本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適配體篩選用多腔室微流控PCR芯片及擴(kuò)增方法。

背景技術(shù)：

適配體具有與抗體相類(lèi)似的性質(zhì)，但是在許多方面還體現(xiàn)出了優(yōu)于抗體的特點(diǎn)：(1)特異性更強(qiáng)；(2)更容易獲得；(3)可以針對(duì)不同種類(lèi)的目標(biāo)靶分子進(jìn)行篩選，拓寬應(yīng)用范圍；(4)無(wú)免疫原性，可在體內(nèi)反復(fù)使用；(5)穩(wěn)定性?xún)?yōu)于抗體，利于儲(chǔ)存。正是基于適配體的各種優(yōu)點(diǎn)，適配體在分析、臨床、環(huán)境、分子識(shí)別及藥物篩選等方面都顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。因此，適配體篩選技術(shù)的進(jìn)步直接影響了適配體的有效獲取和應(yīng)用。

在適配體篩選過(guò)程中，PCR擴(kuò)增技術(shù)作為一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)尤為重要，通過(guò)PCR技術(shù)可以成千上萬(wàn)倍的擴(kuò)大篩選后的文庫(kù)的庫(kù)容量，保證下一輪篩選的順利進(jìn)行，因此，對(duì)適配體篩選中PCR擴(kuò)增方法的研究具有重要的意義。目前，適配體篩選中的PCR擴(kuò)增方法依然采用固定輪數(shù)擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果沒(méi)有定量的監(jiān)控，這就導(dǎo)致了經(jīng)分離后的次級(jí)文庫(kù)的庫(kù)容量、文庫(kù)的質(zhì)量均不相同。近幾年一些科學(xué)工作者開(kāi)始重視擴(kuò)增輪數(shù)的優(yōu)化問(wèn)題，但采用的是離線(xiàn)的擴(kuò)增條件優(yōu)化方法，其方法瑣碎、復(fù)雜，不利于加速篩選流程。發(fā)展一種更加簡(jiǎn)單、快速的微流控PCR芯片擴(kuò)增方法十分重要。實(shí)時(shí)快速觀察PCR擴(kuò)增的最優(yōu)條件，控制擴(kuò)增產(chǎn)物的庫(kù)容量，保證次級(jí)文庫(kù)的優(yōu)質(zhì)性、一致性對(duì)于適配體篩選的成功具有重要影響。本發(fā)明方法優(yōu)化了PCR擴(kuò)增優(yōu)化過(guò)程使得整個(gè)適配體篩選過(guò)程更加簡(jiǎn)單化、快速化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種適配體篩選用多腔室微流控PCR芯片及擴(kuò)增方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種適配體篩選用多腔室微流控PCR芯片，該多腔室微流控PCR芯片包括微流PCR反應(yīng)片、溫度循環(huán)加熱板、玻璃基底、芯片夾具，所述PDMS反應(yīng)片上設(shè)有反應(yīng)液注入孔、Z型混合單元、流入微流通道、PCR反應(yīng)池、流出微流通道、反應(yīng)液流出孔，所述反應(yīng)液注入孔、Z型混合單元、流入微流通道、PCR擴(kuò)增室、流出微流通道、反應(yīng)液流出孔依次聯(lián)通。

作為優(yōu)選，所述微流PCR反應(yīng)片置于玻璃基底上，所述玻璃基底置于溫度循環(huán)加熱板上。

作為優(yōu)選，所述芯片夾具通過(guò)固定螺絲與溫度循環(huán)加熱板連接。

作為優(yōu)選，所述PCR反應(yīng)池的數(shù)量為2～16個(gè)。

上述適配體篩選用多腔室微流控PCR芯片的制造方法，包括如下步驟：

(1)利用打印機(jī)打印微流控PCR芯片的基體；

(2)微流控PCR芯片的基體通過(guò)紫外曝光后將圖形轉(zhuǎn)移至涂有感光膠的鎘板上通過(guò)濕法刻蝕制備微流控通道模板；

(3)將PDMS前聚體與固化劑按照質(zhì)量比為5：1～20：1的比例混合均勻后，將其放入真空干燥器中，除氣泡，再澆到微流控通道模板上，經(jīng)固化后得到2～6mm厚的PDMS微流控通道；

