本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)提取技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種棉籽粕中提取棉籽蛋白的方法。
背景技術(shù)：
棉籽提取了油脂之后的棉籽粕中含有大量的蛋白質(zhì)，其含量約為 50% 左右，是一種極為豐富的植物性蛋白質(zhì)資源。棉籽蛋白的性質(zhì)與大豆蛋白類似，也是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、品質(zhì)優(yōu)良的蛋白質(zhì)食物或飼用蛋白源。
棉籽粕中的蛋白質(zhì)主要分為三種，2S 蛋白質(zhì)游離在細(xì)胞壁之外，占 15% 左右，剩下的85% 左右的 7S、12S 蛋白質(zhì)存在于細(xì)胞壁內(nèi)，由于棉籽蛋白的細(xì)胞壁十分堅(jiān)韌，采用類似于大豆粕提取大豆蛋白的堿溶酸沉工藝，棉籽蛋白的提取率不高。如果采用強(qiáng)堿、弱酸、高溫的辦法打破其細(xì)胞壁，由于反應(yīng)條件強(qiáng)烈，組成蛋白質(zhì)的氨基酸序列會(huì)被破壞，蛋白質(zhì)將失去其功能和活性。采用酶解工藝，通過生物作用打破細(xì)胞壁并水解蛋白質(zhì)，是一種較為理想的提取棉籽蛋白的方法，但是由于市售蛋白酶制劑價(jià)格較高，造成生產(chǎn)成本難以下降。
另外，棉鈴蟲屬鱗翅目夜蛾科， 廣泛分布在中國(guó)及世界各地，中國(guó)棉區(qū)和蔬菜種植區(qū)均有存在。棉鈴蟲是棉花蕾鈴期重要鉆蛀性害蟲，主要蛀食蕾、花、鈴，也取食嫩葉。棉鈴蟲腸道中含有降解棉籽蛋白的酶，可將棉籽中的大分子蛋白轉(zhuǎn)化為小分子的蛋白和氨基酸以利于自身的吸收。因棉鈴蟲病毒是一種昆蟲殺蟲劑，其防治效果好、藥效持久，對(duì)其他生物無任何毒副作用，是世界上第一個(gè)登記注冊(cè)的昆蟲病毒生物農(nóng)藥，所以棉鈴蟲的養(yǎng)殖問題受到國(guó)內(nèi)外研究人員廣泛關(guān)注，目前已經(jīng)解決棉鈴蟲群養(yǎng)技術(shù)難題，實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化飼養(yǎng)。
現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為CN102550794B的中國(guó)發(fā)明專利，公開了一種提取棉籽蛋白的方法，包括：(1) 將棉籽粕粉碎；(2)超聲波處理棉籽粕；(3)提取棉鈴蟲活性酶；(4)棉籽粕酶解；(5)升溫滅酶，然后離心分離，得到上清液和濾渣；(6)將濾渣再加水洗，水洗液與步驟(5)中得到的上清液合并；(7)將合并后的上清液經(jīng)微濾膜除雜、納濾膜濃縮、干燥后即得到粉狀棉籽蛋白。該方法使得棉籽蛋白的生產(chǎn)具有較高的提取率，而且產(chǎn)品具有較強(qiáng)的功能活性，同時(shí)解決了現(xiàn)有生物酶解工藝方案需高價(jià)購(gòu)買蛋白酶，造成生產(chǎn)成本偏高的問題。該方法酶解前只采用超聲波處理棉籽粕，對(duì)棉籽粕細(xì)胞壁的破壞不充分，使得棉籽蛋白的提取率不理想；在微濾之前沒有對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行純化分離，微濾速度慢，且容易堵塞濾孔。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種提取率高，提取的棉籽蛋白純度高、活性強(qiáng)、蛋白提取率高，無溶劑殘留的棉籽粕中提取棉籽蛋白的方法。
本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：
棉籽粕中提取棉籽蛋白的方法，具體步驟：
1）預(yù)處理：將棉籽粕粉碎，加入脫脂劑，脫脂劑為石油醚-丙酮混合液，石油醚：丙酮體積比為1:0.9~1:1.5，棉籽粕粉末：混合液體積比為1:12~16，回流提取，脫脂溫度為50~60℃，每次脫脂40~50min，重復(fù)1~3次。旋蒸濃縮干燥，得到脫脂棉籽粕粉末。棉籽粕中殘留的油脂在酶解過程中會(huì)被氧化，降低酶解液的品質(zhì)，還會(huì)與蛋白質(zhì)乳化，造成蛋白質(zhì)的損失，所以酶解前需要對(duì)棉籽粕進(jìn)行脫脂。上述脫脂劑對(duì)棉籽粕粉末的脫脂率高，脫脂劑用量少；
