本發(fā)明涉及基因合成領(lǐng)域，具體涉及一種基因合成方法。

背景技術(shù)：

目前基因合成技術(shù)普遍利用dna聚合酶，在體外模擬dna復(fù)制，彼此帶有同源序列的引物在dna聚合酶的作用下能彼此延伸得到目的dna片段，最終將得到的dna片段分離純化后克隆到指定載體中測(cè)序驗(yàn)證，這一技術(shù)我們稱之為基于pcr的基因合成技術(shù)。該技術(shù)原理簡(jiǎn)單、易用，但操作過程十分復(fù)雜，整個(gè)過程需要經(jīng)歷pcr體系的配制、上機(jī)擴(kuò)增、電泳檢測(cè)回收、酶切連接、轉(zhuǎn)化等繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作步驟；同時(shí)pcr過程會(huì)將引物本身帶有的突變放大導(dǎo)致合成出錯(cuò)；并且高度重復(fù)序列、高gc、高at、反向重復(fù)、回文等高級(jí)結(jié)構(gòu)因pcr不能正常擴(kuò)增而導(dǎo)致合成的失敗，成為基于pcr的基因合成技術(shù)的一大難點(diǎn)和瓶頸。與之對(duì)應(yīng)的是大量的人力，物力和時(shí)間的耗費(fèi)，因此極大了限制了合成的通量和人均產(chǎn)能。隨著基因研究的不斷深入，目前“讀基因”(基因測(cè)序)擁有全自動(dòng)的高通量測(cè)序儀，但“寫基因”(基因合成)全都依賴人工合成，因此繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟、目前技術(shù)手段的內(nèi)在短板成為了寫基因的限速步驟。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，本發(fā)明的主要目的在于提供一種基因合成方法，不依賴pcr擴(kuò)增，規(guī)避了pcr擴(kuò)增中繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟；同時(shí)規(guī)避了pcr技術(shù)錯(cuò)誤率高，難以擴(kuò)增高度重復(fù)、高gc、高at含量、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等難度序列的缺陷；本發(fā)明能將具有相同或不同來源的基因同步組合合成，構(gòu)建基因突變庫(kù)，具有靈活性。

為了解決上述缺陷，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種基因合成方法，所述方法包括：

(1)將待合成基因序列分成55-100bp長(zhǎng)度的第一連續(xù)片段，將所述第一連續(xù)片段設(shè)計(jì)成正向引物；將與所述第一連續(xù)片段錯(cuò)開15-20bp長(zhǎng)度處的基因序列作為第二連續(xù)片段，在所述第二連續(xù)片段的反向互補(bǔ)序列上設(shè)計(jì)連續(xù)的反向引物；