(4)用4～10mm打孔器在微流控通道模板上打孔，得到擴(kuò)增反應(yīng)腔室，再用等離子處理，得到微流PCR反應(yīng)片；

(5)將玻璃片緊密貼合在微流控通道模板上，得到微流控PCR芯片。

利用多腔室微流控PCR芯片適篩選配體的方法，包括如下步驟：

(1)多腔室微流控PCR芯片準(zhǔn)備：向多腔室微流控PCR芯片通入5～20mg/mL BSA和0.01～0.5mM隨機(jī)序列短鏈ssDNA，在25～40℃條件下封閉1～3h，之后用500μL 1×PBST溶液清洗通道，最后用高純氮?dú)獯蹈蓚溆茫?/p>

(2)擴(kuò)增樣品制備：將適配體篩選產(chǎn)物75μL與300μL2×SYBR Premix Ex Taq^TM酶，12μL、20μM TAMRA標(biāo)記的前向引物和12μL、20μM生物素化的后向引物及216μL超純水混合通過(guò)注射泵經(jīng)芯片在在微流控通道內(nèi)的Z型混合單元中混合后平均分配至2～16個(gè)PCR反應(yīng)池，最后每個(gè)反應(yīng)腔室中加入10～100μL的礦物油防止溶劑揮發(fā)；

(3)PCR擴(kuò)增過(guò)程：將步驟(2)制備好的芯片放置于溫度循環(huán)平板加熱板上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增程序設(shè)置如下：95℃30s～150s，10～30輪循環(huán)：95℃30s，60.5℃30s，72℃30s，使用小型熒光探頭直接置于反應(yīng)腔室上方5～25mm采集反應(yīng)腔室中的熒光信號(hào)。

適配體篩選后保留少量的核酸文庫(kù)，需要使用PCR擴(kuò)增進(jìn)行成千上萬(wàn)倍的核酸文庫(kù)以便于下一輪的篩選所用，Z型混合單元可提高篩選文庫(kù)與PCR酶的在線(xiàn)混合，減少體外的人工操作，減少污染可能性，2-6個(gè)PCR腔室可提高PCR擴(kuò)增后核酸序列的總量。

有益效果：

本發(fā)明公開(kāi)一種適配體篩選用多腔室微流控PCR芯片及其制造方法與應(yīng)用，該微流控PCR芯片采用多個(gè)反應(yīng)腔室，可保證次級(jí)文庫(kù)的高質(zhì)、足量獲取及核酸種類(lèi)多樣性；該微流控PCR芯片通過(guò)熒光實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線(xiàn)可以快速獲取最優(yōu)擴(kuò)增條件，將適配體篩選的核酸序列進(jìn)行最優(yōu)條件下擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)達(dá)到熒光最高值之后曲線(xiàn)的變化可以來(lái)驗(yàn)證篩選文庫(kù)篩選過(guò)程中多樣性的變化。本發(fā)明方法可簡(jiǎn)單、快速的實(shí)時(shí)獲取適配體篩選中次級(jí)文庫(kù)擴(kuò)增最優(yōu)條件及文庫(kù)多樣性改變。本發(fā)明的微流控PCR芯片方法可以廣范用于各類(lèi)靶標(biāo)適配體篩選的PCR擴(kuò)增步驟，為其他適配體篩選工作者提供了很好的思路設(shè)計(jì)和參考。

附圖說(shuō)明

圖1多腔室微流控PCR芯片整體示意圖。

圖2多腔室微流控PCR芯片擴(kuò)增曲線(xiàn)圖(a)；PCR擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)物凝膠電泳圖(b)。

圖3多腔室微流控PCR芯片文庫(kù)多樣性監(jiān)控圖。

圖4多腔室微流控PCR芯片俯視圖。

圖5多腔室微流控PCR芯片側(cè)視圖。

圖6微流控PCR芯片PDMS流路的細(xì)節(jié)圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

