本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及載脂蛋白II/I的結(jié)構(gòu)及其獲得方法、新生物學(xué)功能以及在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及載脂蛋白II/I及其活性片段的結(jié)構(gòu)及其制備生產(chǎn)方法與功能，以及其在微生物及其相關(guān)分子模式檢測(cè)診斷、促進(jìn)昆蟲(chóng)血淋巴黑色素產(chǎn)生、誘導(dǎo)昆蟲(chóng)合成抗菌肽等生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，制備載脂蛋白II/I與活性片段抗體及其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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載脂蛋白是血漿脂蛋白中的蛋白質(zhì)部分，其基本功能是轉(zhuǎn)運(yùn)脂類(lèi)物質(zhì)、穩(wěn)定脂蛋白結(jié)構(gòu)等。載脂蛋白在人類(lèi)等哺乳動(dòng)物中被稱(chēng)為apolipoprotein(apo)，分為A、B、C、D、E五類(lèi)。這些載脂蛋白亞型的異常，已經(jīng)被證實(shí)與阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病相關(guān)。而在昆蟲(chóng)中，載脂蛋白被稱(chēng)為apolipophorin(apoLp)，它們構(gòu)成了昆蟲(chóng)脂蛋白的蛋白部分。

昆蟲(chóng)apoLp-I及apoLp-II來(lái)源于同一個(gè)mRNA前體apoLp-II/I，并在蛋白的翻譯后修飾及分泌過(guò)程中被弗林蛋白酶(Furin)切割形成。而apoLp-II/I的載脂功能并不依賴(lài)于這種切割作用。apoLp-II為N端部分、apoLp-I為C端部分，二者參與形成高密度脂蛋白(high-density lipophorin,HDLp)。昆蟲(chóng)載脂蛋白前體apoLp-II/I與哺乳動(dòng)物apoB-48同源，兩者均是脂蛋白顆粒中的重要組成部分，在脂類(lèi)運(yùn)輸及代謝上起到不可或缺的作用。

ApoLp-II/I與其他家族成員一樣，其N(xiāo)端包含一個(gè)較大的LLT結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域形成一個(gè)“l(fā)ipid pocket”樣的結(jié)構(gòu)，主要參與與脂類(lèi)的結(jié)合，起到貯存或運(yùn)輸?shù)淖饔?。除了N端結(jié)構(gòu)域之外，apoLp-II/I還包含一個(gè)DUF1081結(jié)構(gòu)域，以及靠近C端的von Willebrand factor module D(VWD)結(jié)構(gòu)域。但這些結(jié)構(gòu)域的功能目前尚無(wú)定論。

對(duì)昆蟲(chóng)apoLp-II/I的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)、生物合成與分泌，以及脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)作用等方面。但最新的研究發(fā)現(xiàn)，apoLp-II/I還參與了昆蟲(chóng)的先天性免疫反應(yīng)。有報(bào)道指出，家蠶apoLp-II/I能夠抑制金黃色葡萄球菌的溶血毒性。純化后的apoLp-II/I能夠降低S.aurues中與溶血素(hemolysin)相關(guān)的基因，包括hla，hlb，saeRS以及RNAIII的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，apoLp-II/I是通過(guò)與S.aurues細(xì)胞表面的LTA結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)后者的雙組份系統(tǒng)影響S.aurues的saePQRS操縱子，最終抑制了溶血素的表達(dá)及分泌。在岡比亞按蚊中，apoLp-II/I是全身性免疫反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控因子。RNA干擾apoLp-II/I后，按蚊的免疫應(yīng)答程度顯著性提高了。而這種提高作用是補(bǔ)體樣蛋白TEP1(thioester-containing protein 1，硫酯蛋白)依賴(lài)性的，干擾apoLp-II/I能夠使TEP1的表達(dá)量增高，而后者經(jīng)由JNK通路產(chǎn)生免疫反應(yīng)。上述例子表明，昆蟲(chóng)apoLp-II/I不僅參與了脂類(lèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，同時(shí)也是一種先天性免疫相關(guān)蛋白。

目前尚未見(jiàn)對(duì)鱗翅目(Lepidoptera)的天(大)蠶蛾科昆蟲(chóng)載脂蛋白II/I的結(jié)構(gòu)、制備、生物學(xué)功能及其應(yīng)用的相關(guān)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一系列載脂蛋白II/I及其制備方法。

所述的載脂蛋白II/I的氨基酸序列如SEQ ID：2所示；

編碼所述載脂蛋白II/I的氨基酸序列的基因序列如SEQ ID：1所示。

本發(fā)明還提供了所述天然載脂蛋白II/I、重組載脂蛋白II/I活性片段。

所述的載脂蛋白II/I活性片段包括SEQ ID：1或SEQ ID：2所述的序列。

所述的載脂蛋白II/I活性片段的序列如SEQ ID：3-6所示。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述天然載脂蛋白II/I，重組載脂蛋白II/I活性片段，以天然載脂蛋白II/I、重組載脂蛋白II/I活性片段作為抗原的抗體在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用，包括1.針對(duì)微生物的預(yù)防、檢測(cè)診斷、治療等生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用；2.針對(duì)微生物相關(guān)分子模式的預(yù)防、檢測(cè)診斷、治療等生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用；3.針對(duì)天然載脂蛋白II/I、重組載脂蛋白II/I活性片段的檢測(cè)與追蹤等生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用；4.通通過(guò)其抑制鱗翅目天(大)蠶蛾科昆蟲(chóng)的酚氧化酶原激活系統(tǒng)的激活情況，從而抑制鱗翅目天(大)蠶蛾科昆蟲(chóng)的免疫防御系統(tǒng)，提高鱗翅目的天(大)蠶蛾科昆蟲(chóng)的抗微生物能力。

本發(fā)明是針對(duì)鱗翅目的天(大)蠶蛾科昆蟲(chóng)體內(nèi)的apoLp-II/I，研究天然apoLp-II/I的制備方法、一級(jí)結(jié)構(gòu)(基因和蛋白質(zhì))、生物學(xué)功能以及其應(yīng)用，利用基因工程技術(shù)獲得重組apoLp-II/I活性片段以及其生物學(xué)功能和應(yīng)用。此外，利用天然、重組apoLp-II/I活性片段作為抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，同時(shí)研究了該抗體的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

首先利用蛋白提取、分離、純化技術(shù)，從鱗翅目天(大)蠶蛾科昆蟲(chóng)中分離、純化獲得天然apoLp-II/I。其次，利用蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)，解析apoLp-II/I的一級(jí)結(jié)構(gòu)(基因和蛋白質(zhì))并獲得其基因。再次，利用基因工程技術(shù)，實(shí)現(xiàn)apoLp-II/I基因片段在宿主細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)合蛋白提取、分離、純化技術(shù)獲得重組apoLp-II/I。同時(shí)，利用基因重組技術(shù)，獲得apoLp-II/I部分片段。天然、重組apoLp-II/I部分片段，能特異性識(shí)別Lys-肽聚糖、DAP-肽聚糖以及脂磷壁酸等多種微生物相關(guān)分子模式以及革蘭陽(yáng)性菌和部分真菌、革蘭陰性菌等微生物。上述結(jié)合，能夠抑制昆蟲(chóng)體液免疫中的酚氧化酶原激活系統(tǒng)。本發(fā)明的天然、重組apoLp-II/I及其部分片段以及其抗體的生物學(xué)功能，可廣泛應(yīng)用于針對(duì)微生物的預(yù)防、檢測(cè)診斷、治療等生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

本發(fā)明的apoLp-II/I，其核苷酸序列如SEQ ID：1，其氨基酸序列如SEQ ID：2所示。

其制備方法如下：

一、天然apoLp-II/I的制備

本發(fā)明所獲得天然apoLp-II/I是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，包括：

以昆蟲(chóng)血淋巴作為原料，分別通過(guò)親和層析、疏水層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、鹽析、超濾或上述方法的不同組合，分離純化得到不同純度乃至電泳純或HPLC純的apoLp-II/I。

其中，昆蟲(chóng)血淋巴(簡(jiǎn)稱(chēng)血淋巴)，是昆蟲(chóng)血液(或血細(xì)胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆蟲(chóng)壓榨或勻漿的體液，用緩沖溶液或酸性溶液或堿性溶液溶解提取，離心除去不溶雜質(zhì)得到的抽提液。

apoLp-II/I的提取、分離、純化體系基本條件的特征：(1)溶液的酸堿度在pH2～pH10，優(yōu)選pH4-pH9；(2)調(diào)節(jié)溶液酸堿度的化學(xué)試劑是常規(guī)、通用的酸或堿及其溶液。酸及其溶液優(yōu)選HCl、HAc、磷酸、檸檬酸、硫酸、硼酸。堿及其溶液優(yōu)選NaOH、KOH、Tris、檸檬酸鈉或鉀鹽、磷酸鈉或鉀鹽、硼砂；(3)緩沖液是常規(guī)、通用緩沖離子對(duì)緩沖液，優(yōu)選檸檬酸根緩沖離子對(duì)、HCl-Tris緩沖離子對(duì)、檸檬酸根-磷酸根緩沖離子對(duì)、磷酸根緩沖離子對(duì)、醋酸根緩沖離子對(duì)、硼酸根緩沖離子對(duì)、硼酸-Tris緩沖離子對(duì)、上述各緩沖離子的組合；(4)溶液或緩沖液的離子強(qiáng)度在0.001mol/L～0.8mol/L，優(yōu)選0.01mol/L～0.3mol/L。上述條件既不破壞提取、分離、純化所采用介質(zhì)的理化性質(zhì)，又不影響apoLp-II/I的生物活性。