(2)將所述正向引物和反向引物混合，得到引物混合物；

(3)將所述引物混合物煮沸，退火，得到含有多個(gè)缺刻的雙鏈dna片段；

(4)將合成的雙鏈dna片段連接到puc57-gfp-amp載體上，所述載體的序列如序列表1所示，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，反向篩選不發(fā)熒光的菌落，測(cè)序驗(yàn)證。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述正向引物中，最靠近基因5’端的引物在5’端含有接頭序列；所述反向引物中，最靠近基因3’端的引物在3’端含有接頭序列。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述接頭序列包括載體序列的粘性末端序列和含金門克隆反應(yīng)的接頭序列。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述正向引物和反向引物完全覆蓋基因的正向序列和反向互補(bǔ)序列，并在所述引物混合物煮沸退火時(shí)在上一引物和下一引物之間配對(duì)形成約15-20bp長(zhǎng)度的雙鏈。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(1)中，根據(jù)待合成基因的長(zhǎng)度大小，進(jìn)行基因分組，每組長(zhǎng)度為700-800bp，再將700-800bp長(zhǎng)度的基因序列分成長(zhǎng)度55-100bp連續(xù)片段。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(3)中，將所述引物混合物經(jīng)t4多聚核苷酸激酶磷酸化處理后煮沸、退火，再由t4dna連接酶處理，將引物連成兩端帶長(zhǎng)粘性末端的雙鏈dna片段。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述待合成基因序列的長(zhǎng)度為500-800bp。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(4)中，所述puc57-gfp-amp載體的制備方法包括：提供一puc57載體，將所述puc57載體改造獲得含gfp基因、無(wú)sapi酶切位點(diǎn)的puc57-sapifree-amp載體，通過雙酶切和t4dna外切酶活性得到線性化的兩端為長(zhǎng)粘性末端的載體。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(4)中，將合成的雙鏈dna基因連接到所述puc57-gfp-amp載體上，包括：通過同源重組的方法將含粘性末端的基因連接到含有對(duì)應(yīng)長(zhǎng)粘性末端的載體上，通過gfp熒光進(jìn)行反向篩選轉(zhuǎn)化該質(zhì)粒的大腸桿菌。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，還包括：將克隆到所述載體的基因片段質(zhì)粒通過1到3輪金門克隆反應(yīng)進(jìn)行拼接，得到全長(zhǎng)基因。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明基因合成方法不需要基因擴(kuò)增儀，整個(gè)合成過程只需要電熱水壺、水浴鍋等簡(jiǎn)單廉價(jià)的設(shè)備，是一個(gè)能迅速?gòu)?fù)制的生產(chǎn)路線。另外，本發(fā)明設(shè)計(jì)的puc57-gfp-amp載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：a、載體骨架更符合客戶選擇，背景清晰使用方便，一步合成的小基因可直接發(fā)貨給客戶。b、載體只需要t4dna聚合酶在相應(yīng)保護(hù)堿基存在的條件下處理一次即可，大大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，且無(wú)需轉(zhuǎn)化rosetta(de3)plyss菌株，gfporf帶有prrn組成型啟動(dòng)子，在常見的大腸桿菌top10中也能表達(dá)綠色熒光蛋白，菌體在藍(lán)光儀下呈綠色，可用于反向篩選。而且，本發(fā)明中設(shè)計(jì)引物的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)在70nt甚至更長(zhǎng)，一步合成的典型長(zhǎng)度可以達(dá)到500bp以上，進(jìn)一步擴(kuò)展了合成小基因的范圍，如果待合成的基因在500bp以內(nèi)可以通過提高引物長(zhǎng)度一步合成；引物之間可以在退火時(shí)互相配對(duì)驗(yàn)證，降低錯(cuò)誤合成的引物被引進(jìn)基因序列的問題，保證了克隆進(jìn)載體基因的正確率。

綜上所述，本發(fā)明基因合成方法不依賴pcr擴(kuò)增，規(guī)避了pcr擴(kuò)增中繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟，極大地提升了人均產(chǎn)能，降低合成的成本；同時(shí)該技術(shù)完美規(guī)避了pcr技術(shù)錯(cuò)誤率高(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明800bp序列一步合成正確率達(dá)到99％以上)，難以擴(kuò)增高度重復(fù)、高gc、高at含量、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等難度序列的缺陷；因其靈活性，能將具有相同或不同來源的基因同步組合合成，構(gòu)建基因突變庫(kù)，是組合生物合成技術(shù)(combinatorialbiosynthesis)的最佳選擇，對(duì)篩選功能藥物等生理活性物質(zhì)，研究生物代謝途徑以及生物進(jìn)化具有非常重要的意義。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例的引物組裝克隆示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2金門克隆反應(yīng)示意圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例puc57-gfp-amp載體的示意圖。

圖4a-1至4a-2為16083a的測(cè)序結(jié)果示意圖。

圖4b-1至4b-2為16083b的測(cè)序結(jié)果示意圖。

圖4c-1至4c-2為16083c的測(cè)序結(jié)果示意圖。

圖5-1至5-2為16083測(cè)序比對(duì)結(jié)果圖。

圖6a-1至6a-2為16128a的測(cè)序結(jié)果示意圖。

圖6b-1至6b-3為16128b的測(cè)序結(jié)果示意圖。

圖6c-1至6c-3為16128c的測(cè)序結(jié)果示意圖。

圖7-1至7-2為16128測(cè)序比對(duì)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過提供一種基因合成方法，克服了現(xiàn)有基于pcr的基因合成技術(shù)的缺陷。

為了解決上述問題，本發(fā)明實(shí)施例的主要思路是：

本發(fā)明實(shí)施例基因合成方法，所述方法包括：

(1)將待合成基因序列分成55-100bp長(zhǎng)度的第一連續(xù)片段，將所述第一連續(xù)片段設(shè)計(jì)成正向引物；將與所述第一連續(xù)片段錯(cuò)開15-20bp長(zhǎng)度處的基因序列作為第二連續(xù)片段，在所述第二連續(xù)片段的反向互補(bǔ)序列上設(shè)計(jì)連續(xù)的反向引物；