圖4～5中，1溫度循環(huán)加熱板、2微流控PCR芯片玻璃基底、3微流控PCR芯片PDMS流路、4PMMA材質(zhì)的芯片夾具、5夾具固定螺絲，6反應(yīng)液注入孔、7Z型混合通道、8流入微流通道、9PCR反應(yīng)池、10流出微流通道、11反應(yīng)液流出孔。

實(shí)施例1：微流控PCR芯片的制備

使用Adobe Illustrator設(shè)計(jì)具有Z型混合單元及4個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)池的圖形，高精密打印后通過(guò)紫外曝光后將圖形轉(zhuǎn)移至隔板上通過(guò)濕法刻蝕制備出芯片模板，將PDMS前聚體與固化劑按照質(zhì)量比為10：1的比例混合均勻后將其放入真空干燥器中，連接循環(huán)水真空泵進(jìn)行抽真空30min除氣泡。后將其澆到微流控通道模板上，經(jīng)固化后得到4mm厚的PDMS微流控通道，將PCR反應(yīng)池用8mm打孔器進(jìn)行打孔得到擴(kuò)增反應(yīng)池，等離子處理后，將微流控PCR芯片和薄玻璃片(厚度：0.13-0.17mm)緊密貼合后得到微流控PCR芯片；

實(shí)施例2：實(shí)時(shí)熒光微流控PCR芯片擴(kuò)增

實(shí)時(shí)熒光微流控PCR芯片擴(kuò)增的具體步驟，包括芯片制備、微流控PCR芯片準(zhǔn)備、擴(kuò)增樣品制備、PCR擴(kuò)增過(guò)程，具體如下：

(1)芯片制備：使用Adobe Illustrator設(shè)計(jì)具有Z型混合單元及4個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)池的圖形，高精密打印后通過(guò)紫外曝光后將圖形轉(zhuǎn)移至隔板上通過(guò)濕法刻蝕制備出芯片模板，將PDMS前聚體與固化劑按照質(zhì)量比為10：1的比例混合均勻后將其放入真空干燥器中，連接循環(huán)水真空泵進(jìn)行抽真空30min除氣泡。后將其澆到微流控通道模板上，經(jīng)固化后得到4mm厚的PDMS微流控通道，將PCR反應(yīng)池用8mm打孔器進(jìn)行打孔得到擴(kuò)增反應(yīng)池，等離子處理后，將微流控PCR芯片和薄玻璃片(厚度：0.13-0.17mm)緊密貼合后得到微流控PCR芯片；

(2)微流控PCR芯片準(zhǔn)備：將微流控PCR芯片通入10mg/mL BSA和0.1mM隨機(jī)序列短鏈ssDNA(20nt)在37℃條件下封閉1h，之后用500μL 1×PBST溶液清洗通道后高純氮?dú)獯蹈珊髠溆?；?/p>

(3)擴(kuò)增樣品制備：將適配體篩選的產(chǎn)物75μL與300μL 2×SYBR Premix Ex Taq^TM酶，12μL、20μM TAMRA標(biāo)記的前向引物和12μL、20μM生物素化的后向引物及216μL超純水混合通過(guò)注射泵經(jīng)芯片在線(xiàn)混合后平均分配至4個(gè)PCR擴(kuò)增池，最后每個(gè)反應(yīng)池中加入50μL的礦物油防止PCR過(guò)程中溶劑揮發(fā)；

(4)PCR擴(kuò)增過(guò)程：將步驟(2)制備好的芯片放置于溫度循環(huán)平板加熱板上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增程序設(shè)置如下：95℃30s,10～30輪溫度循環(huán)：95℃30s，60.5℃30s，72℃30s。

圖2(a)多腔室微流控PCR芯片擴(kuò)增曲線(xiàn)圖。

實(shí)施例3：適配體篩選產(chǎn)物實(shí)時(shí)熒光PCR

適配體篩選產(chǎn)物實(shí)時(shí)熒光PCR的具體步驟，包括芯片制備、微流控PCR芯片準(zhǔn)備、擴(kuò)增樣品制備、PCR擴(kuò)增過(guò)程及擴(kuò)增曲線(xiàn)采集等詳細(xì)過(guò)程，具體如下：