昆蟲(chóng)血淋巴的收集：將昆蟲(chóng)用蒸餾水或去離子水反復(fù)清洗，采用常規(guī)方法，如蠟盤(pán)法、離心法、背血管取血法、灌注法、壓榨、勻漿法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪開(kāi)法、穿刺法等，在10℃至～5℃條件下收集昆蟲(chóng)血淋巴。

本發(fā)明的分離分析方法包含如下中的兩種或兩種以上的組合：

1.離子交換層析分離純化apoLp-II/I

取上述方法所獲昆蟲(chóng)血淋巴，按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至要求條件范圍下。將處理好的樣品上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的離子交換層析，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用鹽濃度階段方式，分別用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L鹽溶液進(jìn)行階段洗脫；也可以采用鹽濃度梯度方式，梯度為0.00mol/L～3mol/L。利用抗apoLp-II/I抗體檢測(cè)目的蛋白的存在情況，將含有apoLp-II/I的洗脫液合并儲(chǔ)存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽，或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲(chǔ)存上述樣品溶液備用。

離子交換層析分離純化的特征：(1)層析介質(zhì)選擇陽(yáng)離子交換層析填料，如CM-離子交換層析填料或SP-離子交換層析填料或S-離子交換層析填料等陽(yáng)離子交換層析填料，此時(shí)緩沖液酸堿度選擇在pH2-pH7；(2)層析介質(zhì)選擇陰離子交換層析填料，如Q-離子交換層析填料或DEAE-離子交換層析填料或QAE-離子交換層析填料等離子交換層析填料，此時(shí)緩沖液酸堿度選擇在pH7-pH12；(3)緩沖液及其濃度選擇，按上述APOLP-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；(4)洗脫的鹽溶液可以選擇要求濃度的緩沖液或在緩沖液中加中性鹽到需要的濃度；(5)中性鹽選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl，優(yōu)選NaCl；(6)分離純化操作溫度按上述APOLP-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。上述條件既不影響apoLp-II/I的生物活性，又不影響活性成分的分離純化。

2.親和層析分離純化apoLp-II/I

取上述方法所獲昆蟲(chóng)血淋巴，按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至apoLp-II/I的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。將處理好的樣品液上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的親和層析，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用鹽(或化學(xué)試劑)濃度梯度(0.0mol/L～3.0mol/L或0.0mol/L～6.0mol/L或0.0mol/L～8.0mol/L)方式洗脫；也可以采用鹽(或化學(xué)試劑)階段濃度洗脫方式，分別采用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L鹽溶液進(jìn)行階段方式洗脫。利用抗APOLP-II/I抗體檢測(cè)目的蛋白的存在情況，將含有APOLP-II/I的洗脫液合并儲(chǔ)存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽(或化學(xué)試劑)或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲(chǔ)存上述樣品溶液備用。

親和層析分離純化的特征：(1)親和填料的配基選擇apoLp-II/I抗體、肝素、刀豆素、甲醛固定后的細(xì)菌或真菌、sepharose CL-4B、N-乙酰氨基葡萄糖胺、肽聚糖、脂磷壁酸、葡聚糖等；(2)分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按APOLP-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；(3)洗脫的鹽(或化學(xué)試劑)溶液可以選擇要求濃度的緩沖液或在緩沖液中加鹽(或化學(xué)試劑)到需要的濃度；(4)洗脫用鹽(或化學(xué)試劑)可以選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl或尿素或鹽酸胍；(5)洗脫用鹽(或化學(xué)試劑)選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl的最高濃度為3.0mol/L，選擇尿素的最高濃度為8.0mol/L，選擇鹽酸胍的最高濃度為6.0mol/L；(6)如果洗脫用鹽(或化學(xué)試劑)選擇了尿素或鹽酸胍而使apoLp-II/I發(fā)生變性作用，可以通過(guò)常規(guī)、通用的蛋白質(zhì)復(fù)性方法進(jìn)行復(fù)性而獲得apoLp-II/I。

3.疏水層析分離純化apoLp-II/I

取上述方法所獲昆蟲(chóng)血淋巴，按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至apoLp-II/I的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。加中性鹽至2mol/L濃度，上樣于預(yù)先用2mol/L中性鹽-緩沖液溶液平衡的疏水層析柱，先用2mol/L中性鹽-緩沖液溶液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用中性鹽濃度梯度(2.0mol/L～0.0mol/L)方式洗脫；也可以采用鹽濃度階段洗脫方式，分別采用1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性鹽溶液進(jìn)行階段方式洗脫。利用抗apoLp-II/I抗體檢測(cè)目的蛋白的存在情況，將含有apoLp-II/I的洗脫液合并儲(chǔ)存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲(chǔ)存上述樣品溶液備用。

疏水層析分離純化的特征：(1)疏水層析介質(zhì)選擇苯基-疏水層析填料或正辛烷-疏水層析填料-或己烷-疏水層析填料-或丁烷-疏水層析填料；(2)中性鹽選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl；(3)分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。

4.凝膠層析分離純化apoLp-II/I

取上述方法所獲昆蟲(chóng)血淋巴，按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至apoLp-II/I的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。樣品液上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的凝膠過(guò)濾層析柱并進(jìn)行分離純化洗脫，利用抗apoLp-II/I抗體檢測(cè)目的蛋白的存在情況，將含有APOLP-II/I的洗脫液合并儲(chǔ)存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲(chǔ)存上述樣品溶液備用。

凝膠層析分離純化的特征：(1)層析介質(zhì)可以選擇Sephacryl S-100HR或Sephacryl S-200HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12prep grade或Superose 6prep grade或Superdex 30prep grade或Superdex 75prep grade或Superose 12HR或Superose 6HR或Superdex Peptide HR或Superdex75HR或Superdex Peptide PE等凝膠層析填料；(2)分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征，此外洗脫液的濃度，優(yōu)選在離子濃度大于0.15M及以上。

5.鹽析分離純化apoLp-II/I

取上述方法所獲昆蟲(chóng)血淋巴，按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至apoLp-II/I的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。在樣品溶液中加入蛋白質(zhì)鹽析常規(guī)、通用的中性鹽，至濃度達(dá)到apoLp-II/I仍處于溶解狀態(tài)，而一些雜蛋白處于沉淀。離心取其上清溶液繼續(xù)加入鹽析常規(guī)、通用的中性鹽至濃度達(dá)到apoLp-II/I沉淀狀態(tài)。離心棄上清，沉淀溶于apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件特征的溶液或緩沖液儲(chǔ)存?zhèn)溆?；沉淀的溶解液，也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去其中的鹽或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲(chǔ)存上述樣品溶液備用。

鹽析分離純化的特征：(1)分離純化的緩沖液、酸堿度選擇，是按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；(2)鹽析使用的中性鹽，選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl，優(yōu)選(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄；(3)在使apoLp-II/I處于溶解狀態(tài)時(shí)，選擇中性鹽在5％—45％，優(yōu)選10％—40％；(4)在使apoLp-II/I處于沉淀狀態(tài)時(shí)，選擇中性鹽在40％—90％，優(yōu)選45％—75％。

6.超濾分離純化apoLp-II/I以及處理apoLp-II/I溶液

取上述方法所獲昆蟲(chóng)血淋巴，按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至apoLp-II/I的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。利用常規(guī)、通用超濾方法，分離純化apoLp-II/I。一種方案，選擇一定規(guī)格的超濾膜，使apoLp-II/I透過(guò)超濾膜，而一些雜蛋白則被超濾膜截留，從而使apoLp-II/I得以分離純化；透過(guò)超濾膜的apoLp-II/I溶液，再選擇一定規(guī)格的超濾膜，使apoLp-II/I被截留，而一些雜蛋白則透過(guò)超濾膜，從而使apoLp-II/I得以分離純化。另一種方案，是選擇一定規(guī)格的超濾膜，使apoLp-II/I先被超濾膜截留，隨后再選擇一定規(guī)格的超濾膜，使apoLp-II/I透過(guò)超濾膜，從而使apoLp-II/I得以分離純化。

超濾處理apoLp-II/I溶液的目的，是除去apoLp-II/I溶液中的鹽或小分子雜質(zhì)或更換緩沖液。此外，對(duì)apoLp-II/I溶液進(jìn)行濃縮。處理方法同上所述，選擇一定規(guī)格的超濾膜，使apoLp-II/I被超濾膜截留，而鹽或小分子雜質(zhì)或緩沖液的緩沖離子對(duì)則透過(guò)超濾膜，從而實(shí)現(xiàn)去除鹽、小分子雜質(zhì)或更換緩沖液或濃縮的目的。

超濾分離純化和處理的特征：透過(guò)apoLp-II/I的超濾膜選擇分子量為20kDa或30kDa或40kDa或50kDa或60kDa規(guī)格的超濾膜，優(yōu)選20kDa～50kDa的超濾膜，大于或小于優(yōu)選規(guī)格的超濾膜，其收率或超濾效率均受影響；(2)超濾分離純化或處理的操作溫度、緩沖液及其酸堿度或濃度選擇，是按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。

通過(guò)上述任何一種方法所獲得的apoLp-II/I純度，有時(shí)無(wú)法滿足相應(yīng)需要。

本發(fā)明是從昆蟲(chóng)血淋巴中分離純化高純度apoLp-II/I，并可以達(dá)到電泳純乃至HPLC純度。其特征在于，將上述六種分離純化方法(離子交換柱層析、親和柱層析、疏水柱層析、凝膠過(guò)濾柱層析、鹽析、超濾)，進(jìn)行兩種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或三種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或四種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或五種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，純化方法自由組合及其順序重排組合，直至樣品純度得到預(yù)期要求。

