本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及一種病毒RNA的提取試劑盒和提取方法。
背景技術(shù)：
：核酸提取是核酸檢測整個技術(shù)流程的第一步，也是分子生物學(xué)中最關(guān)鍵的方法之一。它是下游核酸檢測和科學(xué)研究的基礎(chǔ)，抽提的核酸的質(zhì)量及其完整性會直接影響臨床研究或診斷的結(jié)果。一般的核酸提取過程包括兩大步驟：樣品的裂解和純化。裂解指使樣品中的核酸釋放到反應(yīng)體系中，純化則是指使核酸與反應(yīng)體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽類以及其他雜質(zhì)徹底地分離。常用的RNA的提取方法有TRIZOL法、異硫氰酸胍法、CTAB-LiCl法及國內(nèi)外各生物公司的總RNA提取試劑盒等。RNA提取的經(jīng)典方法是TRIZOL法，它是一種基于異硫氰酸肌/苯酚/氯仿抽提原理的方法，該法適用范圍廣，動植物都適用，提取的RNA基本無基因組DNA的污染，但是該法操作步驟繁瑣，提取試劑中使用了苯酚、氯仿等有毒試劑，而且該法不適用于富含多糖多酚材料RNA的提取。CTAB-LiCl法常被用來提取植物組織RNA，但是由于CTAB本身是一個與SDS功能相類似的試劑，盡管它可和RNA以及DNA形成不溶的復(fù)合物，但CTAB法通常要結(jié)合其它操作，如再經(jīng)LiCl沉淀等步驟，使得該法操作繁瑣，并且在抽提時使用有毒試劑氯仿。傳統(tǒng)的提取試劑,由于提取得率相對較低，且步驟較為繁雜，給提取工作帶來一定影響，因此難以得到合格的RNA樣品。磁珠法是近幾年才發(fā)展起來的核酸提取方法。磁珠的直徑為幾十納米至數(shù)微米，在磁場下表現(xiàn)出磁性，由無機(jī)/有機(jī)或者無機(jī)/無機(jī)材料組成的外形呈現(xiàn)為球狀的復(fù)合粒子。磁珠法提取核酸不需要苯酚和氯仿等毒性大的有機(jī)溶劑，提取的核酸純度高、產(chǎn)量大。專利號為201010281633.6、201510023368.4等公開了提取病毒DNA或RNA的方法，但這些方法都是基于Chaotropic鹽（鹽酸胍、異硫氰酸胍、高氯酸鈉等）下裂解和吸附DNA或RNA，接著用一定比例的乙醇進(jìn)行洗滌，最后再將核酸釋放到洗脫液中。其中Chaotropic鹽是一種破壞分子力（氫鍵）穩(wěn)定性的一種鹽，它可使疏水性的蛋白質(zhì)更易溶于水，不能在低鹽干擾分子間的由非共價(jià)鍵（力）形成的相互作用，在Chaotropic鹽中磁珠吸附核酸的能力會有所增強(qiáng)，目前國內(nèi)已公開的專利中提取RNA基本上都是在此基礎(chǔ)上衍生出來的?，F(xiàn)有技術(shù)很少有不基于Chaotropic鹽的提取RNA的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種病毒RNA的提取試劑盒。本發(fā)明的第二個目的是提供一種利用上述RNA提取試劑盒對病毒RNA進(jìn)行核酸提取的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：一種病毒RNA的提取試劑盒，包括裂解結(jié)合液A、洗滌液B、洗脫液C和消解液D，所述裂解結(jié)合液A含有20～50mM蔗糖，20～50mM硫酸銨，10～50mMTris-HCl，1～5%（V/V）Brij-58，0.2～0.5mg/mL磁珠；pH值為4.5～5.5，所述洗滌液B含有1～5%（V/V）Brij-58，5～25mMTris-HCl，0.5～1mg/mL蛋白酶K，pH值為6～7。本發(fā)明試劑盒的工作原理：在消解液D的作用下，病毒的外殼被破壞掉，病毒核酸RNA被釋放出來，同時在裂解結(jié)合液A的作用下，使RNA可以結(jié)合到磁珠上，然后再通過洗滌液B對磁珠上的RNA進(jìn)行清洗，去除多余的鹽分及蛋白分子，最后通過洗脫液C使磁珠上的RNA洗脫下來。