(1)芯片制備：使用Adobe Illustrator設(shè)計(jì)具有Z型混合單元及4個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)池的圖形，高精密打印后通過(guò)紫外曝光后將圖形轉(zhuǎn)移至隔板上通過(guò)濕法刻蝕制備出芯片模板，將PDMS前聚體與固化劑按照質(zhì)量比為10：1的比例混合均勻后將其放入真空干燥器中，連接循環(huán)水真空泵進(jìn)行抽真空30min除氣泡。后將其澆到微流控通道模板上，經(jīng)固化后得到4mm厚的PDMS微流控通道，將PCR反應(yīng)池用8mm打孔器進(jìn)行打孔得到擴(kuò)增反應(yīng)池，等離子處理后，將微流控PCR芯片和薄玻璃片(厚度：0.13-0.17mm)緊密貼合后得到微流控PCR芯片；

(2)微流控PCR芯片準(zhǔn)備：將微流控PCR芯片通入10mg/mL BSA和0.1mM隨機(jī)序列短鏈ssDNA(20nt)在37℃條件下封閉1h，之后用500μL 1×PBST溶液清洗通道后高純氮?dú)獯蹈珊髠溆茫唬?/p>

(3)擴(kuò)增樣品制備：將適配體篩選的產(chǎn)物75μL與300μL 2×SYBR Premix Ex Taq^TM酶，12μL、20μM TAMRA標(biāo)記的前向引物和12μL、20μM生物素化的后向引物及216μL超純水混合通過(guò)注射泵經(jīng)芯片在線(xiàn)混合后平均分配至4個(gè)PCR擴(kuò)增池，最后每個(gè)反應(yīng)池中加入50μL的礦物油防止PCR過(guò)程中溶劑揮發(fā)；

(4)PCR擴(kuò)增過(guò)程：將步驟(2)制備好的芯片放置于溫度循環(huán)平板加熱板上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增程序設(shè)置如下：95℃30s,10～30輪溫度循環(huán)：95℃30s，60.5℃30s，72℃30s。熒光獲取采用小型熒光探頭直接置于反應(yīng)池上方(8mm)直接獲取其中一個(gè)反應(yīng)池中的熒光信號(hào)。擴(kuò)增程序與熒光采集程序同時(shí)開(kāi)始，實(shí)時(shí)采集隨擴(kuò)增輪數(shù)的提高所引起的熒光信號(hào)的改變；

(5)PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)獲取：通過(guò)擴(kuò)增曲線(xiàn)的實(shí)時(shí)獲取和觀測(cè)可以對(duì)適配體篩選的產(chǎn)物進(jìn)行最優(yōu)擴(kuò)增以此來(lái)保證擴(kuò)增輪數(shù)不足(平臺(tái)期以下輪數(shù))引起的擴(kuò)增產(chǎn)物少，又可以防止過(guò)擴(kuò)增(平臺(tái)期以后擴(kuò)增將出現(xiàn)副產(chǎn)物增多)現(xiàn)象出現(xiàn)而導(dǎo)致偏向擴(kuò)增情況，到達(dá)最佳擴(kuò)增輪時(shí)候可通過(guò)計(jì)算機(jī)控制立即結(jié)束PCR擴(kuò)增；

實(shí)施例4：適配體篩選產(chǎn)物實(shí)時(shí)熒光PCR

適配體篩選產(chǎn)物實(shí)時(shí)熒光PCR曲線(xiàn)的獲取的具體步驟，包括芯片制備、微流控PCR芯片準(zhǔn)備、擴(kuò)增樣品制備、PCR擴(kuò)增過(guò)程及擴(kuò)增曲線(xiàn)采集等詳細(xì)過(guò)程，具體如下：

