沒有明顯差異，不添加甜菜堿L-蘇氨酸的產(chǎn)量為126.4g/L；添加甜菜堿后L-蘇氨酸產(chǎn)量為127.9g/L。糖酸轉(zhuǎn)化率從57.2％提高至60.2％。

實(shí)施例7：5L罐發(fā)酵試驗(yàn)

試驗(yàn)菌株：實(shí)施例2所得菌株；

(1)將上述菌株進(jìn)行斜面活化，37℃培養(yǎng)14h，轉(zhuǎn)接一次，37℃培養(yǎng)8h；

(2)將斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，DO控制在25-40％，至OD₆₀₀為12，按照18％的接種量將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基；

(3)發(fā)酵過程中利用氨水(25％)調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2，DO控制在30％-40％，待底糖耗盡，流加80％的葡萄糖(含2.5g/L的甜菜堿)，整個(gè)發(fā)酵過程葡萄糖濃度控制在5g/L以下；

種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)：葡萄糖15，玉米漿20mL/L，酵母粉1，硫酸鎂0.15，硫酸亞鐵0.005，硫酸錳0.005，磷酸二氫鉀1.0，檸檬酸1.0，硫酸銨1.0，其余為水，pH 7.0-7.2；

發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)：葡萄糖10，酵母粉1，玉米漿10mL/L，硫酸鎂0.25，硫酸亞鐵0.005，硫酸錳0.005，磷酸二氫鉀1.0，甜菜堿0.6，其余為水，pH 7.0-7.2；

(4)發(fā)酵32h結(jié)束發(fā)酵，統(tǒng)計(jì)、分析相關(guān)數(shù)據(jù)并測(cè)定L-蘇氨酸產(chǎn)量；

試驗(yàn)組即為上述試驗(yàn)，對(duì)照組為上述試驗(yàn)中去除培養(yǎng)基以及流加葡萄糖中的甜菜堿，其他均相同。試驗(yàn)結(jié)果見下表：

由表格數(shù)據(jù)可知，對(duì)照組L-蘇氨酸產(chǎn)量為119.6g/L，試驗(yàn)組L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到125.2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率從56.9％提高至59.2％。

實(shí)施例8：5L罐發(fā)酵試驗(yàn)

試驗(yàn)菌株：實(shí)施例2所得菌株；

(1)進(jìn)行斜面培養(yǎng)活化，37℃培養(yǎng)16h，進(jìn)行轉(zhuǎn)接一次(二代斜面活化)，37℃培養(yǎng)10h。

(2)轉(zhuǎn)接6根上述二代斜面到種子培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，DO控制在25-40％，至OD₆₀₀為14，按照14％的接種量將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，定容至3L。

種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)：葡萄糖45，玉米漿50mL/L，酵母粉5，硫酸鎂0.5，硫酸亞鐵0.025，硫酸錳0.025，磷酸二氫鉀4.0，檸檬酸5.0，硫酸銨5.0，其余為水，pH 7.0-7.2；

發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)：葡萄糖25，酵母粉5，玉米漿25mL/L，硫酸鎂1.0，硫酸亞鐵0.02，硫酸錳0.02，磷酸二氫鉀5.0，甜菜堿0.5，其余為水，pH 7.0-7.2。

(3)發(fā)酵過程中利用氨水(25％)調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2，DO控制在30％-40％，待底糖耗盡，流加80％的葡萄糖(含2.5g/L的甜菜堿)，整個(gè)發(fā)酵過程葡萄糖濃度控制在5g/L以下。

(4)發(fā)酵30h結(jié)束發(fā)酵，統(tǒng)計(jì)、分析相關(guān)數(shù)據(jù)并測(cè)定L-蘇氨酸產(chǎn)量；

試驗(yàn)組即為上述試驗(yàn)，對(duì)照組為上述試驗(yàn)中去除培養(yǎng)基以及流加葡萄糖中的甜菜堿，其他均相同。試驗(yàn)結(jié)果見下表：

由表格數(shù)據(jù)可知，對(duì)照組L-蘇氨酸的產(chǎn)量為139.6g/L，試驗(yàn)組L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到147.2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率從56.9％提高至60.6％。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大學(xué)

