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      一株大腸桿菌基因工程菌及利用其生產(chǎn)L?蘇氨酸的方法與流程

      文檔序號:12696930閱讀:來源:國知局

      技術(shù)特征:

      1.一株大腸桿菌基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌是將出發(fā)菌株的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的啟動子Pppc替換為6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的啟動子Pzwf,從而達(dá)到能通過甜菜堿調(diào)節(jié)其L-蘇氨酸生產(chǎn)能力的目的。

      2.如權(quán)利要求1所述的一株大腸桿菌基因工程菌,其特征在于,所述出發(fā)菌株為E.coli THRD,保藏編號CGMCC No.11074。

      3.如權(quán)利要求1所述的一株大腸桿菌基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌的構(gòu)建方法如下:

      (1)ppc基因啟動子Pppc上、下游同源臂(ppc-up和ppc-down)、Cm基因和zwf基因啟動子Pzwf的擴(kuò)增;

      (2)構(gòu)建包含上述片段的連接片段ppc-up-Cm-Pzwf-ppc-down;

      (3)將上述連接片段轉(zhuǎn)化入大腸桿菌THRD感受態(tài)細(xì)胞,篩選獲得ppc基因啟動子Pppc被zwf基因啟動子Pzwf替換的突變株。

      4.一種利用權(quán)利要求1或2所述菌株生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法,其特征在于,發(fā)酵過程中在發(fā)酵體系中添加0.5-1g/L的甜菜堿,從而實(shí)現(xiàn)L-蘇氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率的提高。

      5.如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法,其特征在于,搖瓶發(fā)酵方法具體如下:

      (1)將菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)活化,37℃培養(yǎng)14-16h,轉(zhuǎn)接一次,37℃培養(yǎng)8-10h;

      (2)將斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中,37℃,200rpm培養(yǎng)至OD600為6-8;

      (3)按照10%的接種量將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,37℃,200rpm培養(yǎng),發(fā)酵過程中,缺糖后開始流加糖,甜菜堿隨糖進(jìn)行流加,所述流加的糖為80%的葡萄糖,含2.5g/L甜菜堿,每次每30mL發(fā)酵體系流加1mL,發(fā)酵28-32h結(jié)束。

      6.如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法,其特征在于,發(fā)酵罐發(fā)酵方法具體如下:

      (1)將菌株進(jìn)行斜面活化,37℃培養(yǎng)14-16h,轉(zhuǎn)接一次,37℃培養(yǎng)8-10h;

      (2)將斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng),至OD600為12-16,按照14-18%的接種量將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基;

      (3)發(fā)酵過程中利用氨水調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2,DO控制在30%-40%,待底糖耗盡,流加含2.5g/L的甜菜堿的80%的葡萄糖,整個發(fā)酵過程葡萄糖濃度控制在5g/L以下;

      (4)發(fā)酵28-32h結(jié)束發(fā)酵。

      7.權(quán)利要求5所述生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法,其特征在于,

      所述種子培養(yǎng)基組成以g/L計(jì):葡萄糖20-40,酵母粉5-20,蛋白胨2-10,磷酸二氫鉀0.75-2.5,硫酸鎂0.25-1.0,硫酸亞鐵0.005-0.02,硫酸錳0.005-0.02,VB1 0.001-0.003,VH0.0001-0.0005,苯酚紅15-30,其余為水,pH 7.0-7.2;

      所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計(jì):葡萄糖15-45,酵母粉1-5,蛋白胨1-8,磷酸二氫鉀1-4,檸檬酸鈉0.5-2.5,硫酸鎂0.5-1.5,VB1 0.0004-0.002,VH 0.01-0.04,硫酸錳0.05-0.2,硫酸亞鐵0.05-0.2,甜菜堿0.4-0.6,苯酚紅15-30,其余為水,pH 7.0-7.2。

      8.權(quán)利要求6所述生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法,其特征在于,

      種子培養(yǎng)基以g/L計(jì):葡萄糖15-45,玉米漿20-50mL/L或干粉8-20,酵母粉1-5,硫酸鎂0.15-0.5,硫酸亞鐵0.005-0.025,硫酸錳0.005-0.025,磷酸二氫鉀1.0-4.0,檸檬酸1.0-5.0,硫酸銨1.0-5.0,其余為水,pH 7.0-7.2;

      發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì):葡萄糖10-25,酵母粉1-5,玉米漿10-25mL/L或干粉4.0-10,硫酸鎂0.25-1.0,硫酸亞鐵0.005-0.02,硫酸錳0.005-0.02,磷酸二氫鉀1.0-5.0,甜菜堿0.4-0.6,其余為水,pH 7.0-7.2。

      9.權(quán)利要求1或2所述菌株的應(yīng)用。

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