(1)芯片制備：使用Adobe Illustrator設(shè)計(jì)具有Z型混合單元及4個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)池的圖形，高精密打印后通過(guò)紫外曝光后將圖形轉(zhuǎn)移至隔板上通過(guò)濕法刻蝕制備出芯片模板，將PDMS前聚體與固化劑按照質(zhì)量比為10：1的比例混合均勻后將其放入真空干燥器中，連接循環(huán)水真空泵進(jìn)行抽真空30min除氣泡。后將其澆到微流控通道模板上，經(jīng)固化后得到4mm厚的PDMS微流控通道，將PCR反應(yīng)池用8mm打孔器進(jìn)行打孔得到擴(kuò)增反應(yīng)池，等離子處理后，將微流控PCR芯片和薄玻璃片(厚度：0.13-0.17mm)緊密貼合后得到微流控PCR芯片；

(2)微流控PCR芯片準(zhǔn)備：將微流控PCR芯片通入10mg/mL BSA和0.1mM隨機(jī)序列短鏈ssDNA(20nt)在37℃條件下封閉1h，之后用500μL 1×PBST溶液清洗通道后高純氮?dú)獯蹈珊髠溆?；?/p>

(3)擴(kuò)增樣品制備：將適配體篩選的產(chǎn)物75μL與300μL 2×SYBR Premix Ex Taq^TM酶，12μL、20μM TAMRA標(biāo)記的前向引物和12μL、20μM生物素化的后向引物及216μL超純水混合通過(guò)注射泵經(jīng)芯片在線(xiàn)混合后平均分配至4個(gè)PCR擴(kuò)增池，最后每個(gè)反應(yīng)池中加入50μL的礦物油防止PCR過(guò)程中溶劑揮發(fā)；

(4)PCR擴(kuò)增過(guò)程：將步驟(2)制備好的芯片放置于溫度循環(huán)平板加熱板上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增程序設(shè)置如下：95℃30s,10～30輪溫度循環(huán)：95℃30s，60.5℃30s，72℃30s。熒光獲取采用小型熒光探頭直接置于反應(yīng)池上方(8mm)直接獲取其中一個(gè)反應(yīng)池中的熒光信號(hào)。擴(kuò)增程序與熒光采集程序同時(shí)開(kāi)始，實(shí)時(shí)采集隨擴(kuò)增輪數(shù)的提高所引起的熒光信號(hào)的改變；

(5)PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)獲取：通過(guò)擴(kuò)增曲線(xiàn)的實(shí)時(shí)獲取和觀測(cè)可以對(duì)適配體篩選的產(chǎn)物進(jìn)行最優(yōu)擴(kuò)增以此來(lái)保證擴(kuò)增輪數(shù)不足(平臺(tái)期以下輪數(shù))引起的擴(kuò)增產(chǎn)物少，又可以防止過(guò)擴(kuò)增(平臺(tái)期以后擴(kuò)增將出現(xiàn)副產(chǎn)物增多)現(xiàn)象出現(xiàn)而導(dǎo)致偏向擴(kuò)增情況，到達(dá)最有擴(kuò)增輪時(shí)候可通過(guò)計(jì)算機(jī)控制立即結(jié)束PCR擴(kuò)增；

(6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳電泳分析：在微流控PCR芯片擴(kuò)增過(guò)程中，取a:5輪，b:8輪，c:11輪，d:14輪，e:17輪，f:20輪，g:23輪進(jìn)行SDS凝膠電泳驗(yàn)證，觀察其微流控PCR芯片擴(kuò)增過(guò)程中的各個(gè)階段擴(kuò)增情況，通過(guò)驗(yàn)證表明，當(dāng)擴(kuò)增未達(dá)到平臺(tái)期時(shí)擴(kuò)增效率較低，最優(yōu)擴(kuò)增條件為平臺(tái)期時(shí)的擴(kuò)增輪數(shù)，平臺(tái)期后繼續(xù)擴(kuò)增將出現(xiàn)副產(chǎn)物增多的現(xiàn)象，不利于高質(zhì)量次級(jí)文庫(kù)的獲取。