(2)將所述正向引物和反向引物混合，得到引物混合物；

(3)將所述引物混合物煮沸，退火，得到含有多個(gè)缺刻的雙鏈dna片段；

(4)將合成的雙鏈dna片段連接到puc57-gfp-amp載體上，所述載體的序列如序列表1所示，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，反向篩選不發(fā)熒光的菌落，測(cè)序驗(yàn)證。

所述步驟(4)中，所述載體的制備方法包括：

提供一puc57載體，對(duì)puc57載體上的sapi位點(diǎn)進(jìn)行誘變，去掉sapi位點(diǎn)。然后對(duì)mcs(多克隆位點(diǎn))處進(jìn)行改造只保留兩端的ecori和hindiii位點(diǎn)，同時(shí)分別在ecori位點(diǎn)前面和hindiii后面分別設(shè)計(jì)一段序列，達(dá)到t4dna聚合酶處理一次就得到比較長(zhǎng)的黏性末端的效果。在ecori和hindiii位點(diǎn)中間填充一個(gè)gfp的orf(開放閱讀框架)，載體命名為puc57-gfp-amp。

所述步驟(1)-(4)中，對(duì)于小于500bp左右長(zhǎng)度的基因片段，用去離子水將每條引物稀釋成濃度為10poml，分別取每條引物1ul于一干凈的ep管中，加入2.5ulthbuffer(500mmnacl，100mmtris-cl(ph8.0),1mmedta)，補(bǔ)去離子水至總體積25ul充分混勻。將混合物至于沸水中10min然后緩慢降溫至室溫；對(duì)于大于500bp小于800bp的基因片段，在引物混合后需要加入atp和t4多聚核苷酸激酶，使引物5’端磷酸化。

退火產(chǎn)物與載體的孵育：取退火產(chǎn)物3ul，預(yù)處理的puc57-gfp-amp載體1ul，混合均勻后37℃保溫15min后常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10細(xì)胞，涂布lb/amp抗性平板過夜培養(yǎng)。

在藍(lán)光儀下觀察過夜培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子，用記號(hào)筆圈出發(fā)光的菌(空載體)，隨機(jī)挑取8個(gè)菌落進(jìn)行pcr驗(yàn)證。

陽(yáng)性克隆送測(cè)序：

基因合成連接載體示意圖見圖1，其中p1、p3、p5、pn-1等連接起來為完整的基因序列。p2、p4、p6、pn連接起來為基因的反向互補(bǔ)序列。另外pn3’末端為和載體突出的粘性末端互補(bǔ)序列，p15’末端為和載體突出的粘性末端互補(bǔ)序列。

基因拼接：對(duì)于長(zhǎng)度超過800bp的基因，先將長(zhǎng)片段基因進(jìn)行分組，每組長(zhǎng)度在所合成片段范圍內(nèi)，然后將克隆到表達(dá)載體的基因片段質(zhì)粒通過1到3輪金門克隆反應(yīng)進(jìn)行拼接。

為了更加清晰地理解本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。此處所描述的具體例子所涉及的具體數(shù)據(jù)僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

puc57-gfp-amp載體的制備方法包括：

1、提供一puc57載體，對(duì)puc57載體上的sapi位點(diǎn)進(jìn)行誘變，去掉sapi位點(diǎn)。然后對(duì)mcs(多克隆位點(diǎn))處進(jìn)行改造只保留兩端的ecori和hindiii位點(diǎn)，同時(shí)分別在ecori位點(diǎn)前面和hindiii后面分別設(shè)計(jì)一段序列，達(dá)到t4dna聚合酶處理一次就得到比較長(zhǎng)的黏性末端的效果。在ecori和hindiii位點(diǎn)中間填充一個(gè)gfp的orf(開放閱讀框架)，載體命名為puc57-gfp-amp。

具體地步驟如下：

1.1sapi位點(diǎn)的誘變：設(shè)計(jì)引物(帶下劃線為突變堿基)

puc57-sapimut-f:5'gcgtattgggcgcacttccgcttcctcgctcactgactc3'

puc57-sapimut-r:5'gcgaggaagcggaagtgcgcccaatacgcaaac3'

以puc57-amp載體為模板擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用dpni消化之后回收轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10，隨機(jī)挑選3個(gè)轉(zhuǎn)化子用m13-47引物測(cè)序，突變正確的載體標(biāo)記為puc57-sapifree-amp。