2）木質(zhì)素酶酶解：在脫脂棉籽粕粉末中加入蒸餾水、木質(zhì)素酶和助溶劑，固體：蒸餾水質(zhì)量體積比為1g：（40~60）mL，木質(zhì)素酶加入量為0.05~0.07%，酶解溫度為36~42℃，pH為3.3~4.0，酶解時(shí)間為10~14h。超聲波助溶，超聲波功率為380~420W，超聲波作用時(shí)間為30~40min，過濾。木質(zhì)素酶能將棉籽粕中的木質(zhì)素水解，使棉籽細(xì)胞失去支持而分散開來，增大棉籽細(xì)胞與溶劑的接觸面積；超聲波能使體系宏觀流動(dòng)加快并且顆粒固體之間的碰撞加快，能夠穿透棉籽細(xì)胞壁，讓蒸餾水以最快的速度進(jìn)入到棉籽細(xì)胞中；超聲波聯(lián)合木質(zhì)素酶酶解對(duì)棉籽細(xì)胞細(xì)胞壁的破壞徹底，棉籽細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)流出量大，從而使棉籽蛋白的提取率提高；
3）棉鈴蟲活性酶液制備：將棉鈴蟲洗凈、勻漿，加入蒸餾水，勻漿：蒸餾水體積比為1:8~13，溫度為56~60℃，pH為7.6~7.9。超聲波助溶，超聲波功率為240~280W，超聲時(shí)間為22~30min。離心取上清液即為棉鈴蟲活性酶液；
4）棉鈴蟲酶液酶解：在步驟2得到的濾液中加入步驟3得到的棉鈴蟲活性酶液，棉鈴蟲酶液：濾液體積比為1:400~420酶解溫度為56~60℃，pH為5.4~5.9，酶解時(shí)間為1.2~1.8h。酶解結(jié)束后滅酶，過濾。棉鈴蟲活性酶液能夠酶解棉籽蛋白，將大分子的棉籽蛋白水解成小分子，增大棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率；用棉鈴蟲活性酶液酶解后的棉籽蛋白會(huì)具有較強(qiáng)的功能活性，如抗氧化性、抑菌；
5）等電點(diǎn)沉淀：調(diào)節(jié)步驟4得到的濾液的pH為4.4~4.6，攪拌，靜置，離心，沉淀即為棉籽蛋白，在pH為4.4~4.6時(shí)，棉籽蛋白呈電中性，在水中的溶解度急劇下降，變?yōu)槌恋韽乃芤褐忻撾x出來；
6）濾膜除雜、濃縮：在步驟5得到的棉籽蛋白中加入蒸餾水，通過微濾膜裝置進(jìn)行除雜，濾過液在經(jīng)過納濾膜裝置進(jìn)行濃縮并去鹽，微濾膜裝置的工作條件為：壓力0.2~0.24Mpa，溫度為42~49℃，流量為86~92L/min，微濾膜過濾孔徑為0.8~1.0nm；納濾膜裝置的工作條件為：壓力1.6~1.9Mpa，溫度42~49℃，流量為18~20L/min，納濾膜孔徑為0.1~0.4nm。干燥得粉狀棉籽蛋白。最后得到的棉籽蛋白的分子量小，易被人體吸收，純度高，活性強(qiáng)，無溶劑殘留，綠色安全。
優(yōu)選的，助溶劑成份及其重量份為：12~16份單月桂酸丙二醇酯、0.002~0.004份柴胡皂苷、5~9份壬基酚聚氧乙烯醚、0.005~0.007份煙酸和8~13份大豆卵磷脂，加入量為0.00003~0.00007%。上述助溶劑既能將棉籽蛋白的疏水段包裹起來，減少蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，又能增強(qiáng)蛋白質(zhì)-水之間的離子相互作用，增加棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：采用石油醚-丙酮混合液對(duì)棉籽粕粉末進(jìn)行脫脂，脫脂率高，脫脂劑用量少；超聲波聯(lián)合木質(zhì)素酶酶解對(duì)棉籽細(xì)胞細(xì)胞壁的破壞徹底，棉籽細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)流出量大，從而使棉籽蛋白的提取率提高；棉鈴蟲活性酶液能夠酶解棉籽蛋白，將大分子的棉籽蛋白水解成小分子，增大棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率；用棉鈴蟲活性酶液酶解后的棉籽蛋白會(huì)具有較強(qiáng)的功能活性，如抗氧化性、抑菌；最后得到的棉籽蛋白的分子量小，易被人體吸收，純度高，活性強(qiáng)，無溶劑殘留，綠色安全。
