本發(fā)明涉及一種固定化雙酶耦合反應(yīng)生產(chǎn)非天然氨基酸產(chǎn)品的工藝，屬于生物化學(xué)中的酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

非天然氨基酸，是眾多藥物尤其是近十年來眾多新藥的核心中間體，如左乙拉西坦使用L-2-氨基丁酸，培哚普利使用L-正纈氨酸，氯吡格雷使用L-2-鄰氯苯甘氨酸，他塔那非使用D-色氨酸，佐米曲坦使用D-脯氨酸，阿扎那韋、特拉匹韋使用L-2-叔亮氨酸，那格列奈、奧曲肽使用D-苯丙氨酸等。

非天然氨基酸主要的生產(chǎn)手段是利用生物酶技術(shù)，利用的酶有氨基?；浮⑶嗝顾仵；?、海因酶，脫氫酶，氨基酸氧化酶等。其中氨基酰化酶是主要的方法之一，長期以來用于生產(chǎn)非天然氨基酸。氨基?；赣蠨-氨基酰化酶和L-氨基?；福渲蠨-氨基?；复呋阴?D-氨基酸生成D-氨基酸，L-氨基?；复呋阴?L-氨基酸生成L-氨基酸。在工業(yè)上，氨基?；阜ㄉa(chǎn)非天然氨基酸的原料為乙?；?DL-氨基酸，因此轉(zhuǎn)化率只有50%。

專利報(bào)道了將?；概c氨基?；富旌虾笈悸?lián)反應(yīng)，將DL-乙?；?DL-氨基酸一步轉(zhuǎn)換為手性氨基酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了100%。該方法的缺點(diǎn)是使用游離細(xì)胞法，不便于重復(fù)使用，游離細(xì)胞容易破碎，產(chǎn)品成本高，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定；如何能夠?qū)⑸锎呋瘎┲貜?fù)使用、降低催化劑成本是該技術(shù)能否工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵因素，其中固定化酶或者固定化細(xì)胞技術(shù)是主要的解決途徑。

固定化細(xì)胞技術(shù)作為生物工程新技術(shù)，具有成本低、污染小、效率高等優(yōu)點(diǎn)。目前固定化技術(shù)使用的材料有卡拉膠、海藻酸鈉、樹脂、葡聚糖、聚丙烯酰胺等，固定化細(xì)胞材料用于產(chǎn)業(yè)化，理論上要求具有以下特點(diǎn)：容易與細(xì)胞或者酶快速混合，并快速凝固；盡量低溫凝固，以避免酶的活性損失；盡量為顆粒狀，便于裝入反應(yīng)器，以及獲得較好的反應(yīng)特性；具有較好的強(qiáng)度硬度等機(jī)械性能；具有多孔性，具有良好的傳質(zhì)性能；價(jià)格低廉。為了制備具有以上性能的固定化細(xì)胞，研究人員通過優(yōu)化固定化材料和制備工藝、選擇優(yōu)質(zhì)的交聯(lián)劑等方式已經(jīng)推出各類性能不同的固定化細(xì)胞。

聚乙烯醇作為一種新型的生物催化劑包埋固定化載體，具有強(qiáng)度 高、化學(xué)穩(wěn)定性好、抗微生物分解性能強(qiáng)、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在以下缺點(diǎn)：1.用于交聯(lián)聚乙烯醇的溶液酸性較強(qiáng)，會(huì)使固定化細(xì)胞活性降低；2.具有高粘性，并且與酸反應(yīng)較慢，會(huì)使滴入時(shí)間相差不大的兩液滴粘連，并附聚成團(tuán)，不易凝膠成球；3.固定化后酶活保留率低，部分對酸敏感的酶會(huì)逐漸失活。

因此研究一種好的復(fù)配交聯(lián)劑體系，已經(jīng)成為聚乙烯醇為固定化材料酶法生產(chǎn)非天然氨基酸的重要影響因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述缺陷，本發(fā)明提供了一種固定化雙酶耦合一步法反應(yīng)生產(chǎn)非天然氨基酸產(chǎn)品的工藝。