圖2(b)PCR擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)物凝膠電泳圖。

實(shí)施例5：適配體篩選產(chǎn)物實(shí)時(shí)熒光PCR曲線(xiàn)用于文庫(kù)多樣性監(jiān)控

適配體篩選產(chǎn)物實(shí)時(shí)熒光PCR曲線(xiàn)用于適配體篩選多樣性監(jiān)控的具體步驟，包括芯片制備、微流控PCR芯片準(zhǔn)備、擴(kuò)增樣品制備、PCR擴(kuò)增過(guò)程及擴(kuò)增曲線(xiàn)采集等詳細(xì)過(guò)程，具體如下：

(1)芯片制備：使用Adobe Illustrator設(shè)計(jì)具有Z型混合單元及4個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)池的圖形，高精密打印后通過(guò)紫外曝光后將圖形轉(zhuǎn)移至隔板上通過(guò)濕法刻蝕制備出芯片模板，將PDMS前聚體與固化劑按照質(zhì)量比為10：1的比例混合均勻后將其放入真空干燥器中，連接循環(huán)水真空泵進(jìn)行抽真空30min除氣泡。后將其澆到微流控通道模板上，經(jīng)固化后得到4mm厚的PDMS微流控通道，將PCR反應(yīng)池用8mm打孔器進(jìn)行打孔得到擴(kuò)增反應(yīng)池，等離子處理后，將微流控PCR芯片和薄玻璃片(厚度：0.13-0.17mm)緊密貼合后得到微流控PCR芯片；

(2)微流控PCR芯片準(zhǔn)備：將微流控PCR芯片通入10mg/mL BSA和0.1mM隨機(jī)序列短鏈ssDNA(20nt)在37℃條件下封閉1h，之后用500μL 1×PBST溶液清洗通道后高純氮?dú)獯蹈珊髠溆茫唬?/p>

(3)擴(kuò)增樣品制備：將第一輪篩選產(chǎn)物75μL與300μL 2×SYBR Premix Ex Taq^TM酶，12μL、20μM TAMRA標(biāo)記的前向引物和12μL、20μM生物素化的后向引物及216μL超純水混合通過(guò)注射泵經(jīng)芯片在線(xiàn)混合后平均分配至4個(gè)PCR擴(kuò)增池，最后每個(gè)反應(yīng)池中加入50μL的礦物油防止PCR過(guò)程中溶劑揮發(fā)；

(4)PCR擴(kuò)增過(guò)程：將步驟(3)制備好的芯片放置于溫度循環(huán)平板加熱板上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增程序設(shè)置如下：95℃30s,10～30輪溫度循環(huán)：95℃30s，60.5℃30s，72℃30s。熒光獲取采用小型熒光探頭直接置于反應(yīng)池上方(8mm)直接獲取其中一個(gè)反應(yīng)池中的熒光信號(hào)。擴(kuò)增程序與熒光采集程序同時(shí)開(kāi)始，實(shí)時(shí)采集隨擴(kuò)增輪數(shù)的提高所引起的熒光信號(hào)的改變；

(5)PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)獲?。和ㄟ^(guò)擴(kuò)增曲線(xiàn)的實(shí)時(shí)獲取和觀測(cè)可以對(duì)適配體篩選的產(chǎn)物進(jìn)行最優(yōu)擴(kuò)增以此來(lái)保證擴(kuò)增輪數(shù)不足(平臺(tái)期以下輪數(shù))引起的擴(kuò)增產(chǎn)物少，又可以防止過(guò)擴(kuò)增(平臺(tái)期以后擴(kuò)增將出現(xiàn)副產(chǎn)物增多)現(xiàn)象出現(xiàn)而導(dǎo)致偏向擴(kuò)增情況，到達(dá)最有擴(kuò)增輪時(shí)候可通過(guò)計(jì)算機(jī)控制立即結(jié)束PCR擴(kuò)增；

(6)對(duì)第二，第三，第三輪篩選產(chǎn)物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)(3)，(4)，(5)實(shí)驗(yàn)操作，獲取篩選的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)。

圖3為多通道微流控PCR芯片文庫(kù)多樣性監(jiān)控圖。