本發(fā)明所指昆蟲(chóng)是鱗翅目昆蟲(chóng)，鱗翅目昆蟲(chóng)優(yōu)選天(大)蠶蛾科(Saturniidae)昆蟲(chóng)，選自柞蠶、蓖麻蠶、天蠶、印度柞蠶、琥珀蠶、美國(guó)柞蠶、樗蠶、大山蠶、美洲天蠶、樟蠶、楓蠶，昆蟲(chóng)為任何地域的天然或人工放養(yǎng)或人工飼養(yǎng)的昆蟲(chóng)。為使本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員更全面、清晰理解本發(fā)明，以柞蠶作為代表來(lái)描述下面的內(nèi)容，而選擇柞蠶作為代表來(lái)描述并不是以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。

本發(fā)明所述的載脂蛋白II/I、載脂蛋白II/I活性片段是利用基因工程表達(dá)獲得，包括(1)原核生物系統(tǒng)的表達(dá)載體，表達(dá)宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或枯草桿菌細(xì)胞，(2)酵母細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)載體，表達(dá)宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞，(3)昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)載體，表達(dá)宿主細(xì)胞為昆蟲(chóng)細(xì)胞，(4)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)載體，表達(dá)宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。上述表達(dá)形式為細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或分泌形式表達(dá)，上述表達(dá)體系中的表達(dá)產(chǎn)物作為制備載脂蛋白II/I、載脂蛋白II/I類(lèi)似物或活性片段的來(lái)源。

所述“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。

本發(fā)明所指微生物以及其相關(guān)分子模式是真菌、革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌以及其相關(guān)分子模式。為使本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員更全面、清晰理解本發(fā)明，以畢赤酵母、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌等作為微生物(真菌、革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌)代表來(lái)描述下面的內(nèi)容，以Lys-PGN、DAP-PGN、脂磷壁酸、甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖、脂多糖等作為微生物相關(guān)分子模式代表來(lái)描述下面的內(nèi)容，而選擇上述具體的微生物或具體的微生物相關(guān)分子模式作為代表來(lái)描述并不是以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。

二apoLp-II/I結(jié)構(gòu)解析以及其基因序列解析

按照常規(guī)蛋白質(zhì)化學(xué)與分子生物學(xué)的技術(shù)、方法、手段，對(duì)apoLp-II/I進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。包括：(1)利用生物質(zhì)譜測(cè)定天然apoLp-II/I的分子量；(2)采用常規(guī)蛋白水解酶及其水解條件，針對(duì)發(fā)明內(nèi)容所獲得apoLp-II/I進(jìn)行降解，通過(guò)HPLC分離降解片段，利用生物質(zhì)譜或Edman降解方法解析部分氨基酸序列，從而獲得apoLp-II/I分子內(nèi)許多片段的氨基酸序列；(3)利用分子生物學(xué)技術(shù)、方法，從昆蟲(chóng)脂肪體提取總RNA，利用RACE技術(shù)構(gòu)建昆蟲(chóng)cDNA pool。根據(jù)目的蛋白降解片段的氨基酸序列，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增片段基因。隨后結(jié)合RACE技術(shù)獲得apoLp-II/I基因—cDNA，通過(guò)基因序列測(cè)定分析獲得其堿基序列并由其開(kāi)放閱讀框堿基序列推導(dǎo)獲得apoLp-II/I全長(zhǎng)一級(jí)結(jié)構(gòu)；(4)利用分子生物學(xué)技術(shù)、方法等，從昆蟲(chóng)脂肪體提取其染色體基因。設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增上下游引物，以昆蟲(chóng)染色體基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增apoLp-II/I染色體基因，通過(guò)基因序列測(cè)定分析獲得apoLp-II/I染色體基因中的內(nèi)含子、外顯子序列；(5)通過(guò)上述所獲得apoLp-II/I的分子量、分子內(nèi)部分氨基酸序列、cDNA開(kāi)放閱讀框序列、染色體基因中的外顯子序列，彼此相互驗(yàn)證上述結(jié)構(gòu)信息，獲得apoLp-II/I全長(zhǎng)一級(jí)結(jié)構(gòu)序列、天然apoLp-II/I一級(jí)結(jié)構(gòu)序列(參見(jiàn)SEQ ID:1和ID:2)。

三、重組apoLp-II/I活性片段的制備

本發(fā)明還包含具有apoLp-II/I序列的重組apoLp-II/I活性片段。

所述的重組apoLp-II/I活性片段含有apoLp-II序列，包括Met-apoLp-II成熟肽氨基酸序列、Met-組氨酸標(biāo)簽-apoLp-II成熟肽氨基酸序列、Met-apoLp-II成熟肽-His6標(biāo)簽氨基酸序列、Met-His6標(biāo)簽-凝血酶酶切位點(diǎn)-apoLp-II成熟肽氨基酸序列(參見(jiàn)SEQ ID：3-6)。

本發(fā)明的重組apoLp-II/I部分片段通過(guò)基因工程表達(dá)制備獲得，通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，包括：(1)將apoLp-II/I部分片段編碼DNA重組至表達(dá)載體；(2)用步驟⑴的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(原核或真核細(xì)胞)；(3)在適合的誘導(dǎo)表達(dá)條件下，培養(yǎng)步驟⑵的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)收獲并純化所得到的目的蛋白。

本發(fā)明同時(shí)提供上述重組apoLp-II/I部分片段的表達(dá)產(chǎn)物分離純化方法?？墒褂名}析沉淀、超濾、親和層析、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過(guò)濾等方法以及上述方法的多種組合，從基因工程細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物或培養(yǎng)液中分離并純化所需的表達(dá)產(chǎn)物。在表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化過(guò)程中，可使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印跡法(Western)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的存在及相應(yīng)分子大小。

四、apoLp-II/I及其部分片段的生物學(xué)功能及其應(yīng)用

本發(fā)明再一個(gè)目的是針對(duì)天然、重組apoLp-II/I部分片段的體外結(jié)合特異性、對(duì)微生物的結(jié)合與凝集作用以及對(duì)激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)的激活情況、對(duì)抗菌肽合成的激活作用的對(duì)比，確定了天然、重組apoLp-II/I部分片段的生物活性。同時(shí)，考察apoLp-II/I在機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程的表達(dá)，也研究了天然、重組APOLP-II/I部分片段的應(yīng)用。

此外，本發(fā)明也研究了天然、重組apoLp-II/I及其部分片段作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體、抗體的制備以及其應(yīng)用。

本發(fā)明所述的天然、重組apoLp-II/I及其部分片段獲得方法常規(guī)、簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高。

附圖說(shuō)明：

圖1為分離純化天然apoLp-II/I電泳圖譜

A：實(shí)施例1中方法-1分離獲得天然apoLp-II/I的電泳圖譜；

B：實(shí)施例1中方法-2分離獲得天然apoLp-II/I的電泳圖譜；

C：實(shí)施例1中方法-3分離獲得天然apoLp-II/I的電泳圖譜。

圖2為分離純化重組apoLp-II/I部分片段(原核表達(dá)體系)電泳圖譜

泳道1：實(shí)施例3中方法-(1)所獲得重組apoLp-II/I部分片段的電泳圖譜；

泳道2：實(shí)施例3中方法-(2)所獲重組apoLp-II/I部分片段的電泳圖譜；

泳道3：實(shí)施例3中方法-(3)所獲重組apoLp-II/I部分片段的電泳圖譜。

圖3為分離純化重組apoLp-II/I部分片段(真核表達(dá)體系)電泳圖譜

泳道1：實(shí)施例4中方法-(1)所獲重組apoLp-II/I部分片段的電泳圖譜；

泳道2：實(shí)施例4中方法-(2)所獲重組apoLp-II/I部分片段的電泳圖譜。

圖4為天然apoLp-II/I及重組apoLp-II/I部分片段的生物學(xué)活性

4-A：實(shí)施例6中天然apoLp-II/I與微生物的結(jié)合特異性；

4-B：實(shí)施例6中天然apoLp-II/I與微生物相關(guān)分子模式的結(jié)合特異性；

4-C：實(shí)施例6中重組apoLp-II/I部分片段與微生物的結(jié)合特異性；

4-D：實(shí)施例6中apoLp-II/I的表達(dá)量與先天性免疫的相關(guān)性；

4-E：實(shí)施例6中體外抑制天然apoLp-II/I及重組apoLp-II/I部分片段活性對(duì)酚氧化酶原激活系統(tǒng)的影響；

4-F：實(shí)施例6中體內(nèi)干擾apoLp-II/I表達(dá)對(duì)酚氧化酶原激活系統(tǒng)的影響。

具體實(shí)施方式：

下面的實(shí)施例可以使本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。

實(shí)施例1

天然apoLp-II/I的分離純化

1.方法1

收取血淋巴，12000×g離心后取上清。進(jìn)行40％硫酸銨沉淀；離心取沉淀用50mM檸檬酸緩沖溶液pH5.2，100mM NaCl,5％甘油進(jìn)行復(fù)溶；離心后取上清，過(guò)Sephacryl S-200柱，收集含有目的蛋白的流出組分；該組分用50mM PB pH8.0透析后，經(jīng)HiTrapTM SP柱以0-1M NaCl梯度洗脫，收集含目的蛋白的流出組分。