其特征在于：以聚乙烯醇、海藻酸鈉、卡拉膠的混合物為固定化材料，以硼酸-硼砂-氯化鈣-碳酸鈉體系為交聯(lián)劑，將具有氨基?；负王；傅幕蚬こ叹旌虾蠊补潭ɑ?，制備出顆粒狀固定化細(xì)胞。以乙酰化-DL-氨基酸為原料，在生物反應(yīng)器中利用雙酶耦合反應(yīng)，一步生產(chǎn)非天然氨基酸系列產(chǎn)品。具體操作工藝如下：

交聯(lián)劑溶液的配制工藝：

在攪拌容器中加入水，加入一定比例的硼酸，硼砂、氯化鈣，碳酸鈉，調(diào)整pH即得到交聯(lián)劑溶液。可以根據(jù)要求增減部分原料和配比。

細(xì)胞共固定化工藝：

取一定量聚乙烯醇加入水溶脹24h，然后加入海藻酸鈉和卡拉膠，滅菌鍋加熱使其充分溶化，趁熱攪拌，降溫到40～50℃，然后向上述液體中加入預(yù)先保溫50℃的L-型氨基?；负王；富旌暇鷳乙?攪拌均勻，用注射器吸入，然后滴加到上述硼酸-硼砂-氯化鈣-碳酸鈉體系的交聯(lián)劑溶液中，形成一定直徑的小球，在交聯(lián)劑中浸泡3～12h。用生理鹽水洗滌，得到L-型氨基酸固定化細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)化。將上述L-氨基?；父鏋镈-氨基?；?，則制備出D-型氨基酸固定化細(xì)胞。

生物催化工藝：

在蒸餾水中加入乙?；?DL-氨基酸，一般配成0.1-0.2M溶度溶液，用片堿調(diào)整PH=7.5，加入上述L-型氨基酸固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化，37℃，5-10小時(shí)后測定，乙?；?DL-氨基酸小于0.001%，全部轉(zhuǎn)化（全部轉(zhuǎn)化是指超過99.9%以上的轉(zhuǎn)化，下同）。為L-丙氨酸，經(jīng)過濃縮以及純化處理，得到L-氨基酸。

在蒸餾水中加入乙?；?DL-氨基酸，一般配成0.1-0.2M溶液，用片堿調(diào)整PH=7.5，加入上述D-型氨基酸固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化，37℃，5-10小時(shí)后測定，乙?；?DL-氨基酸小于0.001%，全部轉(zhuǎn)換為D-氨基酸，經(jīng)過濃縮以及純化處理，得到L-氨基酸。

上述固定化材料為聚乙烯醇、海藻酸鈉、卡拉膠的混合物，聚乙烯醇材料的濃度為5-15%，優(yōu)選8-12%。

主料和輔料的重量配比為，聚乙烯醇：海藻酸鈉：卡拉膠=100:0.1-0.5:0.2-1.0。

上述交聯(lián)劑為硼酸-硼砂-氯化鈣-碳酸鈉體系，交聯(lián)采取低溫交聯(lián)，交聯(lián)溫度為-10～20℃。

按照上述方法制備的固定化細(xì)胞為顆粒狀。具有氨基酰化酶和?；富钚缘木w按照酶活比例混合后固定化，制備出顆粒狀固定化細(xì)胞，利用雙酶耦合反應(yīng)，一步生產(chǎn)非天然氨基酸系列產(chǎn)品。

發(fā)明有益效果

本發(fā)明采用新型聚乙烯醇固定化復(fù)配材料，較好地解決了固定化細(xì)胞的顆粒度、穩(wěn)定性以及快速的凝固速度；

本發(fā)明采用新型交聯(lián)劑，近中性環(huán)境條件下交聯(lián)，避免了對酶的破壞。本工藝成功用于固定化氨基酰化酶和?；富旌暇w，并通過耦合反應(yīng)技術(shù)，一步生產(chǎn)了非天然氨基酸。

具體實(shí)施例

本實(shí)施例中使用的分析方法如下：

固定化細(xì)胞強(qiáng)度：將固定化小球放入100mL注射器中，施加一定的壓力，觀察小球的破損情況。

固定化細(xì)胞傳質(zhì)度：取數(shù)粒固定化小球，放入盛有200mL水的250mL錐形瓶中，加入一滴亞甲基藍(lán)，定時(shí)觀察顏色滲入固定化小球的情況