具體實(shí)施例
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案作進(jìn)一步說明：
實(shí)施例1：
棉籽粕中提取棉籽蛋白的方法，具體步驟：
1）預(yù)處理：將棉籽粕粉碎，加入脫脂劑，脫脂劑為石油醚-丙酮混合液，石油醚：丙酮體積比為1:0.9~1:1.5，棉籽粕粉末：混合液體積比為1:12~16，回流提取，脫脂溫度為50~60℃，每次脫脂40~50min，重復(fù)1~3次。旋蒸濃縮干燥，得到脫脂棉籽粕粉末。棉籽粕中殘留的油脂在酶解過程中會(huì)被氧化，降低酶解液的品質(zhì)，還會(huì)與蛋白質(zhì)乳化，造成蛋白質(zhì)的損失，所以酶解前需要對(duì)棉籽粕進(jìn)行脫脂。上述脫脂劑對(duì)棉籽粕粉末的脫脂率高，脫脂劑用量少；
2）木質(zhì)素酶酶解：在脫脂棉籽粕粉末中加入蒸餾水、木質(zhì)素酶和助溶劑，固體：蒸餾水質(zhì)量體積比為1g：（40~60）mL，木質(zhì)素酶加入量為0.05~0.07%，酶解溫度為36~42℃，pH為3.3~4.0，酶解時(shí)間為10~14h。超聲波助溶，超聲波功率為380~420W，超聲波作用時(shí)間為30~40min，過濾。木質(zhì)素酶能將棉籽粕中的木質(zhì)素水解，使棉籽細(xì)胞失去支持而分散開來，增大棉籽細(xì)胞與溶劑的接觸面積；超聲波能使體系宏觀流動(dòng)加快并且顆粒固體之間的碰撞加快，能夠穿透棉籽細(xì)胞壁，讓蒸餾水以最快的速度進(jìn)入到棉籽細(xì)胞中；超聲波聯(lián)合木質(zhì)素酶酶解對(duì)棉籽細(xì)胞細(xì)胞壁的破壞徹底，棉籽細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)流出量大，從而使棉籽蛋白的提取率提高；
3）棉鈴蟲活性酶液制備：將棉鈴蟲洗凈、勻漿，加入蒸餾水，勻漿：蒸餾水體積比為1:8~13，溫度為56~60℃，pH為7.6~7.9。超聲波助溶，超聲波功率為240~280W，超聲時(shí)間為22~30min。離心取上清液即為棉鈴蟲活性酶液；
4）棉鈴蟲酶液酶解：在步驟2得到的濾液中加入步驟3得到的棉鈴蟲活性酶液，棉鈴蟲酶液：濾液體積比為1:400~420酶解溫度為56~60℃，pH為5.4~5.9，酶解時(shí)間為1.2~1.8h。酶解結(jié)束后滅酶，過濾。棉鈴蟲活性酶液能夠酶解棉籽蛋白，將大分子的棉籽蛋白水解成小分子，增大棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率；用棉鈴蟲活性酶液酶解后的棉籽蛋白會(huì)具有較強(qiáng)的功能活性，如抗氧化性、抑菌；
5）等電點(diǎn)沉淀：調(diào)節(jié)步驟4得到的濾液的pH為4.4~4.6，攪拌，靜置，離心，沉淀即為棉籽蛋白，在pH為4.4~4.6時(shí)，棉籽蛋白呈電中性，在水中的溶解度急劇下降，變?yōu)槌恋韽乃芤褐忻撾x出來；
6）濾膜除雜、濃縮：在步驟5得到的棉籽蛋白中加入蒸餾水，通過微濾膜裝置進(jìn)行除雜，濾過液在經(jīng)過納濾膜裝置進(jìn)行濃縮并去鹽，微濾膜裝置的工作條件為：壓力0.2~0.24Mpa，溫度為42~49℃，流量為86~92L/min，微濾膜過濾孔徑為0.8~1.0nm；納濾膜裝置的工作條件為：壓力1.6~1.9Mpa，溫度42~49℃，流量為18~20L/min，納濾膜孔徑為0.1~0.4nm。干燥得粉狀棉籽蛋白。最后得到的棉籽蛋白的分子量小，易被人體吸收，純度高，活性強(qiáng)，無溶劑殘留，綠色安全。
助溶劑成份及其重量份為：12~16份單月桂酸丙二醇酯、0.002~0.004份柴胡皂苷、5~9份壬基酚聚氧乙烯醚、0.005~0.007份煙酸和8~13份大豆卵磷脂，加入量為0.00003~0.00007%。上述助溶劑既能將棉籽蛋白的疏水段包裹起來，減少蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，可能是疊加產(chǎn)生了意想不到的有益成分或協(xié)同交互作用，柴胡皂苷和煙酸通過單月桂酸丙二醇酯、壬基酚聚氧乙烯醚又能增強(qiáng)蛋白質(zhì)-水之間的離子相互作用，增加棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率。