1.2mcs的改造：設(shè)計(jì)引物(下劃線為載體重組臂；波浪線為設(shè)計(jì)的接頭以及酶切位點(diǎn))

mcs-f:aaaacgacggccagtagttcttcggatacgccgttcgctgtg

mcs-r:tatgaccatgattacgccaattgtgagcgctctagaggatac

1.3以申請(qǐng)人公司保留的含gfp的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到gfporf；

puc57-sapifree-amp載體用ecori/hindiii酶切回收載體骨架與擴(kuò)增回收得到的gfporf在gisbon重組酶的作用下進(jìn)行體外重組。反應(yīng)條件如下：

50℃反應(yīng)1h，反應(yīng)產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟見分子克隆手冊(cè))，涂布lb/amp抗性平板，37℃過夜培養(yǎng)。

1.4在藍(lán)光儀下觀察過夜培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑選3個(gè)發(fā)光的重組子送測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序驗(yàn)證，之后的載體即為puc57-gfp-amp載體，接種提質(zhì)粒備用。

2.puc57-gfp-amp線性化載體的制備：

2.1puc57-gfp-amp的酶切線性化，酶切體系如下：

水浴鍋37℃反應(yīng)2h，電泳檢測(cè)回收(操作方法參考axygen凝膠回收試劑盒)

2.2puc57-gfp-amp線性化載體的t4dna聚合酶處理，反應(yīng)體系如下

12℃反應(yīng)30min，電泳檢測(cè)回收(操作方法參考axygen凝膠回收試劑盒)

puc57-gfp-amp載體經(jīng)ecori和hindiii酶切后在t4dna聚合酶3’-5’外切酶活性的作用下，在保護(hù)堿基dttp存在的條件下于12℃處理30min得到含有長(zhǎng)黏性末端的載體備用。處理之后得到的載體示意圖如圖3所示。

引物退火一步組裝合成基因16083：

1.基因分組(下劃線為與載體退火序列，波浪線為sapi位點(diǎn))

16083a:(519bp)

caagagagaattatgaattcatgaccgacgtgagcacgacgaatcagcgctacatgacccagacggacttcatgtcgtggcggatggaggaggacccgatcctccggtcgaccatcgtggcggtcgcactgctcgaccgcagtccggatcagagccgattcgtcgacatgatgcgcagggcggtcgacctggttcccctcttccggcggacggcgatcgaggctccgatgggctttgcgccgccgaggtgggcggacgatcacgatttcgatctcagctggcacctgcgccgctacaccctccccgaaccacgaacatgggacggggttctcgacttcgcccggaccgccgagatgaccgccttcgacaagcgccgtccgctctgggagttcaccgttctcgacggactccacgacggcaggtccgccctcgtgatgaaggtgcatcactctctcaccgacggtgtcagtggaatgcagattgcccgggagcttttggcgt

16083b:(527bp)

caagagagaattgggagatcgtggatttcacccgcgatggcgggccacggccggaccggaccgaccaccgcacggccgcgccgaacggtgaatcgcccactccgccgggccgcctctcctggtaccggaacacggccaccgacgtggcccgccgggcatcgaacacgctgggccgcaacagtgttcgactggttcggactccgagggccacctggcgcgacgcagccgcactagccggctccacactgcgcctcacgcgtcccgtggtctccacactgtccccggtcatgaaaaaacgcagcacgcggcgtcactgtgcggtgctcgacgtgccggtggaggcgctcgctcaggcggccgcggcgggtgccggttcgatcaacgacgcgtttctcgctgctgtcctgctgggaatggcgaagtaccaccgactgcacggcgccgagatcagcgaactgcggatgacgctgccgatcagcctgcgtgccgagacggacaagcttttggcgt

16083c:(536bp)

caagagagaattgacccggtgggaggcaaccgcatcaccctggcacgttttgcactacccgccgacatcgacgaccccgccgagttgatgcaccgggtgcacgccacggtggatgcctggcgccacgagcccgcgattccgctgtcaccgacgatcgccggcgccttgaacctgcttccggcctcgacactcggaaacatgctcaaacacgtcgacttcgtcgcctcgaacgtcgtcggatctccggtaccactgttcatcgccgggtcggaggttctgcactactacgcgttcagccccacactcggatcggcgttcaacgtcaccttgatgtcctacaccacgcgatgctgtgtcgggatcaacgccgacacggacgcaatcccggacctcgcaaccctgaccgattcgatagcggacgggtttcgcgccgtcctcggactgtgcacgaagacaaccgatacgagggtggtcgtggcctcgactcgagtaaagcttttggcgt