固定化細(xì)胞溶脹度(%)：取100mL固定化細(xì)胞，在0.05M磷酸緩沖液25℃保存24小時(shí)，體積的增加量。

固定化細(xì)胞酶活保存率：固定化細(xì)胞在0.05M磷酸緩沖液，0.1M乙酰-DL-苯丙氨酸濃度下反應(yīng)5小時(shí)后，測定固定化細(xì)胞的比活，與初始比活比較，為酶活保存率

固定化細(xì)胞顆粒完好率：固定化細(xì)胞在0.05M磷酸緩沖液，0.1M乙酰-DL-苯丙氨酸濃度下反應(yīng)5小時(shí)后，剔除破損大于四分之一體積的顆粒后的存留百分比。

成球時(shí)間：固定化細(xì)胞自注射器滴下，在交聯(lián)劑溶液中完全硬化的時(shí)間。

黏連性：肉眼觀察，固定化細(xì)胞自注射器滴下，在交聯(lián)劑溶液中是否互相黏連。

實(shí)施例1

(A) 交聯(lián)劑溶液的配制

在燒瓶中加入800mL水，加入硼酸15克，硼砂15克，混合，然后加入氯化鈣10克，碳酸鈉50克，測定pH值，用碳酸鈉或者硼酸調(diào)整pH到7.0，定容到1000mL，混合均勻待用。可以根據(jù)要求增減部分原料和配比。

(B) 細(xì)胞固定化方法

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶脹24h，加入0.2克海藻酸鈉和0.2克卡拉膠，滅菌鍋加熱使其充分溶化，趁熱攪拌，降溫到40～50℃，然后向上述液體中加入預(yù)先保溫50℃的氨基?；负王；富旌暇鷳乙喝。↙-氨基?；该副然盍?0umol/g.min，?；该副然盍?0umol/g.min）100mL,攪拌均勻。用50 mL的注射器吸入，然后滴加到上述硼酸-硼砂-氯化鈣-碳酸鈉體系的交聯(lián)劑溶液中，形成一定直徑的小球，在交聯(lián)劑中浸泡3～12 h。用生理鹽水洗滌，得到L-型氨基酸固定化細(xì)胞，固定化細(xì)胞的比活力為15.5umol/g.min，冰箱保存，用于轉(zhuǎn)化和性能測定。

對上述制備過程以及固定化細(xì)胞進(jìn)一步測定，得到數(shù)據(jù)如下：固定化顆粒大約3mm，強(qiáng)度較高，成球時(shí)間為12小時(shí)，傳質(zhì)效果良好，固定化細(xì)胞的溶脹度為12%，無黏連性，顆粒完好率95%。固定化細(xì)胞酶活保存率91%。

(C) 轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法：

在1L蒸餾水中加入乙酰化-DL-丙氨酸27克，配成0.2M濃度溶液，用片堿調(diào)整pH=7.5，加入上述L-型氨基酸固定化細(xì)胞50克轉(zhuǎn)化，37℃，10小時(shí)后測定，乙?；?DL-丙氨酸小于0.001%，幾乎全部轉(zhuǎn)換為L-丙氨酸，經(jīng)過濃縮以及純化處理，得到L-丙氨酸18克。

以DL-乙酰-亮氨酸，DL-乙酰-纈氨酸，DL-乙酰苯丙氨酸，DL-乙酰正亮氨酸為原料，均配備0.2M濃度溶液，用片堿調(diào)整pH=7.5，加入上述固定化細(xì)胞50克轉(zhuǎn)化，37℃，10小時(shí)后測定，乙?；?DL-氨基酸小于0.001%，全部轉(zhuǎn)換為L-氨基酸。上述原料分別得到L-亮氨酸，L-纈氨酸，L-苯丙氨酸，L-正亮氨酸。