實(shí)施例2：
棉籽粕中提取棉籽蛋白的方法，最優(yōu)選步驟：
1）預(yù)處理：將10kg棉籽粕粉碎，加入脫脂劑，脫脂劑為石油醚-丙酮混合液，石油醚：丙酮體積比為1:1.5，棉籽粕粉末：混合液體積比為1:12，回流提取，脫脂溫度為54℃，每次脫脂45min，重復(fù)2次。旋蒸濃縮干燥，得到脫脂棉籽粕粉末。棉籽粕中殘留的油脂在酶解過程中會(huì)被氧化，降低酶解液的品質(zhì)，還會(huì)與蛋白質(zhì)乳化，造成蛋白質(zhì)的損失，所以酶解前需要對(duì)棉籽粕進(jìn)行脫脂。上述脫脂劑對(duì)棉籽粕粉末的脫脂率高，脫脂劑用量少；
2）木質(zhì)素酶酶解：在脫脂棉籽粕粉末中加入蒸餾水、木質(zhì)素酶和助溶劑，固體：蒸餾水質(zhì)量體積比為1g：52mL，木質(zhì)素酶加入量為0.06%，酶解溫度為39℃，pH為3.7，酶解時(shí)間為13h。超聲波助溶，超聲波功率為400W，超聲波作用時(shí)間為30min，過濾。助溶劑成份及其最優(yōu)選重量份為：14份單月桂酸丙二醇酯、0.003份柴胡皂苷、8份壬基酚聚氧乙烯醚、0.006份煙酸和10份大豆卵磷脂，加入量為0.00005%。上述助溶劑既能將棉籽蛋白的疏水段包裹起來，減少蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，又能增強(qiáng)蛋白質(zhì)-水之間的離子相互作用，增加棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率。木質(zhì)素酶能將棉籽粕中的木質(zhì)素水解，使棉籽細(xì)胞失去支持而分散開來，增大棉籽細(xì)胞與溶劑的接觸面積；超聲波能使體系宏觀流動(dòng)加快并且顆粒固體之間的碰撞加快，能夠穿透棉籽細(xì)胞壁，讓蒸餾水以最快的速度進(jìn)入到棉籽細(xì)胞中；超聲波聯(lián)合木質(zhì)素酶酶解對(duì)棉籽細(xì)胞細(xì)胞壁的破壞徹底，棉籽細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)流出量大，從而使棉籽蛋白的提取率提高；
3）棉鈴蟲活性酶液制備：將棉鈴蟲洗凈、勻漿，加入蒸餾水，勻漿：蒸餾水體積比為1:11，溫度為58℃，pH為7.8。超聲波助溶，超聲波功率為260W，超聲時(shí)間為28min。離心取上清液即為棉鈴蟲活性酶液；
4）棉鈴蟲酶液酶解：在步驟2得到的濾液中加入步驟3得到的棉鈴蟲活性酶液，棉鈴蟲酶液：濾液體積比為1:420酶解溫度為58℃，pH為5.6，酶解時(shí)間為1.7h。酶解結(jié)束后沸水浴7min滅酶，過濾。棉鈴蟲活性酶液能夠酶解棉籽蛋白，將大分子的棉籽蛋白水解成小分子，增大棉籽蛋白在水中的溶解度，提高棉籽蛋白的提取率；用棉鈴蟲活性酶液酶解后的棉籽蛋白會(huì)具有較強(qiáng)的功能活性，如抗氧化性、抑菌；
5）等電點(diǎn)沉淀：調(diào)節(jié)步驟4得到的濾液的pH為4.5，攪拌，靜置，離心，沉淀即為棉籽蛋白，在pH為4.5時(shí)，棉籽蛋白呈電中性，在水中的溶解度急劇下降，變?yōu)槌恋韽乃芤褐忻撾x出來；
6）濾膜除雜、濃縮：在步驟5得到的棉籽蛋白中加入蒸餾水，通過微濾膜裝置進(jìn)行除雜，濾過液在經(jīng)過納濾膜裝置進(jìn)行濃縮并去鹽，微濾膜裝置的工作條件為：壓力0.22Mpa，溫度為45℃，流量為89L/min，微濾膜過濾孔徑為0.9nm；納濾膜裝置的工作條件為：壓力1.8Mpa，溫度45℃，流量為19L/min，納濾膜孔徑為0.2nm。干燥得粉狀棉籽蛋白。最后得到的棉籽蛋白的分子量小，易被人體吸收，純度高，活性強(qiáng)，無溶劑殘留，綠色安全。
本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。
以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。