技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)中蝦青素的超臨界二氧化碳流體萃取方法，同時(shí)還提供轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)中類胡蘿卜素的超臨界二氧化碳流體萃取方法。

背景技術(shù)：
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蝦青素是自然界中抗氧化活性最強(qiáng)的生物活性物質(zhì)，隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，以植物尤其是經(jīng)濟(jì)作物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)蝦青素已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，蝦青素是分子結(jié)構(gòu)獨(dú)特的酮式類胡蘿卜素，是自然界中抗氧化活性最強(qiáng)的生物活性物質(zhì)，具有抗輻射、抗衰老、抗腫瘤和預(yù)防心血管等疾病的功效，已應(yīng)用于化妝品、保健品和水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面。商業(yè)化的天然蝦青素主要來源于雨生紅球藻，該藻為光合自養(yǎng)綠藻，對(duì)環(huán)境敏感、生長慢、難以實(shí)現(xiàn)高密度的細(xì)胞生長，這是目前國內(nèi)外無法突破其產(chǎn)量瓶頸以及蝦青素價(jià)格昂貴的主要原因。植物因缺乏類胡蘿卜素酮化酶(bkt)而不合成蝦青素，表達(dá)外源的bkt可能使植物尤其是經(jīng)濟(jì)作物成為高效的蝦青素生產(chǎn)工廠。黃俊潮等通過基因工程技術(shù)將綠藻中篩選和分離到能催化植物細(xì)胞中β-胡蘿卜素和玉米黃素成蝦青素的酮化酶和羥化酶基因轉(zhuǎn)入野生型番茄植株中，首次獲得了一種富含蝦青素的轉(zhuǎn)基因工程番茄，其成熟果實(shí)中蝦青素的含量高達(dá)16.1mg/g,克服了植物難以積累高含量蝦青素的難題，以此種轉(zhuǎn)基因工程番茄作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)蝦青素具有極大的商業(yè)前景。

蝦青素對(duì)光、溫比較敏感，在提取加工過程中,光、熱、氧等很多因素可促進(jìn)或加速蝦青素發(fā)生降解；且傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法因殘留物無法完全去除，而對(duì)人體造成傷害，破壞機(jī)體免疫系統(tǒng),引起癌癥等疾病的發(fā)生。超臨界二氧化碳流體萃取是一種新型的萃取技術(shù)，具有萃取和分離的雙重作用，萃取過程物料無相變因而節(jié)能明顯，且工藝流程簡單，萃取效率高，無有機(jī)溶劑殘留，產(chǎn)品質(zhì)量好，無環(huán)境污染。本文對(duì)超臨界二氧化碳流體萃取技術(shù)從蝦青素工程番茄中提取蝦青素的工藝做了初步的探討，同時(shí)對(duì)提取物中具有高利用價(jià)值的番茄紅素、β胡蘿卜素做了分析，為利用轉(zhuǎn)基因工程番茄產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)蝦青素奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。目前，現(xiàn)有技術(shù)中未見有利用超臨界二氧化碳流體萃取技術(shù)從轉(zhuǎn)基因工程番茄中提取蝦青素的方法的報(bào)道。也沒有轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)中類胡蘿卜素的超臨界二氧化碳流體萃取方法的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，提供一種利用超臨界二氧化碳流體萃取技術(shù)從轉(zhuǎn)基因工程番茄中提取蝦青素的方法，同時(shí)提供從轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)中類胡蘿卜素的超臨界二氧化碳流體萃取方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)中蝦青素的超臨界二氧化碳流體萃取方法，該方法包括取預(yù)先過篩的蝦青素工程番茄果實(shí)干粉,調(diào)節(jié)系統(tǒng)溫度和壓力至設(shè)定值,待萃取釜的溫度及壓力達(dá)到設(shè)定值且穩(wěn)定后，進(jìn)行1h的靜態(tài)萃取；靜態(tài)萃取結(jié)束后打開平流泵，以1.0g/min將夾帶劑輸送到到設(shè)備中去，夾帶劑與二氧化碳?xì)怏w的混合流體進(jìn)入萃取釜，開始動(dòng)態(tài)萃取，然后進(jìn)行皂化。