對比實(shí)施例1：

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶脹24 h，滅菌鍋加熱使其充分溶化，趁熱攪拌，降溫到40～50℃，然后加入預(yù)先保溫50℃的氨基酰化酶和?；富旌暇鷳乙喝。↙-氨基?；该副然盍?0umol/g.min，?；该副然盍?0umol/g.min）100mL,攪拌均勻。用50 mL的注射器吸入，然后滴加到硼酸-氯化鈣-碳酸鈉體系的交聯(lián)劑溶液(硼酸15g/L，氯化鈣10g/L，碳酸鈉50g/L)中，形成一定直徑的小球，在交聯(lián)劑中浸泡3～12 h。用生理鹽水洗滌，得到L-型氨基酸固定化細(xì)胞，測定性能。

分別配置2%，5%，8%，10%, 15%，20%聚乙烯醇濃度重復(fù)以上試驗(yàn)，其他條件不變，結(jié)果如下：

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，單獨(dú)聚乙烯醇固定化細(xì)胞溶脹率高，成球速度慢，球互相黏連，同時(shí)隨聚乙烯醇濃度增加，粘度加大，甚至不能夠成球。聚乙烯醇濃度以10%合適。

對比實(shí)施例2

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶脹24 h，加入不同比例海藻酸鈉重復(fù)試驗(yàn)，其他條件同對比實(shí)施例1，結(jié)果如下：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：加入海藻酸鈉后，小球強(qiáng)度增加，溶脹率降低，容易成球，不黏連，以0.2%最合適。

對比實(shí)施例3

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶脹24 h，加入不同比例卡拉膠重復(fù)試驗(yàn)，其他條件同對比實(shí)施例1，結(jié)果如下：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：加入卡拉膠后，小球強(qiáng)度增加，溶脹率降低，依然不易成球，但固定化酶回收率提高，以0.5%最合適。

對比實(shí)施例4

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶脹24 h，海藻酸鈉0.2%，加入不同比例卡拉膠重復(fù)試驗(yàn)，其他條件同對比實(shí)施例1，結(jié)果如下：

通過實(shí)驗(yàn)比較，優(yōu)選聚乙烯醇10%，海藻酸鈉0.2%，卡拉膠0.5%位最優(yōu)比例。

對比實(shí)施例5

改變交聯(lián)劑的配比以及加入硼砂，試驗(yàn)條件同對比實(shí)施例4，結(jié)果如下：

通過比較，優(yōu)選硼酸15g/L，硼砂15g/L，氯化鈣10g/L，碳酸鈉50g/L作為最佳交聯(lián)體系。

實(shí)施例2

(A)交聯(lián)劑溶液的配制

同實(shí)施例1

(B)細(xì)胞固定化方法

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶脹24 h，加入0.2克海藻酸鈉和0.2克卡拉膠，滅菌鍋加熱使其充分溶化，趁熱攪拌，降溫到40～50℃，然后加入預(yù)先保溫50℃的D-氨基?；负王；富旌暇鷳乙海―-氨基?；该副然盍?0umol/g.min，?；该副然盍?8umol/g.min）100mL,攪拌均勻。用50mL的注射器吸入，然后滴加到上述硼酸-硼砂-氯化鈣-碳酸鈉體系的交聯(lián)劑溶液中，形成一定直徑的小球，在交聯(lián)劑中浸泡3～12 h。用生理鹽水洗滌，得到D-型氨基酸固定化細(xì)胞，經(jīng)過測定，固定化細(xì)胞的比活力為12.2umol/g.min，冰箱保存，用于轉(zhuǎn)化。

(C)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法：

在1L蒸餾水中加入乙酰化-DL-丙氨酸27克，配成0.2M濃度溶液，用片堿調(diào)整pH=7.5，加入上述D-型氨基酸固定化細(xì)胞50克轉(zhuǎn)化，37℃，10小時(shí)后測定，乙?；?DL-丙氨酸小于0.001%，全部轉(zhuǎn)換為D-丙氨酸，經(jīng)過濃縮以及純化處理，得到D-丙氨酸18克。

以DL-乙酰-亮氨酸，DL-乙酰-纈氨酸，DL-乙酰苯丙氨酸，DL-乙酰正亮氨酸為原料，均配備0.2M濃度溶液，用片堿調(diào)整pH=7.5，加入上述固定化細(xì)胞50克轉(zhuǎn)化，37℃，10小時(shí)后測定，乙?；?DL-氨基酸小于0.001%，全部轉(zhuǎn)換為D-氨基酸。上述原料分別得到D-亮氨酸，D-纈氨酸，D-苯丙氨酸，D-正亮氨酸。