2.引物設(shè)計(jì)(overlap數(shù)20bp)

3.用去離子水將每條引物稀釋成濃度為10pmol，分別取每條引物1ul于一干凈的ep管中，加入2.5ulthbuffer(500mmnacl，100mmtris-cl(ph8.0),1mmedta)，補(bǔ)去離子水至總體積25ul充分混勻。將混合物至于沸水中10min然后緩慢降溫至室溫。

4.退火產(chǎn)物與載體的孵育：取退火產(chǎn)物3ul，預(yù)處理的puc57-gfp-amp載體1ul，混合均勻后37℃保溫15min后常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10細(xì)胞，涂布lb/amp抗性平板過夜培養(yǎng)。

5.在藍(lán)光儀下觀察過夜培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子，用記號(hào)筆全出發(fā)光的菌(空載體)，隨機(jī)挑取8個(gè)菌落進(jìn)行pcr驗(yàn)證。

6.陽(yáng)性克隆送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如圖4a-4c所示。

7.基因拼接

7.1基因拼接反應(yīng)程序?yàn)?/p>

7.2基因拼接測(cè)序結(jié)果比對(duì)，見圖5。

實(shí)施例2

puc57-gfp-amp載體的制備方法與實(shí)施例1類似，不再贅述。

1、基因分組(下劃線為與載體退火序列，波浪線為bbsi位點(diǎn)，斜體部分為金門克隆反應(yīng)位點(diǎn))

16128a(747bp)

caagagagaattcccatggcaacaggaactgagaaaaagcaccaagaaaagctttatatccctaagctaaaggttcatcagatcaagctagagctcttttatgaggccggtcatggacaggtggcctttgataacctttctttgagagaggctggtgataagccaagtgatgacatcaaggttgcttcacatcacttagaggagcaaatcgtcctgcctttaaataagcactacctcatggaaatggctgactatcactatcagattgcagcggagtccagcaacattgtgcgcgtggaaaatggtcttttgattcctttgtctcacgggaaaacgcttttagaggtgttggatcaagaggggcaaagagtagcaacagtgccggttgagattttagcagcagaggaccctcaaacaacctccttgatcacaaagtggtgtgaggtgattttgggggctgaaaactttgaccgatcaagtccagctatggtggcattaaaccaaaaactggacgacagtgtgagcaaaaatctagttcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtcctgaggcggaaagaaccagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaaagcttttggcgt

16128b(817bp)

caagagagaattcaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaagatcgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggaagcttttggcgt

16128c(873bp)

caagagagaattcggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgactgatctaatcaaggatcaaagcagcacatacctttggagtgatttggcggatcttcatcaatcgtctcagatgacagccacctgtaggcgcttggaggaaatggcaaggcaggtgagcagcttagcctctaagtattatcaggataaggagctgataagactgatcaaggataaattggcctggctgacgcttaactactatcatccacaaaaggatattgaaggtaaggctaattggtgggattttgaaattggtaccccaagagctattgtcaataccctagcctttctttacccttatgtcactcaagaggagatcaagcgctacactaaagggatttctcactttgttcctaatcctagacaatttcgctcaacccttgtgaatccttttaaggctatcggaggtaaccttgttgatatgggacgaataaagattattgaggctctgttaaggcatgataagaaagcacttcaagacagtatagcagccctagataccttatttgcttttcagcctaataagcttttggcgt

2、設(shè)計(jì)引物合成

3、引物的磷酸化：用去離子水將引物稀釋成50pmol，每組引物分別取0.5ul于單獨(dú)的離心管中，加入10×t4polynucleotidekinasebuffer2ul；t4polynucleotidekinase1ul(neb10u)；atp(neb1mm)；補(bǔ)去離子水至20ul。充分混勻之后將反應(yīng)體系置于37℃反應(yīng)1h。

4、16128-a/b/c，磷酸化引物退火：分別將每組磷酸化引物在50℃條件下保溫10min后置于沸水中10min后緩慢降至室溫。

5、磷酸化產(chǎn)物與載體的連接：取磷酸化產(chǎn)物8ul于一干凈的pcr管中，加入t4dnaligase1ul(neb40u)，加入預(yù)處理的puc57-gfp-amp載體1ul，16℃反應(yīng)1h。

6、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化：取連接差內(nèi)5ul常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10細(xì)胞，涂布lb/amp抗性平板過夜培養(yǎng)。

