本發(fā)明涉及基因工程和發(fā)酵工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種產(chǎn)菊粉內(nèi)切酶的枯草芽孢桿菌jg-1及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：低聚果糖(fructooligosaccharide)又稱果寡糖或蔗果三糖族低聚糖，是一類雙歧桿菌增殖因子，具有低熱、穩(wěn)定、安全無毒等特性。它是一種非消化性低聚糖，不能被動(dòng)物本身分泌的消化酶水解，到達(dá)腸道后可選擇性地被雙歧桿菌、乳酸桿菌利用，產(chǎn)生對動(dòng)物生長有益的有機(jī)酸和必需的維生素等；降低腸內(nèi)ph值，抑制有害菌(如大腸桿菌、梭菌及腐敗菌等)的增殖，減少腸道內(nèi)腐敗性代謝產(chǎn)物的生成，從而提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，改善健康狀況，達(dá)到提高營養(yǎng)物質(zhì)利用率，增強(qiáng)動(dòng)物生產(chǎn)性能的目的。它是公認(rèn)的益生元代表，因而受到廣泛關(guān)注。糖苷水解酶第32家族包括內(nèi)切菊粉酶、外切菊粉酶、蔗糖酶及內(nèi)切β-2,6-果聚糖酶等，主要催化水解含β-2,6果糖苷鍵、β-2,1果糖苷鍵或β-d果糖苷鍵的化合物，在理論研究方面具有一定的意義，在飼料、食品、生物燃料、洗滌、制糖和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。因此，以菊粉為底物，在菊粉內(nèi)切酶的作用下，用微生物法生產(chǎn)果寡糖也備受關(guān)注。目前，寡果糖制造用酶生產(chǎn)菌株使用黑曲霉，將該菌在28℃含有5～10％蔗糖的培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)4天，生產(chǎn)具有果糖轉(zhuǎn)移活性的菌體，這些菌體可以直接使用，也可將酶固定化后使用55-60％蔗糖溶液中每克基質(zhì)添加2-5單位的果糖轉(zhuǎn)移酶，60℃反應(yīng)24h，反應(yīng)后的糖組成為：葡萄糖(36-35％)，蔗糖(10-12％)，蔗果三糖(21-28％)，蔗果四糖(21-24％)，蔗果五糖(3-6％)。寡果糖含量在55-60％之間，(所得產(chǎn)品商品名稱為明治寡糖g)。另外，還可以從所得轉(zhuǎn)移糖混合物中除去單糖和二糖，得到高純度的寡果糖。目前國際上關(guān)于菊糖酶的分子生物學(xué)研究主要集中于菊糖外切酶，對菊糖外切酶的結(jié)構(gòu)以及催化機(jī)制了解較深入。而對于菊糖內(nèi)切酶的研究相對較少，主要局限于酶基因的克隆和異源表達(dá)。大部分的微生物中都含有菊粉外切酶的基因，但是只有少數(shù)微生物體內(nèi)含有內(nèi)切酶的基因，迄今已發(fā)現(xiàn)某些微生物能夠產(chǎn)菊糖內(nèi)切酶，如aspergillusficuum，penicilliumsp.，kluyveromy-cesmarxianus，bacillussmithii，pseudomonassp.，xanthomonasoryzae以及arthrobactersp等菌種，不同來源的菊粉內(nèi)切酶，其酶學(xué)性質(zhì)也不相同。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了能夠利用菊粉生產(chǎn)低聚果糖的枯草芽孢桿菌(bacillsusubtilis)重組菌株。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了上述重組菌株的制備方法。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了上述重組菌株的應(yīng)用。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了一種菊粉內(nèi)切酶的制備方法。技術(shù)方案：為了解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種產(chǎn)菊粉內(nèi)切酶的枯草芽孢桿菌jg-1，該枯草芽孢桿菌jg-1以pma05大腸-枯草穿梭質(zhì)粒為骨架構(gòu)建質(zhì)粒pma05-inu，然后通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進(jìn)bacillsusubtilis168中，通過質(zhì)粒pma05-inu在枯草芽孢桿菌中的卡那霉素抗性篩選標(biāo)記篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子。