實(shí)施例3

(A) 交聯(lián)劑溶液的配制

同實(shí)施例1

(B)細(xì)胞固定化方法

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶脹24 h，加入0.2克海藻酸鈉和0.2克卡拉膠，滅菌鍋加熱使其充分溶化，趁熱攪拌，降溫到40-50度，然后加入預(yù)先保溫50℃的氨基酰化酶菌懸液?。↙-氨基?；该副然盍?0umol/g.min）100mL,攪拌均勻。用50 mL的注射器吸入，然后滴加到上述硼酸-硼砂-氯化鈣-碳酸鈉體系的交聯(lián)劑溶液中，形成一定直徑的小球，在交聯(lián)劑中浸泡3～12 h。用生理鹽水洗滌，得到L-型氨基酸固定化細(xì)胞，經(jīng)過測定，固定化細(xì)胞的比活力為36.5umol/g.min，冰箱保存，用于轉(zhuǎn)化。

(C)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法：

在1L蒸餾水中加入乙?；?DL-丙氨酸27克，配成0.2M溶度溶液，用片堿調(diào)整pH=7.5，加入上述L-型氨基酸固定化細(xì)胞50克轉(zhuǎn)化，37℃，10小時(shí)后測定，L-丙氨酸轉(zhuǎn)化率50%，經(jīng)過濃縮以及純化處理，得到L-丙氨酸6.8克。

以DL-乙酰-亮氨酸，DL-乙酰-纈氨酸，DL-乙酰苯丙氨酸，DL-乙酰正亮氨酸為原料，分別得到L-亮氨酸，L-纈氨酸，L-苯丙氨酸，L-正亮氨酸。原料試驗(yàn)：上述均配成0.2M溶液，用片堿調(diào)整pH=7.5，加入上述固定化細(xì)胞50克轉(zhuǎn)化，37℃，10小時(shí)后測定，乙?；?DL-氨基酸以50%的轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)換為L-氨基酸。

實(shí)施例4

(A) 交聯(lián)劑溶液的配制

同實(shí)施例1

(B)細(xì)胞固定化方法

取10克聚乙烯醇加入90mL水溶脹24 h，加入0.2克海藻酸鈉和0.2克卡拉膠，滅菌鍋加熱使其充分溶化，趁熱攪拌，降溫到40～50℃，然后加入預(yù)先保溫50℃的D-氨基?；妇鷳乙喝。―-氨基酰化酶酶比活力65umol/g.min）100mL,攪拌均勻。用50 mL的注射器吸入，然后滴加到上述硼酸-硼砂-氯化鈣-碳酸鈉體系的交聯(lián)劑溶液中，形成一定直徑的小球，在交聯(lián)劑中浸泡3～12 h。用生理鹽水洗滌，得到D-型氨基酸固定化細(xì)胞，經(jīng)過測定，固定化細(xì)胞的比活力為28.5umol/g.min，冰箱保存，用于轉(zhuǎn)化。

(C)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法：

在1L蒸餾水中加入乙?；?DL-丙氨酸27克，配成0.2M溶度溶液，用片堿調(diào)整PH=7.5，加入上述D-型氨基酸固定化細(xì)胞50克轉(zhuǎn)化，37℃，10小時(shí)后測定，D-丙氨酸轉(zhuǎn)化率50%，經(jīng)過濃縮以及純化處理，得到D-丙氨酸7.0克。

以DL-乙酰-亮氨酸，DL-乙酰-纈氨酸，DL-乙酰苯丙氨酸，DL-乙酰正亮氨酸為原料，分別得到D-亮氨酸，D-纈氨酸，D-苯丙氨酸，D-正亮氨酸。原料試驗(yàn)：上述均配成0.2M溶液，用片堿調(diào)整pH=7.5，加入上述固定化細(xì)胞50克轉(zhuǎn)化，37℃，10小時(shí)后測定，乙?；?DL-氨基酸以50%的轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)換為D-氨基酸。