<120> 一株大腸桿菌基因工程菌及利用其生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法

<130> 1

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2252

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc 60

ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt 120

tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag 180

gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 240

cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 300

caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat 360

ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca 420

gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc 480

gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 540

atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg 600

caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 660

gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 720

accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag 780

ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg 840

gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca 900

acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 960

atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 1020

ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 1080

gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 1140

gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 1200

tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt 1260

taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 1320

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1380

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1440

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1500

agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1560

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1620

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1680

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1740

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1800

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1860

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 1920

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 1980

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2040

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2100

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc 2160

aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 2220

gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca at 2252

<210> 2

<211> 485

<212> DNA

<213> MG1655

<400> 2

tcggttcgct aacattggct tccagtgcca tagcagcaat actcgaatgg atcgcgttat 60

cgggcgaagc cagaatgacc tcggcaactt tgcgctctga tttgctcaaa tgttccagct 120

gagactggat tttttccagc atattcatga tgtaaagaga ctcacgggta atgacgattt 180

ccgcactgaa agaaatcgaa atgcagtttt gtcagatatt acgcctgtgt gccgtgttaa 240

tgacaaaagc agataaaaaa gttgttattt tttttcataa catgatcagt gtcagatttt 300

tacccaatgg aaaacgatga tttttttatc agttttgccg cactttgcgc gcttttcccg 360

taatcgcacg ggtggataag cgtttacagt tttcgcaagc tcgtaaaagc agtacagtgc 420

accgtaagaa aattacaagt ataccctggc ttaagtaccg ggttagttaa cttaaggaga 480

atgac 485

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> pEGFP-N1質(zhì)粒

<400> 3

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttaagccagc cccgacaccc 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

attgcgttgc gctcactg 18

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggcagtgagc gcaacgcaat tcggttcgct aacattggct 40

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgctcaccat gtcattctcc ttaagttaac taacccg 37

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggagaatgac atggtgagca agggcgag 28

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gggtgtcggg gctggcttaa ttacttgtac agctcgtcca tgc 43

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agcaccgcct acatacctcg 20

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcatttatca gggttattgt ctcat 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caactggttg aagtggttga gaa 23

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tacacaatcg ctcaatcact gtcggtcgga taagatg 37

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cttaaggaga atgacatatg aacgaacaat attccgcat 39

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atttcggttg ggtgagccgt gag 23

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtgcgttaca tcccttcggt tcgctaacat tggcttc 37

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

attgttcgtt catatgtcat tctccttaag ttaactaacc cg 42

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tccgaccgac agtgattgag cgattgtgta ggctggag 38

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atgttagcga accgaaggga tgtaacgcac tgagaagc 38

<210> 20

<211> 2652

<212> DNA

<213> MG1655

<400> 20

atgaacgaac aatattccgc attgcgtagt aatgtcagta tgctcggcaa agtgctggga 60

gaaaccatca aggatgcgtt gggagaacac attcttgaac gcgtagaaac tatccgtaag 120

ttgtcgaaat cttcacgcgc tggcaatgat gctaaccgcc aggagttgct caccacctta 180

caaaatttgt cgaacgacga gctgctgccc gttgcgcgtg cgtttagtca gttcctgaac 240

ctggccaaca ccgccgagca ataccacagc atttcgccga aaggcgaagc tgccagcaac 300

ccggaagtga tcgcccgcac cctgcgtaaa ctgaaaaacc agccggaact gagcgaagac 360

accatcaaaa aagcagtgga atcgctgtcg ctggaactgg tcctcacggc tcacccaacc 420

gaaattaccc gtcgtacact gatccacaaa atggtggaag tgaacgcctg tttaaaacag 480

ctcgataaca aagatatcgc tgactacgaa cacaaccagc tgatgcgtcg cctgcgccag 540

ttgatcgccc agtcatggca taccgatgaa atccgtaagc tgcgtccaag cccggtagat 600

gaagccaaat ggggctttgc cgtagtggaa aacagcctgt ggcaaggcgt accaaattac 660

ctgcgcgaac tgaacgaaca actggaagag aacctcggct acaaactgcc cgtcgaattt 720

gttccggtcc gttttacttc gtggatgggc ggcgaccgcg acggcaaccc gaacgtcact 780

gccgatatca cccgccacgt cctgctactc agccgctgga aagccaccga tttgttcctg 840

aaagatattc aggtgctggt ttctgaactg tcgatggttg aagcgacccc tgaactgctg 900

gcgctggttg gcgaagaagg tgccgcagaa ccgtatcgct atctgatgaa aaacctgcgt 960

tctcgcctga tggcgacaca ggcatggctg gaagcgcgcc tgaaaggcga agaactgcca 1020

aaaccagaag gcctgctgac acaaaacgaa gaactgtggg aaccgctcta cgcttgctac 1080

cagtcacttc aggcgtgtgg catgggtatt atcgccaacg gcgatctgct cgacaccctg 1140

cgccgcgtga aatgtttcgg cgtaccgctg gtccgtattg atatccgtca ggagagcacg 1200

cgtcataccg aagcgctggg cgagctgacc cgctacctcg gtatcggcga ctacgaaagc 1260

tggtcagagg ccgacaaaca ggcgttcctg atccgcgaac tgaactccaa acgtccgctt 1320

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