這里裂解結(jié)合液A的pH值保證在4.5～5.5，可保證RNA不被溶解，同時低PH值的環(huán)境利于磁珠吸附核酸，可以使核酸最大程度地結(jié)合在磁珠上面。優(yōu)選地，所述洗脫液C含有10～20mMTris-HCl，0.5mMEDTA，pH值為8.5。優(yōu)選地，所述消解液D含有20mg/mL蛋白酶K。優(yōu)選地，所述磁珠的粒徑為0.5～1μm。本發(fā)明還提供一種利用所述試劑盒進(jìn)行核酸提取的方法，包括以下步驟：S1.取樣本，加入消解液D和裂解結(jié)合液A，混勻離心后，吸棄上清液；S2.加入洗滌液B，混勻10min離心后，再次吸棄上清液；S3.加入洗滌液B，混勻1min離心后，再次吸棄上清液；S4.加入洗脫液C，溫浴一段時間，溫浴期間震蕩混勻，離心后，吸取上清液至新的離心管即得核酸。優(yōu)選地，S1所述樣本和裂解結(jié)合液A的混合體積比為1：3。優(yōu)選地，S4所述溫浴的條件為56～75℃，洗脫液C的加入體積為50～100μL。優(yōu)選地，S2和S3所述洗滌液B的加入體積為300～600μL。作為一種具體的實(shí)施方案，本發(fā)明所述進(jìn)行核酸提取的方法包括以下步驟：S1.將200μL新鮮血漿或血清樣本加入到1.5ml離心管內(nèi)，向離心管內(nèi)加入20μ1消解液D和600μ1裂解結(jié)合液A，室溫混勻15分鐘，再將離心管置于磁力架上，磁力分離1min，吸棄上清；S2.向離心管中加入500μ1洗滌液B，室溫混勻10分鐘，再將離心管置于磁力架上，磁力分離1min，吸棄上清；S3.向離心管中加入500μ1洗滌液B，室溫混勻1分鐘，再將離心管置于磁力架上，磁力分離1min，吸棄上清；S4.向離心管中加入100μ1洗脫液C，溫浴6分鐘（期間需不停震蕩混勻），瞬時離心后再將離心管置于磁力架上，磁力分離1min，吸取上清至新的離心管中即可。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明提供了一種病毒RNA的提取試劑盒，包括裂解結(jié)合液A、洗滌液B、洗脫液C和消解液D，所述裂解結(jié)合液A含有20～50mM蔗糖，20～50mM硫酸銨，10～50mMTris-HCl，1～5%（V/V）Brij-58，0.2～0.5mg/mL磁珠；pH值為4.5～5.5，所述洗滌液B含有1～5%（V/V）Brij-58，5～25mMTris-HCl，0.5～1mg/mL蛋白酶K，pH值為6～7；利用該試劑盒進(jìn)行RNA的提取，該方法不依賴傳統(tǒng)的Chaotropic鹽，在低鹽離子環(huán)境下即可裂解、吸附和洗滌RNA，同時洗滌液中不含醇類物質(zhì)（乙醇）即可去除相關(guān)的鹽分和雜質(zhì)。本發(fā)明的方法簡單可行，成本低廉且不含任何污染環(huán)境的成分。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域常規(guī)條件或按照制造廠商建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的意義相同。實(shí)施例1一種病毒RNA的提取試劑盒，包括裂解結(jié)合液A、洗滌液B、洗脫液C、消解液D（這里指20mg/mL蛋白酶K）。裂解結(jié)合液A組成為：20mM蔗糖，50mM硫酸銨，10mMTris-HCl（pH4.0），1%（V/V）Brij-58，0.5mg/ml磁珠，溶劑為高壓滅菌水，裂解結(jié)合液A的終pH為4.5。洗滌液B的組成為：1%（V/V）Brij-58，5mMTris-HCl（pH6.6），1mg/ml蛋白酶K，溶劑為高壓滅菌水，洗滌液B的終pH為6.6。洗脫液C的組成為：10mMTris-HCl，0.5mMEDTA水溶液，洗脫液C的終pH為8.5。