試驗(yàn)結(jié)果如圖1-A泳道7，其中箭頭1所指為載脂蛋白I、箭頭2所指為載脂蛋白II，天然apoLp-II/I的純度達(dá)到電泳純。

2.方法2

柞蠶血淋巴使用70％硫酸銨沉淀，然后于4℃，8000×g離心15min。棄上清沉淀用50mM MES，200mM NaCl，2mM DTT，5％甘油，pH6.2復(fù)溶并透析。透析后樣品過(guò)磷酸纖維素柱，用200mM-600mM NaCl梯度洗脫，收集含目的蛋白的組分。上述組分用50mM MES，100mM NaCl，2mM DTT，5％甘油，pH6.2透析，透析后樣品于4℃，8000×g離心15min。除去沉淀。上清組分過(guò)Mono S柱，用150mM-600mM NaCl梯度洗脫，收集含目的蛋白組分上述組分過(guò)SuperdexTM 200柱(50mM MES，200mM NaCl，2mM DTT，5％甘油，pH6.2)，收集含目的蛋白組分。

試驗(yàn)結(jié)果如圖1-B泳道4，其中箭頭1所指為載脂蛋白I、箭頭2所指為載脂蛋白II，天然apoLp-II/I的純度達(dá)到電泳純。

3.方法3

柞蠶血淋巴使用70％硫酸銨沉淀，然后于4℃，8000×g離心15min。棄上清沉淀用磷酸鹽緩沖溶液復(fù)溶，上羥基磷灰石柱，用磷酸根離子梯度洗脫，收集含目的蛋白組分；上述組分用磷酸鹽緩沖溶液透析，上陰離子交換柱HiTrapTM Q，使用NaCl濃度梯度進(jìn)行洗脫，收集含目的蛋白組分；上述組分添加(NH₄)₂SO₄至濃度為2M，上苯基疏水柱，使用(NH₄)₂SO₄濃度降低梯度進(jìn)行洗脫，收集含目的蛋白組分；上述組分上凝膠過(guò)濾柱Sephacryl S-100，收集含目的蛋白組分。

試驗(yàn)結(jié)果如圖1-C泳道5，其中箭頭1所指為載脂蛋白I、箭頭2所指為載脂蛋白II，天然apoLp-II/I的純度達(dá)到電泳純。

實(shí)施例2：

apoLp-II/I結(jié)構(gòu)解析以及其基因序列解析

按照常規(guī)蛋白質(zhì)化學(xué)與分子生物學(xué)的技術(shù)、方法、手段，對(duì)apoLp-II/I進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。具體方法、手段按照發(fā)明內(nèi)容二中所列內(nèi)容實(shí)施。

獲得apoLp-II/I完整核苷酸序列及其氨基酸序列(如SEQ ID:1和ID:2所示)。

實(shí)施例3：

利用原核生物表達(dá)系統(tǒng)獲得重組apoLp-II/I活性片段

本實(shí)施例列舉描述原核生物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明apoLp-II/I活性片段基因的構(gòu)建策略和基本方法。

原核生物表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略，均為基因工程表達(dá)的常規(guī)、通用的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略。

本實(shí)施是為使本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。

對(duì)于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化方法，是采用實(shí)施例1的方法、原理、策略等。

1.apoLp-II/I活性片段的表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)天然apoLp-II/I中N末端apoLp-II的氨基酸序列，分別設(shè)計(jì)相應(yīng)寡核苷酸引物，同時(shí)在上述兩個(gè)寡核苷酸引物的5′端，分別加上限制性核酸內(nèi)切酶水解位點(diǎn)序列；以昆蟲(chóng)脂肪體cDNA pool為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物并進(jìn)行核酸片段的凝膠回收；經(jīng)過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后與同樣進(jìn)行雙酶切表達(dá)質(zhì)粒，在DNA連接酶的作用下進(jìn)行重組連接，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)過(guò)菌落PCR和限制性核酸內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后提交生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。通過(guò)上述基因工程的方法，構(gòu)建apoLp-II基因的表達(dá)載體。

本實(shí)施例表達(dá)載體構(gòu)建的特征：1。以大腸桿菌為宿主，表達(dá)載體可選擇pTYB11、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b等；2.可以在apoLp-II的N端前融合一段肽段作為親和層析的標(biāo)簽(Tag)；3.可以在apoLp-II的C段后融合一段肽段作為親和層析的標(biāo)簽(Tag)；4.標(biāo)簽可以選擇His-Tag(連續(xù)六個(gè)及以上組氨酸)、GST-Tag、Flag-Tag等；5.可以在親和層析標(biāo)簽與apoLp-II之間，添加蛋白水解酶水解位點(diǎn)的氨基酸序列，如凝血酶、腸激酶、凝血X因子等，以獲得與天然apoLp-II蛋白結(jié)構(gòu)一致的重組apoLp-II蛋白。

2.重組apoLp-II/I活性片段的獲得

利用基因工程技術(shù)，將含有apoLp-II/I基因中apoLp-II核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落后接種至含抗生素的LB，誘導(dǎo)apoLp-II基因的表達(dá)，從而獲得含有apoLp-II的培養(yǎng)液或菌體。含有apoLp-II的菌體首先經(jīng)裂解液裂解、超聲破碎，釋放目的蛋白后利用離心方法收集上清液作為重組APOLP-II/I的原料液備用。

重組目的基因表達(dá)的特征：1.表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主的方式可以選擇熱轉(zhuǎn)化法和電轉(zhuǎn)化方法；2.誘導(dǎo)表達(dá)的方式包括化學(xué)誘導(dǎo)—異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)和加溫誘導(dǎo)；3.apoLp-II基因可表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外；3.存在于細(xì)胞內(nèi)的apoLp-II需通過(guò)裂解液裂解、超速破碎等方式，將目的蛋白釋放至溶液中。

按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，從上述含apoLp-II的原料液中分離純化重組apoLp-II至需要的純度，直至達(dá)到電泳純或HPLC純。

例如：

(1)采用pTYB11構(gòu)建無(wú)標(biāo)簽apoLp-II表達(dá)載體，采用電轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，apoLp-II表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)。采用裂解緩沖液重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，離心獲得上清液作為進(jìn)一步分離純化apoLp-II的原料液。按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，分離純化apoLp-II至電泳純(圖2-泳道1)。

(2)采用pET-28a構(gòu)建N端前融合組氨酸標(biāo)簽的apoLp-II基因，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，His-apoLp-II表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)。采用裂解緩沖液(50m mol/LPBS,0.15mol/L NaCl,50m mol/L咪唑)重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，離心獲得上清液作為進(jìn)一步分離純化apoLp-II的原料液。按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，分離純化apoLp-II至電泳純(圖2-泳道2)。

(3)采用pET20b構(gòu)建C端后融合組氨酸標(biāo)簽的apoLp-II基因，采用電轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，經(jīng)加溫誘導(dǎo)表達(dá)，apoLp-II-His表達(dá)于胞外。按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，分離純化apoLp-II至電泳純(圖2-泳道4)。

上述表達(dá)重組的apoLp-II結(jié)構(gòu)如SEQ ID：3-5所示，分離純化獲得的重組表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE驗(yàn)證其純度如圖2所示。

上述含標(biāo)簽的純化后表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)上述常規(guī)、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、腸激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表達(dá)產(chǎn)物中的融合肽段，再經(jīng)分離純化從而獲得apoLp-II，該重組apoLp-II的結(jié)構(gòu)與天然apoLp-II的結(jié)構(gòu)相同。

實(shí)施例4：

利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得重組apoLp-II/I活性片段

本實(shí)施例列舉描述昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明apoLp-II/I活性片段基因的構(gòu)建策略和基本方法。

昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略，均為基因工程表達(dá)的常規(guī)、通用的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略。

本實(shí)施例是使本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。

對(duì)于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化方法，采用實(shí)施例1的方法、原理、策略等。

1.利用pMIB/V5-His-Sf21昆蟲(chóng)表達(dá)體系獲得重組apoLp-II/I活性片段

將apoLp-II/I活性片段基因(apoLp-II基因)連接到pMIB/V5-His質(zhì)粒中，構(gòu)建pMIB/V5-His-凝血酶酶切位點(diǎn)-apoLp-II重組表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)座大腸桿菌DH5，Blue-gal和IPTG誘導(dǎo)后，藍(lán)白篩選獲得轉(zhuǎn)座重組bacmid。轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf21，Western blot驗(yàn)證重組apoLp-II在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

收集細(xì)胞，用裂解緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重懸，超聲破碎后離心得到含有目的蛋白的原料液。直接上樣于預(yù)先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過(guò)0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗滌去除大量雜蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)進(jìn)行洗脫，重組蛋白質(zhì)獲得高效表達(dá)，達(dá)到電泳純度。表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如SEQ ID：6所示，純化后的電泳鑒定結(jié)果如圖3-泳道1。

2.利用pFastBac1-sf9昆蟲(chóng)表達(dá)體系獲得重組apoLp-II/I活性片段

將apoLp-II/I活性片段基因(apoLp-II基因)連接到pFastBac1質(zhì)粒中，構(gòu)建pFastBac1-apoLp-II重組表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)座大腸桿菌DH10，Blu-gal和IPTG誘導(dǎo)后，藍(lán)白篩選獲得轉(zhuǎn)座重組bacmid。轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9，Western blot驗(yàn)證重組apoLp-II在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

收集細(xì)胞，用裂解緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重懸，超聲破碎后離心得到含有目的蛋白的原料液。直接上樣于抗apoLp-II抗體—sepharose CL-6B為配基的親和層析柱，采用0mol/L-3mol/L NaCl的裂解緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，重組蛋白質(zhì)獲得高效表達(dá)，達(dá)到電泳純度。表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如SEQ ID：3所示，純化后的電泳鑒定結(jié)果如圖3-泳道2。

實(shí)施例5：

apoLp-II/I及其活性片段抗體的獲得

按照常規(guī)、通用的抗體產(chǎn)生的技術(shù)，利用實(shí)施例1、3、4獲得的各種apoLp-II/I及其活性片段作為抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)抗體。