該表達(dá)菊粉內(nèi)切酶的重組菌株bacillsusubtilisjg-1的菌學(xué)特征如下：枯草芽胞桿菌，是芽胞桿菌屬的一種，單個(gè)細(xì)胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時(shí)，常形成皺醭，廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故命名為枯草芽孢桿菌。本發(fā)明的菊粉內(nèi)切酶基因inu來源于霉味假單胞菌(pseudomonasmucidolens)它的序列在ncbi中可以查到，genebank登記號為af141320.1。序列如下(對應(yīng)于序列表seqidno：3)：atgcacaacacagaagacacaggtcttatcgcatactggtctttcgacgaagaaagtggtaaaacagctgttgacgtaatcggaaagatgaacgacagcatcgactacgttttcaaccacgcaagattcaaggcaagtagcgatccacaaagaagaaagggaatcagcggtaacgcattgttgttcgacggatacagtacgtggatcaagagaagcgcagatcaaatcggaaagccagaaaacgctttgacactggaagcatgggtagcaccaagaagttacgaatggggagatgaacaaaggcttagtgcaatcgtaaaccaacacgacagggaaaagaaggagggattcatcctgggtatgtacagacacggaacttggtctttgcaacttggacttgaccatgagtggatcgaagtttggagtgaggatcatccacttcctaagaacgagtggtcttacgtggtagctacttacgacaagaagacaagcatgctgaagcttgcatgcccatctatgttgaagctttacctgaacggagtagaggtggcatcaaagcaaacaacggcacattcaacgatcacgccatcaagacaagaccttctgatcggtaaaaacaaccaggcagtagtactcgcaggagtattctcacttaacatgttcaacggcctgatcgacgagatcaagatttacaaccgagccctgtcatcagacgagattgcttcaagcttccacagatacctggtaccttacggaggaaaaataccgtcaattccgtatgaccacctgaaactcgaccgttcactgctggctgatgataggcatcgaccacaatatcatgtatcaccacctgctcattggatgaacgaaccacatgctccaatttatttcaacggccagtatcacctcttttatcagcacaatccgcagggaccttattggcaccaaattcattgggggcattgggtgtctgacgatttggtgcattggcgtgatcttcctgttgctttgtctcctgaaaaaaatgccgttgaccctgacggagattggtcaggatctgctacttatgacgaacatggactgcctgttctgttttttaccgctggagatgattcagctaaacctaatcagcgagtcggtcttgcccgttcaacatttgcccaagatggagataatgacctggttcattgggttaaacatccgacgcctgttgtggtgcaacaacagggagttggaaaatttggcgactttcgtgatccttttgtctggaaagatggcgatacctggtatatgctcgtcggttctggaacggatggtgaaggtggtacagcgttagcctatacatctaaaaatctgacggagtgggagtatcgtggtcctttttatatttcggatcataaaaattatccgtatctggggaaagtctgggagctgccggtcctgctcccgctcggtaaagataaaaaaggccatgataaacatgtctttctcatttccccggtcggggccggtgcggatgttgaagttttttattggattggcacgtttgataaagagcagtttcgctttattccggatcagaatgagccgcagctcattgatgtcggcgattcgcattttacggggccgtctggcatggttgatccgaatactgggcgtaaaatactctttacaatagcgcagggggaacggactccggcgttagattattctgcgggctgggcgcataatgggggcttaccggtgagcctttcgttacgggaagatgggcgcttgggcgtggaaccgattgaagaattgaaatcgcttcgcggcaaaaaacttgtctcctttacaaaaaaatcggcggaagaagcgaatgatttacttacaaatgtgaaaggggatatgttagaaattatacttgaacttgaaccgggcacagccaaacaatttggcataaaagtccggcgctcccctggcggcgaagaggagactttattatattataataccgaagcgtccacattgaatgtgaatcggatgaaaaccaccttggataattttgaacggagcaaaggcattcagggcggcaaattggagttaaatggcgaaaatttaaaattacatatttatttagatcgctccatgattgaagcctatgcgaatgggttaaaaagcttaaccacccgcgcctatccgagccggccggattccttaggcttacagatttggggggatggcagcgtcagcgtcaaatccatggaagtgtgggaaatgaatagcgcgtttggcccgacggtgtcggcgtatattccggaacaacatgccgatggcgtgcagacaaaataa本
發(fā)明內(nèi)容還包括上述的產(chǎn)菊粉內(nèi)切酶的枯草芽孢桿菌jg-1的制備方法，包括以下步驟：1)菊粉內(nèi)切酶編碼基因的獲得：選定霉味假單胞菌中的菊粉內(nèi)切酶的cds序列，設(shè)計(jì)引物，調(diào)取菊粉內(nèi)切酶的酶基因inu；所述引物序列如seqidno:1和seqidno:2所示；2)表達(dá)載體pma05-inu的構(gòu)建：以大腸-枯草穿梭質(zhì)粒pma05為質(zhì)粒骨架，利用限制性內(nèi)切酶ndei和bamhi雙切質(zhì)粒pma05，隨后采用一步克隆的方法將目的片段和雙酶切質(zhì)粒連接，形成質(zhì)粒pma05-inu；3)重組菌株的構(gòu)建：將步驟2)構(gòu)建驗(yàn)證正確的質(zhì)粒pma05-inu通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢桿菌中，通過卡那霉素抗性篩選標(biāo)記篩選出正確的轉(zhuǎn)化子即為重組菌株；4)發(fā)酵產(chǎn)酶驗(yàn)證：采用搖瓶培養(yǎng)重組菌株，測定菊粉內(nèi)切酶的活力，獲得高效表達(dá)重組菌株的枯草芽孢桿菌jg-1。其中，上述卡那霉素抗生素的篩選濃度為25μg/ml。其中，上述步驟4)的培養(yǎng)溫度為32℃，200rpm，發(fā)酵時(shí)間為24h。其中，上述培養(yǎng)在250ml搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，32℃培養(yǎng)24h產(chǎn)酶量達(dá)到最大。本
發(fā)明內(nèi)容還包括上述的產(chǎn)菊粉內(nèi)切酶的枯草芽孢桿菌jg-1在制備菊粉內(nèi)切酶和低聚果糖中的應(yīng)用。一種菊粉內(nèi)切酶和低聚果糖的制備方法，包括以下步驟：4℃條件下，將所述的枯草芽孢桿菌jg-1發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵液，9000rpm離心菌體細(xì)胞，倒掉上清，再用ph為7.4的磷酸緩沖液洗滌菌體2-3次，最后用相同體積的緩沖懸浮細(xì)胞，采用超聲破碎儀破碎細(xì)胞，4℃條件下，離心破碎液10min，獲得破碎后的上清液即為菊粉內(nèi)切酶。菊粉內(nèi)切酶的酶活測定：用dns測還原糖法測菊粉內(nèi)切酶的酶活，由于發(fā)生顯色反應(yīng)，通過測定吸光度來表征菊粉內(nèi)切酶的酶活。本發(fā)明所構(gòu)建的重組菌bacillsusubtilisjg-1的應(yīng)用是基于食品安全微生物產(chǎn)菊粉內(nèi)切酶并催化產(chǎn)低聚果糖(fos)。有益效果：本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1：枯草芽孢桿菌是公認(rèn)的食品安全微生物，不會(huì)存在大腸桿菌產(chǎn)低聚果糖的安全隱患；2：可以獲得dp3，dp4，dp5聚合度的低聚果糖；3：枯草芽孢桿菌在產(chǎn)菊粉內(nèi)切酶方面比其他工程菌有更高的優(yōu)勢。4、菊粉內(nèi)切酶的酶活最高酶活為20.16u/ml。附圖說明圖1重組質(zhì)粒pma05-inu的構(gòu)建過程；圖2重組質(zhì)粒pma05-inu酶切驗(yàn)證圖；圖a中泳道1為分子量為7500的dnamaker，泳道2為單酶切圖；泳道3為雙酶切；圖b中泳道1為maker，泳道2為單酶切驗(yàn)證，泳道3為雙酶切驗(yàn)證；圖3重組菌bacillsusubtilisjg-1的發(fā)酵產(chǎn)酶曲線；利用發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，把重組菌bacillsusubtilisjg-1在32℃發(fā)酵，每隔4h取樣200μl，12000rpm離心1min，用200μl的0.02mm，ph為7.4的pbs緩沖懸浮細(xì)胞，并進(jìn)行超聲破碎后，離心后，200μl酶液和800μl2％的菊粉30min滅活，取25μl加50μldns，在加入550μlro水，用酶標(biāo)儀測540nm處吸光度，進(jìn)而計(jì)算比酶活u/ml，1u定義為反應(yīng)生成1μmol/min還原糖所需要的酶量。