采用上述試劑盒提取HIV-1血漿或血清樣本RNA，包括以下步驟：（1）將200μL新鮮HIV-1血漿或血清樣本加入到1.5ml離心管內(nèi)，向離心管內(nèi)加入20μL消解液D和600μL裂解結(jié)合液A，室溫混勻15分鐘，再將離心管置于磁力架上，磁力分離1min，吸棄上清；（2）向離心管中加入500μL洗滌液B，室溫混勻10分鐘，再將離心管置于磁力架上，磁力分離1min，吸棄上清；（3）向離心管中加入500μL洗滌液B，室溫混勻1分鐘，再將離心管置于磁力架上，磁力分離1min，吸棄上清；（4）向離心管中加入100μ1洗脫液C，溫浴6分鐘（期間需不停震蕩混勻），瞬時離心后再將離心管置于磁力架上，磁力分離1min，吸取上清至新的離心管中。對照試劑選用QIAampViralRNAMiniKit提取的樣本量為200μl，洗脫體積為100μl。提取完成后，取上述核酸RNA提取液20μl作為模板，應(yīng)用達(dá)安基因的人類免疫缺陷綜合征病毒1型核酸檢測試劑盒（PCR熒光探針法）進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見下表1。表1不同樣本CT值比較樣本編號本發(fā)明檢測結(jié)果（CT值）Qiagen試劑檢測結(jié)果（CT值）124.2124.35235.9835.32330.4731.05427.1227.31532.3432.67636.21.36.01結(jié)果表明，利用本發(fā)明實(shí)施例1所述試劑盒提取核酸的效率與現(xiàn)有的核酸提取試劑的提取效率處于同一水平，因此，本發(fā)明在HIV-1RNA核酸提取應(yīng)用方面具有明顯優(yōu)勢。實(shí)施例2一種病毒RNA的提取試劑盒，包括裂解結(jié)合液A、洗滌液B、洗脫液C、消解液D（這里指20mg/mL蛋白酶K）。裂解結(jié)合液A組成為：30mM蔗糖，30mM硫酸銨，30mMTris-HCl（pH4.0），3%（V/V）Brij-58，0.4mg/ml磁珠，溶劑為高壓滅菌水，裂解結(jié)合液A的終pH為5.0。洗滌液B的組成為：3%（V/V）Brij-58，18mMTris-HCl（pH6.6），0.8mg/ml蛋白酶K，溶劑為高壓滅菌水，洗滌液B的終pH為6.0。洗脫液C的組成為：15mMTris-HCl，0.5mMEDTA水溶液，洗脫液C的終pH為8.5。實(shí)施例3一種病毒RNA的提取試劑盒，包括裂解結(jié)合液A、洗滌液B、洗脫液C、消解液D（這里指20mg/mL蛋白酶K）。裂解結(jié)合液A組成為：50mM蔗糖，20mM硫酸銨，50mMTris-HCl（pH4.0），5%（V/V）Brij-58，0.5mg/ml磁珠，溶劑為高壓滅菌水，裂解結(jié)合液A的終pH為5.5。洗滌液B的組成為：5%（V/V）Brij-58，25mMTris-HCl（pH6.6），0.5mg/ml蛋白酶K，溶劑為高壓滅菌水，洗滌液B的終pH為7.0。洗脫液C的組成為：20mMTris-HCl，0.5mMEDTA水溶液，洗脫液C的終pH為8.5。對比例1該對比例所用的RNA試劑盒同實(shí)施例一所述RNA試劑盒，唯一不同的是，裂解結(jié)合液A的pH值為7.0，利用實(shí)施例1所述方法進(jìn)行檢測，其結(jié)果表現(xiàn)為：對比例1的結(jié)果明顯差于實(shí)施例1，低濃度樣本無檢測結(jié)果。檢測結(jié)果如表2。表2不同樣本CT值比較樣本編號實(shí)施例1結(jié)果（CT值）對比例1檢測結(jié)果（CT值）124.5828.98235.12-330.0638.05427.3232.14532.5438.37636.83-對比例2該對比例所用的RNA試劑盒同實(shí)施例一所述RNA試劑盒，唯一不同的是，裂解液中Brij-58的濃度為（V/V）10%，利用實(shí)施例1所述方法進(jìn)行檢測，其結(jié)果表現(xiàn)為：對比例2的結(jié)果明顯差于實(shí)施例1，證明提取效率沒有達(dá)到最優(yōu)。檢測結(jié)果如表3。表3不同樣本CT值比較樣本編號實(shí)施例1結(jié)果（CT值）對比例2檢測結(jié)果（CT值）124.5827.17235.1238.72330.0632.15427.3229.52532.5434.37636.8338.85當(dāng)前第1頁1 2 3