利用常規(guī)、通用的抗體檢測(cè)方法，檢測(cè)被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的血清中apoLp-II/I抗體產(chǎn)生情況。

當(dāng)被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛產(chǎn)生apoLp-II/I抗體體后，采用常規(guī)、通用的動(dòng)物血清采集與存儲(chǔ)方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的血清并存儲(chǔ)，該血清可以直接應(yīng)用。

利用常規(guī)、通用的抗體分離純化技術(shù)，如鹽析、各種類(lèi)型層析介質(zhì)、抗體親和層析介質(zhì)等，從存儲(chǔ)的含有apoLp-II/I抗體的血清中分離純化不同純度的apoLp-II/I抗體，直至獲得電泳純或HPLC純的apoLp-II/I抗體，以適于不同要求的應(yīng)用。

實(shí)施例6：

天然apoLp-II/I及重組apoLp-II/I部分片段的生物學(xué)活性

為使本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。本實(shí)施例中天然apoLp-II/I、重組apoLp-II/I活性片段具有相同的生物活性。以柞蠶作為鱗翅目昆蟲(chóng)的生物活性實(shí)驗(yàn)昆蟲(chóng)為代表進(jìn)行描述。本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員可以以天然apoLp-II/I、重組apoLp-II/I活性片段的生物活性為核心與基礎(chǔ)，進(jìn)一步拓展天然apoLp-II/I、重組apoLp-II/I活性片段的應(yīng)用范圍。

1.天然apoLp-II/I及重組apoLp-II/I部分片段與微生物及其相關(guān)分子模式的結(jié)合特異性

(1)天然apoLp-II/I與微生物的結(jié)合特異性

采用western blotting方法考察天然apoLp-II/I與革蘭陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌)、革蘭陰性菌(大腸桿菌和綠膿假單胞桿菌)和真菌(白色念珠菌和釀酒酵母)的結(jié)合特性。利用天然apoLp-II/I分別與等量的微生物孵育，采用1MNaCl洗脫后，在高溫條件下2％SDS再次洗脫組分，利用apoLp-II/I多克隆抗體間接檢測(cè)天然apoLp-II/I與不同種類(lèi)微生物的結(jié)合情況。結(jié)果如圖4-A所示，天然apoLp-II/I與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌、釀酒酵母結(jié)合，而與綠膿假單胞桿菌、白色念珠菌不結(jié)合。

(2)天然apoLp-II/I與微生物相關(guān)分子模式的結(jié)合特異性

采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)天然apoLp-II/I對(duì)6種可溶性的，分別來(lái)自不同種微生物的典型分子模式(PAMP)的識(shí)別能力。Lys-PGN和LTA屬于革蘭陽(yáng)性菌的特異PAMPs，DAP-PGN和LPS屬于革蘭陰性菌的特異PAMPs，laminarin(可溶性β-1,3葡聚糖)和Mannan屬于真菌的特異PAMP。不同濃度的PAMPs被包被在96孔板上，依次將天然apoLp-II/I，兔源抗apoLp-II/I多克隆抗血清(一抗)以及偶聯(lián)有辣根過(guò)氧化酶的山羊抗兔IgG(二抗)加入96孔板孵育并徹底洗滌未結(jié)合組分，最后加入辣根過(guò)氧化酶底物，檢測(cè)在450nm下底物顯色的光吸收情況。如圖4-B所示，天然apoLp-II/I對(duì)Lys-PGN、LTA和DAP-PGN的結(jié)合具有濃度依賴(lài)性和飽和性，屬于特異性結(jié)合。天然apoLp-II/I對(duì)LPS、可溶性β-1,3葡聚糖和Mannan不具有結(jié)合能力。

(3)重組apoLp-II/I部分片段與微生物的結(jié)合特異性

按照實(shí)施例6中1-(1)中所述western blotting方法考察重組apoLp-II/I部分片段(包含apoLp-II基因)與革蘭陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌)、革蘭陰性菌(大腸桿菌)和真菌(釀酒酵母)的結(jié)合特性。以重組apoLp-II-His為例，結(jié)果如圖4-C所示，重組apoLp-II-His與上述三種微生物均具有結(jié)合作用，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與天然apoLp-II/I的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，天然apoLp-II/I可能通過(guò)特異性識(shí)別典型分子模式而與革蘭陽(yáng)性菌、部分革蘭陰性菌、部分真菌發(fā)生特異性結(jié)合。采用實(shí)施例3、4中所述重組apoLp-II/I部分片段可獲得相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.apoLp-II/I的表達(dá)量與先天性免疫的相關(guān)性

取五齡期柞蠶幼蟲(chóng)，一組未處理，一組為注射20μl金黃色葡萄球菌(OD600＝0.8)12小時(shí)后，解剖后分別取表皮、脂肪體、馬氏管、中腸，于液氮中研磨，然后取約100μl樣品，加入1ml Trizol溶液充分混勻。另取血細(xì)胞約100μl直接加入1ml Trizol溶液充分混勻。上述組分提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)apoLp-II/I的表達(dá)量。如圖4-D所示，apoLp-II/I在脂肪體和表皮中表達(dá)，其中脂肪體的表達(dá)量最大；apoLp-II/I的表達(dá)量因金黃色葡萄球菌的作用而顯著增加。上述結(jié)果說(shuō)明，apoLp-II/I與昆蟲(chóng)先天性免疫具有相關(guān)性。

3.天然apoLp-II/I及重組apoLp-II/I部分片段對(duì)酚氧化酶原激活系統(tǒng)的影響

(1)體外抑制天然apoLp-II/I及重組apoLp-II/I部分片段活性對(duì)酚氧化酶原激活系統(tǒng)的影響

將血淋巴首先與apoLp-II/I抗體共孵育，以封閉血淋巴中apoLp-II/I的生物學(xué)功能，利用6種微生物相關(guān)分子模式—Lys-PGN、LTA、DAP-PGN、LPS、laminarin、和Mannan分別激活血淋巴，比較apoLp-II/I抗體封閉前后，血淋巴中酚氧化酶原激活系統(tǒng)受6種微生物相關(guān)分子模式的激活情況。結(jié)果如圖4-E所示，apoLp-II/I抗體封閉后，6種微生物相關(guān)分子模式對(duì)血淋巴中酚氧化酶原激活系統(tǒng)的激活作用均有不同程度的提高。采用實(shí)施例3、4中所述重組apoLp-II/I部分片段可獲得相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

(2)體內(nèi)干擾apoLp-II/I表達(dá)對(duì)酚氧化酶原激活系統(tǒng)的影響

以dsEGFP為陰性對(duì)照，采用顯微注射法將apoLp-II/I特異性dsRNA導(dǎo)入柞蠶幼蟲(chóng)體內(nèi)，經(jīng)24h誘導(dǎo)后，收集血淋巴后分別加入微生物相關(guān)分子模式-可溶性β-1,3葡聚糖、Lys-PGN和DAP-PGN，通過(guò)測(cè)定PO的活力以判斷apoLp-II/I對(duì)酚氧化酶原激活系統(tǒng)的影響。如圖4-F所示，apoLp-II/I表達(dá)量的降低能夠體外顯著增強(qiáng)三種微生物相關(guān)分子模式對(duì)血淋巴酚氧化酶原的激活情況。

實(shí)施例7：

天然apoLp-II/I、重組apoLp-II/I活性片段及其抗體的應(yīng)用

為使本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍，本實(shí)施例以apoLp-II/I的生物活性為代表進(jìn)行描述，apoLp-II/I活性片段也具有相同的生物活性。同時(shí)也以柞蠶作為鱗翅目昆蟲(chóng)的生物活性實(shí)驗(yàn)昆蟲(chóng)為代表進(jìn)行描述。本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員可以以apoLp-II/I及重組apoLp-II/I活性片段及其抗體的生物活性為核心與基礎(chǔ)，進(jìn)一步拓展apoLp-II/I及重組apoLp-II/I活性片段及其抗體的應(yīng)用范圍。

1.apoLp-II/I及其活性片段抑制酚氧化酶原激活系統(tǒng)

如實(shí)施例6中所描述，apoLp-II/I及其活性片段可以抑制酚氧化酶原的激活，基于此，可應(yīng)用于利用酚氧化酶及酚氧化酶原激活系統(tǒng)的相關(guān)領(lǐng)域。

2.apoLp-II/I及其活性片段用于微生物的檢測(cè)

如實(shí)施例6中所描述，apoLp-II/I及其活性片段能夠與部分微生物及相關(guān)分子模式結(jié)合，基于此，通過(guò)檢測(cè)微生物與apoLp-II/I及其活性片段是否結(jié)合，檢測(cè)樣品中是否含有微生物或其相關(guān)分子模式。

3.apoLp-II/I及其活性片段抗體的應(yīng)用

針對(duì)實(shí)施例5獲得的apoLp-II/I及其活性片段作的抗體，利用免疫學(xué)以及分子生物學(xué)等常規(guī)、通用技術(shù)、方法等，通過(guò)apoLp-II/I及其活性片段的抗體，用于鱗翅目昆蟲(chóng)樣品的apoLp-II/I免疫檢測(cè)。同樣，也適用于從鱗翅目昆蟲(chóng)分離純化制備apoLp-II/I過(guò)程中的免疫檢測(cè)跟蹤分析以及樣品的定性、定量檢測(cè)分析。此方面的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在上述的天然、重組apoLp-II/I活性片段分離純化制備過(guò)程中的實(shí)施例應(yīng)用。