橫坐標(biāo)為時(shí)間(h)，發(fā)酵時(shí)間，每隔4h取樣，右側(cè)縱坐標(biāo)是比酶活(u/ml)，比酶活越高，說明其200μl全細(xì)胞破碎液中產(chǎn)酶越高；左側(cè)縱坐標(biāo)為菌體濃度，單位是cell/ml。圖4三糖、四糖、五糖的標(biāo)品液相圖；圖4中三個(gè)峰依次是聚合度為dp5，dp4，dp3；圖5枯草芽孢桿菌表達(dá)的菊粉內(nèi)切酶催化菊芋菊粉生成果寡糖的轉(zhuǎn)化液的液相圖；利用高效液相色譜法檢測低聚果糖的聚合度，將菊粉內(nèi)切酶催化菊粉后的轉(zhuǎn)化液，取24h轉(zhuǎn)化液，稀釋，走液相色譜柱，鈣柱，橫坐標(biāo)代表出峰時(shí)間t(min)，縱坐標(biāo)代表峰高(μriu)，峰面積代表不同聚合度低聚果糖的含量；根據(jù)液相性質(zhì)，聚合度高的先出峰，圖中3，4，5峰分別代表聚合度為5，4，3的低聚果糖；圖6酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線；橫坐標(biāo)代表果糖濃度，單位為g/l，縱坐標(biāo)代表吸光度，單位為l/(g.cm)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。本發(fā)明實(shí)施例所使用的試劑菊粉天根生化科技(北京)有限公司一步克隆酶南京愛必夢生物有限公司ndei,bamhitakara大連寶生物有限公司makerdl15000takara大連寶生物有限公司k2hpo4上海凌峰化學(xué)試劑有限公司kh2po4上海凌峰化學(xué)試劑有限公司dns上海潤成生物有限公司實(shí)施例1構(gòu)建重組質(zhì)粒載體pma05-inu通過基因挖掘技術(shù)，確定目的基因?yàn)閬碜杂诿刮都賳伟械木辗蹆?nèi)切酶，設(shè)計(jì)一步克隆引物，上游引物：aaaaggagcgatttacatatgatgcacaacacagaagacacagg下游引物：gagctcgactctagaggatccttattttgtctgcacgccatcg；將目的基因pcr調(diào)取，用限制性內(nèi)切酶ndei和bamhi雙切質(zhì)粒載體pma05，回收純化后計(jì)算濃度，確定連接體系，根據(jù)同源重組的原理，采用一步克隆的方法30℃冰上連接，將連接好的反應(yīng)液用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進(jìn)dh5α中，涂布到含有100μg/ml氨芐抗生素的固體lb平板上，37℃過夜培養(yǎng)12h，篩選轉(zhuǎn)化子(來源于南京工業(yè)大學(xué)徐虹教授課題組惠贈(zèng)的質(zhì)粒pma05是一個(gè)大腸-枯草穿梭質(zhì)粒，在dh5α中顯示氨芐的抗性)，挑4-6個(gè)菌轉(zhuǎn)接到含有100μg/ml氨芐抗生素的小黑瓶中，37℃搖床200rpm培養(yǎng)8h，保存菌種后剩余的細(xì)胞液離心收集細(xì)胞，用提質(zhì)粒試劑盒抽提質(zhì)粒，將抽提后的質(zhì)粒用ndei和bamhi雙酶切(10μl＝5μl質(zhì)粒+1μl10*kbuffer+0.5μlndei+0.5μlbamhi+3μlddh2o)和pcr驗(yàn)證，雙酶切1h后，通過核酸電泳驗(yàn)證雙酶切正確，電泳圖如附圖2a，pcr驗(yàn)證有目的條帶2331bp，構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pma05-inu。單酶切的體系為(10μl＝5μl質(zhì)粒+1μl10*kbuffer+1μlbamhi+3μlddh2o)實(shí)施例2：重組載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(bacillsusubtilis)由于枯草表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法用的都是化學(xué)轉(zhuǎn)化法，枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化效率高一些，首先制作枯草芽孢桿菌感受態(tài)，最后分裝成200μl/管，將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒取5μl直接加入到200μl枯草芽孢桿菌感受態(tài)中，37℃，200rpm搖菌90min，最后涂平板，卡那霉素抗生素的濃度為20μg/ml，37℃過夜培養(yǎng)，挑轉(zhuǎn)化子，并接種到含有卡納抗生素的液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖菌12h，后續(xù)按照實(shí)施例1中步驟進(jìn)行酶切驗(yàn)證，電泳圖如附圖2b：泳道1為maker，泳道2為單酶切驗(yàn)證，泳道3為雙酶切驗(yàn)證。