7、在藍(lán)光儀下觀察過夜培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子，用記號(hào)筆全出發(fā)光的菌(空載體)，隨機(jī)挑取8個(gè)菌落進(jìn)行pcr驗(yàn)證。

8、測(cè)序結(jié)果比對(duì)，如圖6a-6c所示，

9、測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子(16128-a/b/c)分別接種提質(zhì)粒做金門反應(yīng)拼接合成全長(zhǎng)基因。拼接體系和反應(yīng)程序如下：

10、反應(yīng)體系(puc57-kana-gfp為我公司構(gòu)建保存載體，載體用bbsi線性化)

反應(yīng)程序?yàn)?/p>

11、基因拼接測(cè)序結(jié)果比對(duì)

16128測(cè)序結(jié)果見16128測(cè)序比對(duì)示意圖7。

金門反應(yīng)拼接全長(zhǎng)基因示意圖如圖2所示。

上述本申請(qǐng)實(shí)施例中的技術(shù)方案，至少具有如下的技術(shù)效果或優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明基因合成方法不需要基因擴(kuò)增儀，整個(gè)合成過程只需要電熱水壺、水浴鍋等簡(jiǎn)單廉價(jià)的設(shè)備，是一個(gè)能迅速?gòu)?fù)制的生產(chǎn)路線。另外，本發(fā)明設(shè)計(jì)的puc57-gfp-amp載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、載體骨架更符合客戶選擇，背景清晰使用方便，一步合成的小基因可直接發(fā)貨給客戶。本發(fā)明實(shí)施例載體只需要t4dna聚合酶在相應(yīng)保護(hù)堿基存在的條件下處理一次即可，大大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，且無(wú)需轉(zhuǎn)化rosetta(de3)plyss菌株，gfporf帶有prrn組成型啟動(dòng)子，在常見的大腸桿菌top10中也能表達(dá)綠色熒光蛋白，菌體在藍(lán)光儀下呈綠色，可用于反向篩選。

2、本發(fā)明中設(shè)計(jì)引物的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)在70nt甚至更長(zhǎng)，一步合成的典型長(zhǎng)度可以達(dá)到500bp以上，進(jìn)一步擴(kuò)展了合成小基因的范圍，如果待合成的基因在500bp以內(nèi)可以通過提高引物長(zhǎng)度一步合成。3、本發(fā)明實(shí)施例引入t4多聚核苷酸激酶(t4polynucleotidekinase；neb#m0201)和t4nda連接酶(t4dnaligase；neb#m0202)。t4多聚核苷酸激酶在atp存在的條件下能夠催化atp的γ位磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到寡核苷酸鏈(單鏈或者雙鏈dna或者rna)的5’羥基末端，對(duì)引物進(jìn)行磷酸化處理。處理后的磷酸化引物高溫變性低溫退火之后與預(yù)先處理好的puc57-gfp-amp混合于37℃孵育后在t4dna連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，最后轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10(感受態(tài)效價(jià)>108cfu/μgdna)一步合成dna片段，合成的典型長(zhǎng)度在800bp左右。4、如果目的基因比較大，一步合成之后可用金門克隆拼接組裝合成。5、引物之間可以在退火時(shí)互相配對(duì)驗(yàn)證，降低錯(cuò)誤合成的引物被引進(jìn)基因序列的問題，保證了克隆進(jìn)載體基因的正確率。

綜上所述，本發(fā)明基因合成方法不依賴pcr擴(kuò)增，規(guī)避了pcr擴(kuò)增中繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟，極大地提升了人均產(chǎn)能，降低合成的成本；同時(shí)該技術(shù)完美規(guī)避了pcr技術(shù)錯(cuò)誤率高(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明800bp序列一步合成正確率達(dá)到99％以上)，難以擴(kuò)增高度重復(fù)、高gc、高at含量、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等難度序列的缺陷；因其靈活性，能將具有相同或不同來源的基因同步組合合成，構(gòu)建基因突變庫(kù)，是組合生物合成技術(shù)(combinatorialbiosynthesis)的最佳選擇，對(duì)篩選功能藥物等生理活性物質(zhì)，研究生物代謝途徑以及生物進(jìn)化具有非常重要的意義。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。

sequencelisting

<110>武漢金開瑞生物工程有限公司

<120>一種基因合成方法

<130>1

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>3696

<212>dna

<213>escherichiacoli

<400>1

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