在任何待檢測(cè)微生物的樣品中，加入足夠劑量的apoLp-II/I及其活性片段抗體。按照本實(shí)施例中的apoLp-II/I及其活性片段用于微生物的檢測(cè)所述方法，進(jìn)行待檢測(cè)樣品的微生物檢測(cè)。同上結(jié)果，即便是樣品中有能夠被檢測(cè)出微生物的量也不能檢測(cè)出(陰性結(jié)果)，此實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)作為樣品微生物檢測(cè)的陰性對(duì)照組加以應(yīng)用。

如實(shí)施例6中所描述，apoLp-II/I及其活性片段可以抑制酚氧化酶原的激活，而利用apoLp-II/I及其活性片段的抗體封閉apoLp-II/I，能夠顯著提高酚氧化酶的活性?；诖?，可通過(guò)利用apoLp-II/I及其活性片段抗體調(diào)整酚氧化酶的活性，進(jìn)而可應(yīng)用于利用酚氧化酶及酚氧化酶原激活系統(tǒng)的相關(guān)領(lǐng)域。

上述結(jié)果表明：apoLp-II/I及其活性片段的抗體，通過(guò)與apoLp-II/I及其活性片段的結(jié)合而屏蔽了與微生物及其相關(guān)分子模式的結(jié)合生物活性，從而使apoLp-II/I及其活性片段失去了原有的生物活性?；谶@種結(jié)合屏蔽作用原理可以廣泛應(yīng)用。

SEQUENCE LISTING

<110> 沈陽(yáng)藥科大學(xué)

<120> 載脂蛋白-II/I及其功能、制備方法和應(yīng)用

<160> 10

<210> 1

<211> 10278

<212> DNA

<213> 柞蠶（Antheraea pernyi）

<220>

<221> mRNA

<222> (1)...(10278)

<220>

<221> CDS

<222> (93)...(10010)

<220>

<221> 5'UTP

<222> (1)...(92)

<220>

<221> sig_peptide

<222> (93)...(164)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (165)...(10007)

<220>

<221> 3'UTP

<222> (10011)...(10278)