實(shí)施例3：jg-1發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化將篩選得到的陽性克隆子bacillsusubtilisjg-1，接種到500ml產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)菊粉內(nèi)切酶，初始最高比酶活約為1.2u/ml。對b.subtilisjg-1產(chǎn)菊粉內(nèi)切酶條件進(jìn)行優(yōu)化，將jg-1接種到500ml搖瓶中，在32℃的條件下發(fā)酵，每隔4h取樣，取200μl發(fā)酵液和800μl2％的菊粉反應(yīng)30min，測菊粉內(nèi)切酶酶活力，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，重組菌jg-1的菌體濃度(od600nm)達(dá)到最大值，為2.5，在4℃條件下，離心，9000rpm，離心10min，獲得菌體細(xì)胞，用200μl0.02mm的磷酸鹽緩沖液pbs(ph為7.4)洗滌菌體兩次，最后用相同體積(200μl)的pbs重懸菌體，采用超聲破碎儀破碎細(xì)胞，4℃，離心10min，獲得含有菊粉內(nèi)切酶的上清液，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，當(dāng)發(fā)酵至24h時(shí)，優(yōu)化后重組菌bacillsusubtilisjg-1的比酶活最高為20.16u/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖3。最終確定bacillsusubtilisjg-1的產(chǎn)酶發(fā)酵條件為：1％的接種量，發(fā)酵溫度為32℃，200rpm，發(fā)酵時(shí)間為24h。實(shí)施例4：菊粉內(nèi)切酶的酶活的檢測將200μl菊粉內(nèi)切酶的上清液和800μl2％的菊粉反應(yīng)30min后的反應(yīng)液，放在100℃沸水中煮沸10min滅活，12000rpm離心1min，取25μl反應(yīng)上清液與50μldns沸水中煮沸10min，發(fā)生顯色反應(yīng)，再加550μlro水(優(yōu)普純水儀)稀釋，用酶標(biāo)儀，測540nm下的吸光值，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算酶活，酶活定義為1u等于1min生成1μmol還原糖所需的酶量。優(yōu)化后菊粉內(nèi)切酶最高比酶活為20.16u/ml。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6。實(shí)施例5：菊粉內(nèi)切酶催化菊粉水解產(chǎn)低聚果糖取細(xì)胞破碎液上清2ml加入到8ml100g/l的用pbs配制的菊粉溶液中，55℃，200rpm，水浴搖床中反應(yīng)，每隔4h取樣200μl，稀釋10倍后，樣品過0.22μm濾膜處理，利用ca柱，走高效液相色譜，條件為：兩根ca柱串聯(lián)，柱溫為80℃，流動(dòng)相為純水，流速為0.4ml/min，檢測器為示差檢測器ri。取催化20h的樣品處理后走液相，確定產(chǎn)物主要為dp3，dp4，dp5聚合度的低聚果糖。結(jié)果如圖5。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>鹽城工學(xué)院<120>一種產(chǎn)菊粉內(nèi)切酶的枯草芽孢桿菌ng-1及其制備方法和應(yīng)用<130>sg20170524001<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>44<212>dna<213>上游引物<400>1aaaaggagcgatttacatatgatgcacaacacagaagacacagg44<210>2<211>43<212>dna<213>下游引物<400>2gagctcgactctagaggatccttattttgtctgcacgccatcg43<210>3<211>2331<212>dna<213>于霉味假單胞菌<400>3atgcacaacacagaagacacaggtcttatcgcatactggtctttcgacgaagaaagtggt60aaaacagctgttgacgtaatcggaaagatgaacgacagcatcgactacgttttcaaccac120gcaagattcaaggcaagtagcgatccacaaagaagaaagggaatcagcggtaacgcattg180ttgttcgacggatacagtacgtggatcaagagaagcgcagatcaaatcggaaagccagaa240aacgctttgacactggaagcatgggtagcaccaagaagttacgaatggggagatgaacaa300aggcttagtgcaatcgtaaaccaacacgacagggaaaagaaggagggattcatcctgggt360atgtacagacacggaacttggtctttgcaacttggacttgaccatgagtggatcgaagtt420tggagtgaggatcatccacttcctaagaacgagtggtcttacgtggtagctacttacgac480aagaagacaagcatgctgaagcttgcatgcccatctatgttgaagctttacctgaacgga540gtagaggtggcatcaaagcaaacaacggcacattcaacgatcacgccatcaagacaagac600cttctgatcggtaaaaacaaccaggcagtagtactcgcaggagtattctcacttaacatg660ttcaacggcctgatcgacgagatcaagatttacaaccgagccctgtcatcagacgagatt720gcttcaagcttccacagatacctggtaccttacggaggaaaaataccgtcaattccgtat780gaccacctgaaactcgaccgttcactgctggctgatgataggcatcgaccacaatatcat840gtatcaccacctgctcattggatgaacgaaccacatgctccaatttatttcaacggccag900tatcacctcttttatcagcacaatccgcagggaccttattggcaccaaattcattggggg960cattgggtgtctgacgatttggtgcattggcgtgatcttcctgttgctttgtctcctgaa1020aaaaatgccgttgaccctgacggagattggtcaggatctgctacttatgacgaacatgga1080ctgcctgttctgttttttaccgctggagatgattcagctaaacctaatcagcgagtcggt1140cttgcccgttcaacatttgcccaagatggagataatgacctggttcattgggttaaacat1200ccgacgcctgttgtggtgcaacaacagggagttggaaaatttggcgactttcgtgatcct1260tttgtctggaaagatggcgatacctggtatatgctcgtcggttctggaacggatggtgaa1320ggtggtacagcgttagcctatacatctaaaaatctgacggagtgggagtatcgtggtcct1380ttttatatttcggatcataaaaattatccgtatctggggaaagtctgggagctgccggtc1440ctgctcccgctcggtaaagataaaaaaggccatgataaacatgtctttctcatttccccg1500gtcggggccggtgcggatgttgaagttttttattggattggcacgtttgataaagagcag1560tttcgctttattccggatcagaatgagccgcagctcattgatgtcggcgattcgcatttt1620acggggccgtctggcatggttgatccgaatactgggcgtaaaatactctttacaatagcg1680cagggggaacggactccggcgttagattattctgcgggctgggcgcataatgggggctta1740ccggtgagcctttcgttacgggaagatgggcgcttgggcgtggaaccgattgaagaattg1800aaatcgcttcgcggcaaaaaacttgtctcctttacaaaaaaatcggcggaagaagcgaat1860gatttacttacaaatgtgaaaggggatatgttagaaattatacttgaacttgaaccgggc1920acagccaaacaatttggcataaaagtccggcgctcccctggcggcgaagaggagacttta1980ttatattataataccgaagcgtccacattgaatgtgaatcggatgaaaaccaccttggat2040aattttgaacggagcaaaggcattcagggcggcaaattggagttaaatggcgaaaattta2100aaattacatatttatttagatcgctccatgattgaagcctatgcgaatgggttaaaaagc2160ttaaccacccgcgcctatccgagccggccggattccttaggcttacagatttggggggat2220ggcagcgtcagcgtcaaatccatggaagtgtgggaaatgaatagcgcgtttggcccgacg2280gtgtcggcgtatattccggaacaacatgccgatggcgtgcagacaaaataa2331當(dāng)前第1頁12