<400> 1

attacttctc gctgaggtat aggcatcgga ccatagtatc tgcgtacaag actgacttat 60

aatttgtagt gatatacttt taccctgaca aaatggggaa aagtagactt agcttattta 120

gtgttatttt aataatttcc gttttatgga aaccagttta tagtaaagat aaatgctcta 180

tagaatgtca aggatctcct tcaaatccgg ctttcgtaca aggaaataaa tacagttata 240

gcgtcgaggg aacagtcacc atcttcctct cacccgctga tgaccaagtg accagcgtga 300

aactcattgg tcaagtttcg gtcgacgcct tggctaactg tgtccatgag ttatctgtgc 360

agaatctagt tatttccgga cctgatggaa agaaatatca gccgccaccc ggcatcgata 420

aggtcgtccg gttcggattc caagatggac gcgttggacc tgaaatatgc gcacatggag 480

acgatactcg ccgttcactc aatatcaaga gggccatcat atccttgctg caaacagagc 540

agaagccgtc gacacaggtg gatgtgttcg gtgtttgccc tacggaagtg tcctcatccc 600

aagaaggcag tgccgtcctt gtgcacagaa cacgtgacct ctctagatgc tctcatcgtg 660

aacaaggcaa aaatgacatc atcacttcta ttaccaaccc tgacgctgga atcaaggata 720

tgcaagtact ccagtctata ctgaacgtag agtcgaaagt aaacagcgga gttccagaga 780

aagtatctgc cacagaagag tacctttata aacctttctc tgttggagaa aacggtgcaa 840

gagcaaaggt tcatacaaaa ttaacgctta ctggaaaatc atcgtgcgga cagggagtag 900

cgtactgcac cgagtcacgt agcatcatct tcgacaaccc acatggtgtg aagccagttc 960

ctggtaatgc caattccgcc cttgctgctg tcaaggacgt tgcaaaatct gtatcaagca 1020

tcgtggaatc taaatctgct ggcgcatttg cacaacttat cagaattcta cgtatcacca 1080

gtaaggacga tctaatgaag gtttacagcc aagtgaaagg aagcaatttg gaaaagcggg 1140

tgttcctgga tgcccttctt cgagccggta ccggcgatag cattgaagca tctattaaca 1200

tcttgaagag tcgtgagttg ggtcaactgg agcagcaact ggtctacttg tctcttggaa 1260

acgcgagaca tgtcaataat gccgccctga aagccgctgc ctctttgctc gaccaaccaa 1320

acctgcctaa agaagtttat ctcggagttg gagcattggc cggtgcatac tgccgagaac 1380

acgagtgcca tactacaaag cctgtaggta tcgttgctct gagccaaaaa cttggagcca 1440

aactgcagaa ctgcagaccg agatccaaaa ctgaggaaga cactattgtt gccatcctca 1500

agggtatccg tagcatccgc catctggaag actcgcttat caataaaata gtacactgtg 1560

ccgcggataa taacgtgaag gctagtgtta aggcggcagc cttggaagct ttccacgccg 1620

acccttgcag cgctgcgata aagaaaactg caattgagat catgaagaat cgtcaattag 1680

actctgaaat ccgtatcaag gcttaccttg cagttatcca atgcccatgt ggtcaatcag 1740

ctaacgagat taagaacttg ttggatacag aacccgtaca tcaagttggt aattttatct 1800

caacatctct tcgttatatc cgaacgtcag caaatcccga caagcagctc gcgcgtcaac 1860

actacggcct cattaggaca cctaacaaat tcaattccga cgatcgaaaa tattcgttct 1920

accgcgagac atcattcaat atagatgctc ttggagctgg tggtagtgtt gatcaaaccg 1980

tcatttactc ccaagattcg tatctacctc gagaggctag cgttaactta actgttgaac 2040

tatttggaca tagctacaac gtgctagagt tgggaggacg ccaaggtaat ctagaccgtg 2100

taatcgaaca cttcttggga cctaaaggat atttccgtac cagtgaccct caggcactat 2160

acgacgatct ggtaaagaga tacgaggagt caaagaataa agtccaacgt ggtttcggtc 2220

gtggacgcag gtccatcaaa aacgaaatcg ataatttcga caaaaatctg aaagccgaat 2280

ctaattcata ccacaacgag ctcgatctgg atatctatgt gaagtttttc ggaactgatg 2340

ctgtcttcct gtcctttgga gatgacaaag gttttgactt taacaagatt ctcgatgaaa 2400

tccttggtac ttgcaacagt ggcattaata agctgaagca tttccagcaa gaactgcgca 2460

ctcatcttct atttatggac gccgaactaa gttatcctac atctgtgggt ctccccctgc 2520

gcttgaatct cgtaggatcc cttactgctc gtcttgatgt tgccactaat gtggatatcc 2580

aagaaatcat gaaatcacct caaagcgcaa aggtcgatgt caaattcgta ccaagcacag 2640

acgtcgaaat tgctggggct ctactcattg atgctgactc tgttaccacg ggtcttaaag 2700

ttatcaccaa cttacgctct tcaactggtc tccacgttat cgcgaaagtc atcgagaatg 2760

gtcgcggttt cgacctacaa cttggcctcc cagtagacaa acaagagatt ctggtagcct 2820

ctaatgaact ggtatacgtg acagctgaaa agggtcaaag ggagaaacaa acgaaaatta 2880

aaactggaca gagtatgcac gattattcgc cgtgtttcga ccagttgtct ggtgttcttg 2940

gtttgacact ctgcggacat ttctctttac ctttcagtat atctaatcgt gaaaaaccca 3000

gcgaccaaat aatctctcaa tttttcaatc ggttcccact atccggaaca gcttcagcga 3060

aaattgtcct tgaaaaaaac gacttaagtg gttatcatat taaaggtgtt gtccgtgagg 3120

atgccgctgc tggtaaaaag agcttcgaat ttttattcga cgcagaaggc tctcagaacc 3180

gtcacaccaa attaacaggt caatacgtct acaactcaaa tgaaatcggt gttaagcttg 3240

aacttcagtc tcctattaaa aatctttatg gagaaatatc agcctgtaat aatcccagag 3300

aactgatggc taaatacgta ggtagagtgg actccatgga atacaaaggt cggattggtt 3360

ttactgtcca gggcaatgag caacggtcag tttacagacc ggtatttgag tacagtatcc 3420

cagatggcag tgggcaaact cattcggctg aaattgttgg cgaagttatc aaagagacaa 3480

gtggcagaaa gtccaaatat acagccaggg gtttacagat cccaatggcg aaaggacaac 3540

agccagtgga agtaaatgga tacgtgtctc tgcaagatca gcccagagat gttgaggttg 3600

acctggcagt gaaaggatac gctagcctca agggttcttt gaaaggatct gacgttatga 3660

tagactttga gaacaattta aatcccaacg ttaatttcaa tatgaagggt aaattcgatt 3720

acaataatat gattcacaac gaattcgagc ttcaatacgg ccctaagaaa aatgatccac 3780

tatcaaaagt gagcttcttt cagcacctga aatatcacat tcaatctagc gaagattaca 3840

acatcatcac caaaaacagc tttgaaatcc gtgcggttcc actgaaggtg gtagcaaatg 3900

ctgacattga ccctaagaag gtcgtcattg atatcggagg acaatacgtt gacagaagcg 3960

ctaagcttga agtggaagct agaacaaaga tcaagaggcc aggagattac agcgtaaaag 4020

tcaaagctaa cctcaacgat gcctgtattg aagtcttatc gaaaagagat gttgtttccg 4080

ctgataaatc caacttcgag aattacctcg acatcacagg cgtagggcga tatgaactct 4140

caggagttgt gcttcataag accaaaccaa atgatatgaa cgttggtgct atcggtcatt 4200

ttaagattaa ggctggttcc aataatgaag atattaaatt cgatatcgga ttaattgaaa 4260

cttccaacat atactcttca cacgcccaag tctctaacag caaaggcgaa gtgcttgact 4320

ttttgttaaa agtaactcgc actgggaatc ccactggtca gctgaagttc aacttaaaag 4380

atatcatcgt aactcatgga gaattcaagg tcactgataa tgacggcaag ggtaatggaa 4440

tgatcatagt ggagttcaaa aaactacaac gtaaaataaa aggtgacgtc aaattcgtct 4500

ctaaggaccc ggtcttcatt accgacattg agttatacct cgattttgaa aagaataaca 4560

acaacaaatt ccacttcgta acgaataatc ggaagactca gaagctcgtt tcttccaaga 4620

acaaggttga gtacgatggt aaagttaccg aagtgaacta cgtacaagaa ggagttttct 4680

ctataactgg aaaaaccaat ctcaactttg acgtagtact cccaacagaa agatgtatta 4740

gcttgaagat agaccgcgat gtagccttga aagatggtaa atatagtgga catgcagagt 4800

tacttctctc tgattccgtg aagcgtggct cggcgtcgtc tgttatcagc tacaaaggaa 4860

aaattgttga caccgatatt gaaaaagaaa taattaatta tgagggccag cttgaattcc 4920

gtcttaagga tggtaaacaa ctgctgaaca cgttctacct gaagaacatt cctgagggca 4980

ataaattcaa gtttgacttt aagtctgacg tgaccggcaa cctgcttccc aaaccggcat 5040

ctcttagcgc tactggttct tacctcgact ccgagacaat cataaatcag aattatcgag 5100

tgaagggcaa ttatggggac gacattagct ttgaatatgt cgatcagtgg acgtgcaatt 5160

attcgagaag gacaaaaaaa tacttgagtg actacacagt aaccgtgcac cttccgttcg 5220

agaaggctca cgatatcaaa tgggcatcga cagttcagta cctacagcct gacggcaagg 5280

atatcgctga gtacacaata gttgaatctg tccaagttaa tgctgacgtc ttcaaggtgg 5340

acgctaatgg aaaagtcggt atcaagaacg gctccggagc tattaaagta ctcattccac 5400

ataacgatcc atttatagta gatttcaatt acaagagaga cagccaaggt gacaaaaata 5460

acaactttgt ggaagttaaa gcaaaatacg gcaagggcaa gactacttcg ctttcaattg 5520

actcttcgtt cgctcctcac gacagcactc tccaagtgaa agcttattct ccgaatgctg 5580

aaaaactcaa gaaactcgaa ctcaatattc actcaaagaa cccatctcct gatacataca 5640

gtaattctat aataatggac gctgatggac gtatctacaa atctgaatct accatcgtat 5700

tatcaaaggc tcacccagta ttggacattc aatacgttaa ccccgaaact aataaaccta 5760

gcagaatcta cgtgaaaggc agctcgctca gctcaactca aggcaagatc gaagtcaaag 5820

tagacaatat ttacaaaatc tgcttcgacg ttgtggccga gggtagtgtg cagaaagaca 5880

atgtcgcttt caaggccgtc gccaactcca aggaactcgg ctggaataac tacaacgtag 5940

atatcagcag caaggactcc ggaaacggca aacgattgga tttccacgcc attaacgaca 6000

acaagaacgt aattagtgga agcacgtcgt ttataagcaa gcaggaaggt cagaagacga 6060

tcattgaagg ttccggctcc gttaaagtaa aggaggagca gaagtgggct aatttcaagt 6120

tcatccgcac agtactgacg gagagtagtg aacagggtgt tgagacattc ttcaatgttg 6180

ctatcggcga acgaagctac gtggctgaat cacgtgtaac caattacgaa tacaaaaact 6240

cttatgtcta ctgtgaagag aagaagcaat gcgctcatgc tgaaatacaa tcaaagatcg 6300

atatgtcaac tcccggtgta atcgttaatc tcgtgaacat cggcttcgac cttcgcaaac 6360

tgggtgttgc ccctgaactc gggcttcaaa tgcgtgacga ggtctccact tccaaaccac 6420

cgcggttcac cctcgacctg cacgtcaata gccaggagag aaagtatcac ctccacgcgt 6480

acaacacgcc cgaacatggc cactttgcat ccggagttac cgttcgtcta ccatctagat 6540

tattggctct tgaatacact ctcgactatc ctaccgacaa gcttatgccg ttccccgtta 6600

ggggagaggt ttgtctggat cttgataaga ataagccggg acataagaca tctgctagat 6660

tcctcgtcga cttcactaac gctggaggaa gtcaagacac tgccattgct gaaattggat 6720

tcttccatcc taaaattgaa aaggaggccg tgttcagaat caatggagta gttaagcgac 6780

ctggtgatgg tactttcaag tttgaaactt cagccacgtt atcatgccac tctgcatttg 6840

gcagggaccg cgtctctaaa ctcttactgg aagtctcccc acgcaagttc gagttcttga 6900

ctgaaacacc attcgtaaag gtattgcaca tcgacgctgg cttcacatca accccggagc 6960

agagaactta ccagtcacta ttcagcgttt gcctactgga aggcaatgtg gttcaaataa 7020

aaacactgct caaggacttc caatatttcg aattcacaac agaggaatcc ggctgcaaat 7080

tctcgatcgt tgcacatctg gtaccggaga aacgtgctga tatcagtgcg gacctcatcc 7140

tatctggagg caagaagaac atcgctcacg gtgctttgtt ccttaaagac aacacgattc 7200

aatccgagta cggtgcctct aaggacaact tcaaccattt aatggctact gttaagaagg 7260

acgctgagag cctgaacgat cgtatcaaag atctcggtga aaaatccagt caagacttcc 7320

aacagcttct gcagcgcgct acaccatact tcaagcgcat tgacgatgac ttcagagccg 7380

agtgggaaag attctacaat gagatcgctg tcgacaaggt cttcaaagag ttgtcacaca 7440

ccctgaatga ggtcattcac tatttggcta agatattcga tgaaattctc caaggaacca 7500

aacccttggt agaccagatc accaagacct tcactgagac ttctgagaag atatcaggaa 7560

tgtacaagaa gacgcttgaa cctcaactga aacagctgta tgagactctt ggcaaaattc 7620

taaaagaata cttggatgct gccatcgaag ttgttgcaca tttaggcgca cttgtcagtg 7680

acttcttcga gaaacataag caagaacttc agcaactgac caacgtcatg actgaaatat 7740

ttaaagacct gacccgcatt atcgtagcgc aactgaagga gatgcctgga aagttcaacc 7800

aggtgtatgg ggaactcgtc caactaataa acaacatgcc gatcattgag gctattaaag 7860

aggagtggaa ggatggttta ccaaaggacc aaatactcgg aatgtgcaac caaggttacg 7920

ccgctatata ccaagtgctt ccaaataagg aattcaaaga ttttgctgaa gctttgaaca 7980

attacgtgat caagaaactc cgttcggaac aaatcgatga cgcaaaatcg ctgcaggtca 8040

tttaccaaaa gctgattgca gcgttcagtt cgctgtcaca attcatccca tcacagatta 8100

ccagttacac tgcttctgga cctacctctt ggagtagcta cttcttctct cctgcgagca 8160

cccctgtgtg gtctggcgat gcgtcatgga gtttgctcaa acagctgatc tctggcgatt 8220

tacctgacat gtttgacatg attcgtgcct atagaccacg gtcactcgac ccattcgacg 8280

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<212> PRT

<213> 柞蠶（Antheraea pernyi）

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Glu Phe Phe Leu Val Lys Val Val Gly Asp Leu Met Phe Lys Val

3155 3160 3165

Leu Leu Glu Asn Met Gly Met Ser Met Ser Leu Val Thr Ala Thr

3170 3175 3180

Pro Glu Met Lys Cys Gly Gly Asn Leu Ala His Val Val Gly Phe

3185 3190 3195

Asp Glu Ser Ser Val Leu Met Leu Gly Asn Met Lys Arg Thr Lys

3200 3205 3210

Glu Ser Glu Ala Leu Arg Ala Thr Leu Glu Leu Pro Ser Ser Ser

3215 3220 3225

Cys Ile Asp Phe Thr Gln Ala Val Asp Gly Leu Val Phe Ser Ser

3230 3235 3240

Thr Asn Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gln Arg Lys Gln Phe Leu

3245 3250 3255

Gln Thr Ala Ala Asn Ala Ile Thr Gln Lys Met Thr Lys Ala His

3260 3265 3270

Leu Val Gln Glu Cys Thr Cys Thr Tyr Val Asp Pro Phe Arg Val

3275 3280 3285

Arg Ser Ala Cys Phe Thr Arg Glu Lys Lys Glu Val Ala Arg Arg

3290 3295 3300

Arg Lys

3305

<210> 3

<211> 689

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開(kāi)始

<400> 3

Met Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala

1 5 10 15

Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr

20 25 30

Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile

35 40 45

Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser

50 55 60

Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro

65 70 75 80

Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg

85 90 95

Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu

100 105 110

Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro

115 120 125

Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser

130 135 140

Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser

145 150 155 160

Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile

165 170 175

Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile

180 185 190

Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser

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210 215 220

Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser

225 230 235 240

Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe

245 250 255

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260 265 270

Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu

275 280 285

Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile

290 295 300

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305 310 315 320

Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr

325 330 335

Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu

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Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro

420 425 430

Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile

435 440 445

Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His

450 455 460

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465 470 475 480

Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala

485 490 495

Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys

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545 550 555 560

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565 570 575

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645 650 655

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Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg

675 680 685

Arg

<210> 4

<211> 695

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開(kāi)始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (2)...(7)

<223> 人工增添組氨酸標(biāo)簽

<400> 4

Met His His His His His His Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly

1 5 10 15

Ser Pro Ser Asn Pro Ala Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser

20 25 30

Val Glu Gly Thr Val Thr Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val

35 40 45

Thr Ser Val Lys Leu Ile Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn

50 55 60

Cys Val His Glu Leu Ser Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp

65 70 75 80

Gly Lys Lys Tyr Gln Pro Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val Arg Phe

85 90 95

Gly Phe Gln Asp Gly Arg Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His Gly Asp

100 105 110

Asp Thr Arg Arg Ser Leu Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu

115 120 125

Gln Thr Glu Gln Lys Pro Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly Val Cys

130 135 140

Pro Thr Glu Val Ser Ser Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu Val His

145 150 155 160

Arg Thr Arg Asp Leu Ser Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly Lys Asn

165 170 175

Asp Ile Ile Thr Ser Ile Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met

180 185 190

Gln Val Leu Gln Ser Ile Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly

195 200 205

Val Pro Glu Lys Val Ser Ala Thr Glu Glu Tyr Leu Tyr Lys Pro Phe

210 215 220

Ser Val Gly Glu Asn Gly Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys Leu Thr

225 230 235 240

Leu Thr Gly Lys Ser Ser Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu

245 250 255

Ser Arg Ser Ile Ile Phe Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro Val Pro

260 265 270

Gly Asn Ala Asn Ser Ala Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala Lys Ser

275 280 285

Val Ser Ser Ile Val Glu Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu

290 295 300

Ile Arg Ile Leu Arg Ile Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr

305 310 315 320

Ser Gln Val Lys Gly Ser Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala

325 330 335

Leu Leu Arg Ala Gly Thr Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile

340 345 350

Leu Lys Ser Arg Glu Leu Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu

355 360 365

Ser Leu Gly Asn Ala Arg His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala

370 375 380

Ala Ser Leu Leu Asp Gln Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly

385 390 395 400

Val Gly Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys His Thr

405 410 415

Thr Lys Pro Val Gly Ile Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys

420 425 430

Leu Gln Asn Cys Arg Pro Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val

435 440 445

Ala Ile Leu Lys Gly Ile Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp Ser Leu

450 455 460

Ile Asn Lys Ile Val His Cys Ala Ala Asp Asn Asn Val Lys Ala Ser

465 470 475 480

Val Lys Ala Ala Ala Leu Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys Ser Ala

485 490 495

Ala Ile Lys Lys Thr Ala Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp

500 505 510

Ser Glu Ile Arg Ile Lys Ala Tyr Leu Ala Val Ile Gln Cys Pro Cys

515 520 525

Gly Gln Ser Ala Asn Glu Ile Lys Asn Leu Leu Asp Thr Glu Pro Val

530 535 540

His Gln Val Gly Asn Phe Ile Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Ile Arg Thr

545 550 555 560

Ser Ala Asn Pro Asp Lys Gln Leu Ala Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile

565 570 575

Arg Thr Pro Asn Lys Phe Asn Ser Asp Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr

580 585 590

Arg Glu Thr Ser Phe Asn Ile Asp Ala Leu Gly Ala Gly Gly Ser Val

595 600 605

Asp Gln Thr Val Ile Tyr Ser Gln Asp Ser Tyr Leu Pro Arg Glu Ala

610 615 620

Ser Val Asn Leu Thr Val Glu Leu Phe Gly His Ser Tyr Asn Val Leu

625 630 635 640

Glu Leu Gly Gly Arg Gln Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu His Phe

645 650 655

Leu Gly Pro Lys Gly Tyr Phe Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ala Leu Tyr

660 665 670

Asp Asp Leu Val Lys Arg Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg

675 680 685

Gly Phe Gly Arg Gly Arg Arg

690 695

<210> 5

<211> 695

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開(kāi)始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (690)...(695)

<223> 人工增添組氨酸標(biāo)簽

<400> 5

Met Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala

1 5 10 15

Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr

20 25 30

Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile

35 40 45

Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser

50 55 60

Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro

65 70 75 80

Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg

85 90 95

Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu

100 105 110

Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro

115 120 125

Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser

130 135 140

Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser

145 150 155 160

Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile

165 170 175

Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile

180 185 190

Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser

195 200 205

Ala Thr Glu Glu Tyr Leu Tyr Lys Pro Phe Ser Val Gly Glu Asn Gly

210 215 220

Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser

225 230 235 240

Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe

245 250 255

Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala

260 265 270

Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu

275 280 285

Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile

290 295 300

Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr Ser Gln Val Lys Gly Ser

305 310 315 320

Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr

325 330 335

Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu

340 345 350

Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg

355 360 365

His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln

370 375 380

Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly Val Gly Ala Leu Ala Gly

385 390 395 400

Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys His Thr Thr Lys Pro Val Gly Ile

405 410 415

Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro

420 425 430

Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile

435 440 445

Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His

450 455 460

Cys Ala Ala Asp Asn Asn Val Lys Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala Leu

465 470 475 480

Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala

485 490 495

Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys

500 505 510

Ala Tyr Leu Ala Val Ile Gln Cys Pro Cys Gly Gln Ser Ala Asn Glu

515 520 525

Ile Lys Asn Leu Leu Asp Thr Glu Pro Val His Gln Val Gly Asn Phe

530 535 540

Ile Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Ile Arg Thr Ser Ala Asn Pro Asp Lys

545 550 555 560

Gln Leu Ala Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile Arg Thr Pro Asn Lys Phe

565 570 575

Asn Ser Asp Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr Arg Glu Thr Ser Phe Asn

580 585 590

Ile Asp Ala Leu Gly Ala Gly Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Ile Tyr

595 600 605

Ser Gln Asp Ser Tyr Leu Pro Arg Glu Ala Ser Val Asn Leu Thr Val

610 615 620

Glu Leu Phe Gly His Ser Tyr Asn Val Leu Glu Leu Gly Gly Arg Gln

625 630 635 640

Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu His Phe Leu Gly Pro Lys Gly Tyr

645 650 655

Phe Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ala Leu Tyr Asp Asp Leu Val Lys Arg

660 665 670

Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg

675 680 685

Arg His His His His His His

690 695

<210> 6

<211> 702

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開(kāi)始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (2)...(7)

<223> 人工增添組氨酸標(biāo)簽

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (8)...(13)

<223> 人工增添凝血酶酶切位點(diǎn)

<400> 6

Met His His His His His His Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys Asp Lys

1 5 10 15

Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala Phe Val Gln

20 25 30

Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr Ile Phe Leu

35 40 45

Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile Gly Gln Val

50 55 60

Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser Val Gln Asn

65 70 75 80

Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro Pro Pro Gly

85 90 95

Ile Asp Lys Val Val Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg Val Gly Pro

100 105 110

Glu Ile Cys Ala His Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu Asn Ile Lys

115 120 125

Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro Ser Thr Gln

130 135 140

Val Asp Val Phe Gly Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser Ser Gln Glu

145 150 155 160

Gly Ser Ala Val Leu Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser Arg Cys Ser

165 170 175

His Arg Glu Gln Gly Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile Thr Asn Pro

180 185 190

Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile Leu Asn Val

195 200 205

Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser Ala Thr Glu

210 215 220

Glu Tyr Leu Tyr Lys Pro Phe Ser Val Gly Glu Asn Gly Ala Arg Ala

225 230 235 240

Lys Val His Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser Cys Gly Gln

245 250 255

Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe Asp Asn Pro

260 265 270

His Gly Val Lys Pro Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala Leu Ala Ala

275 280 285

Val Lys Asp Val Ala Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu Ser Lys Ser

290 295 300

Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile Thr Ser Lys

305 310 315 320

Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr Ser Gln Val Lys Gly Ser Asn Leu Glu

325 330 335

Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr Gly Asp Ser

340 345 350

Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu Gly Gln Leu

355 360 365

Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg His Val Asn

370 375 380

Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln Pro Asn Leu

385 390 395 400

Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly Val Gly Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Cys

405 410 415

Arg Glu His Glu Cys His Thr Thr Lys Pro Val Gly Ile Val Ala Leu

420 425 430

Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro Arg Ser Lys

435 440 445

Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile Arg Ser Ile

450 455 460

Arg His Leu Glu Asp Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His Cys Ala Ala

465 470 475 480

Asp Asn Asn Val Lys Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala Leu Glu Ala Phe

485 490 495

His Ala Asp Pro Cys Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala Ile Glu Ile

500 505 510

Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys Ala Tyr Leu

515 520 525

Ala Val Ile Gln Cys Pro Cys Gly Gln Ser Ala Asn Glu Ile Lys Asn

530 535 540

Leu Leu Asp Thr Glu Pro Val His Gln Val Gly Asn Phe Ile Ser Thr

545 550 555 560

Ser Leu Arg Tyr Ile Arg Thr Ser Ala Asn Pro Asp Lys Gln Leu Ala

565 570 575

Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile Arg Thr Pro Asn Lys Phe Asn Ser Asp

580 585 590

Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr Arg Glu Thr Ser Phe Asn Ile Asp Ala

595 600 605

Leu Gly Ala Gly Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Ile Tyr Ser Gln Asp

610 615 620

Ser Tyr Leu Pro Arg Glu Ala Ser Val Asn Leu Thr Val Glu Leu Phe

625 630 635 640

Gly His Ser Tyr Asn Val Leu Glu Leu Gly Gly Arg Gln Gly Asn Leu

645 650 655

Asp Arg Val Ile Glu His Phe Leu Gly Pro Lys Gly Tyr Phe Arg Thr

660 665 670

Ser Asp Pro Gln Ala Leu Tyr Asp Asp Leu Val Lys Arg Tyr Glu Glu

675 680 685

Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg Arg

690 695 700

2016-10-01