如所述的轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)中蝦青素的超臨界二氧化碳流體萃取方法，該方法進(jìn)一步采用皂化手段將蝦青素酯全部轉(zhuǎn)化為游離態(tài)蝦青素，將蝦青素工程番茄的萃取液進(jìn)行皂化，取1ml提取液，利用濃縮儀濃縮干，溶于1ml乙醚，加入1mlkohmeoh混勻，0℃黑暗環(huán)境中反應(yīng)15min，加入2ml10％nacl混勻，2000g離心2min，移除水相，用2ml10％nacl洗兩遍，溶于1ml丙酮溶液，抽濾后上樣測定色素含量。

如所述的轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)中蝦青素的超臨界二氧化碳流體萃取方法，取預(yù)先過篩的番茄果實(shí)干粉,調(diào)節(jié)系統(tǒng)溫度至50℃，萃取壓力35mpa,待萃取釜的溫度及壓力達(dá)到設(shè)定值且穩(wěn)定后，進(jìn)行1h的靜態(tài)萃??；靜態(tài)萃取結(jié)束后打開平流泵，將無水乙醇輸送到到設(shè)備中去，無水乙醇與二氧化碳?xì)怏w的混合流體進(jìn)入萃取釜，開始動(dòng)態(tài)萃取，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間為2h。

轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)中的類胡蘿卜素超臨界二氧化碳流體萃取方法，該方法包括取預(yù)先過篩的番茄果實(shí)干粉,調(diào)節(jié)系統(tǒng)溫度至50℃，萃取壓力35mpa,待萃取釜的溫度及壓力達(dá)到設(shè)定值且穩(wěn)定后，進(jìn)行1h的靜態(tài)萃?。混o態(tài)萃取結(jié)束后打開平流泵，將無水乙醇輸送到到設(shè)備中去，無水乙醇與二氧化碳?xì)怏w的混合流體進(jìn)入萃取釜，開始動(dòng)態(tài)萃取，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間為2h。

如所述的轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)中的類胡蘿卜素超臨界二氧化碳流體萃取方法，該方法進(jìn)一步對(duì)類胡蘿卜素含量進(jìn)行定量測定，所述的類胡蘿卜素為蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素，其定量測定方法采用：準(zhǔn)確稱取蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品各5mg混合后用丙酮溶解并定容至100ml，取1ml，5ml，10ml混合溶解液用丙酮分別定容至50ml，制成1ug/ml，5ug/ml,10ug/ml標(biāo)準(zhǔn)品混合樣，利用uplc上樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素的含量，所述的uplc方法為：流速：1ml/min；進(jìn)樣量：5ul；0-1.0min：水：20％，乙腈：60％，異丙醇：5％，甲醇：15％；1.00-2.00min：水：0％，乙腈：80％，異丙醇：5％，甲醇：15％；2.00-8.00min：水：0％，乙腈：80％，異丙醇：5％，甲醇：15％；

轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)中番茄紅素的超臨界二氧化碳流體萃取方法，該方法包括取預(yù)先過篩的番茄果實(shí)干粉,調(diào)節(jié)系統(tǒng)溫度至50℃，萃取壓力35mpa,待萃取釜的溫度及壓力達(dá)到設(shè)定值且穩(wěn)定后，進(jìn)行1h的靜態(tài)萃??；靜態(tài)萃取結(jié)束后打開平流泵，將無水乙醇輸送到到設(shè)備中去，無水乙醇與二氧化碳?xì)怏w的混合流體進(jìn)入萃取釜，開始動(dòng)態(tài)萃取，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間為2h。

轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)中β胡蘿卜素的超臨界二氧化碳流體萃取方法，該方法包括取預(yù)先過篩的番茄果實(shí)干粉,調(diào)節(jié)系統(tǒng)溫度至50℃，萃取壓力

35mpa,待萃取釜的溫度及壓力達(dá)到設(shè)定值且穩(wěn)定后，進(jìn)行1h的靜態(tài)萃??；靜態(tài)萃取結(jié)束后打開平流泵，將無水乙醇輸送到到設(shè)備中去，無水乙醇與二氧化碳?xì)怏w的混合流體進(jìn)入萃取釜，開始動(dòng)態(tài)萃取，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間為2h。

本發(fā)明是利用超臨界二氧化碳流體萃取技術(shù)從轉(zhuǎn)基因工程番茄中提取蝦青素。在發(fā)明中，萃取溫度50℃，萃取壓力35mpa，萃取2h的情況下，蝦青素的提取率可達(dá)95％，此方法用料安全，提取率高，非常適合轉(zhuǎn)基因工程番茄蝦青素的提取。此外，轉(zhuǎn)基因工程番茄中含有高營養(yǎng)價(jià)值的番茄紅素及β胡蘿卜素等類胡蘿卜素，在蝦青素的最佳提取條件下，番茄紅素提取率為82％，β胡蘿卜素提取率為89％。本研究為轉(zhuǎn)基因工程番茄產(chǎn)業(yè)化提取蝦青素奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

附圖說明：

圖1不同夾帶劑對(duì)蝦青素提取率的影響；

圖2萃取溫度對(duì)蝦青素提取率的影響；

圖3萃取壓力對(duì)蝦青素提取率的影響；

圖4萃取時(shí)間對(duì)蝦青素提取率的影響；

圖5轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)類胡蘿卜素色譜圖。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。

實(shí)施例1：

材料和方法

材料和設(shè)備：

無水乙醇,75％乙醇，乙酸乙酯，丙酮，正己烷均為國產(chǎn)分析純；異丙醇、乙腈、甲醇為德國fisher色譜純；超臨界二氧化碳流體萃取裝置,美國waters(tharsfe)；超高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司，1290infinity；色譜柱，美國安捷倫科技有限公司，eclipseplusc18rrhd1.8μm；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,東京理化，eyelen-1100；分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，tp-213。

番茄果實(shí)干粉：蝦青素工程番茄(黃俊潮等(huangjc等，2013)通過基因工程方法將綠藻中篩選和分離到能催化植物細(xì)胞中β-胡蘿卜素和玉米黃素成蝦青素的酮化酶和羥化酶基因轉(zhuǎn)入野生型番茄植株(cv.uc82b)中，得到的轉(zhuǎn)基因番茄(已于2014年5月14日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為：cgmccno9223號(hào)，分類命名：蝦紅1號(hào)轉(zhuǎn)基因番茄。)f4番茄干粉，過篩200目。

方法：

超臨界二氧化碳流體萃取方法：每次取預(yù)先過篩的蝦青素工程番茄果實(shí)干粉200g,調(diào)節(jié)系統(tǒng)溫度和壓力至設(shè)定值,待萃取釜的溫度及壓力達(dá)到設(shè)定值且穩(wěn)定后，進(jìn)行1h的靜態(tài)萃??；靜態(tài)萃取結(jié)束后打開平流泵，以1.0g/min將夾帶劑輸送到到設(shè)備中去，夾帶劑與二氧化碳?xì)怏w的混合流體進(jìn)入萃取釜，開始動(dòng)態(tài)萃取。本研究將對(duì)萃取壓力、萃取溫度、夾帶劑、萃取時(shí)間進(jìn)行考察，根據(jù)蝦青素的提取率確定最佳萃取條件，在考察一個(gè)參數(shù)時(shí)，設(shè)定其他參數(shù)不變。

蝦青素皂化方法：蝦青素在轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中一部分是以蝦青素酯的形式存在，因此需要采用皂化手段將蝦青素酯全部轉(zhuǎn)化為游離態(tài)蝦青素。具體方法是：取1ml超臨界二氧化碳流體萃取方法所得蝦青素萃取液，利用濃縮儀濃縮干，溶于1ml乙醚，加入1mlkohmeoh混勻，0℃黑暗環(huán)境中反應(yīng)15min，加入2ml10％nacl混勻，2000g離心2min，移除水相，用2ml10％nacl洗兩遍，溶于1ml丙酮溶液，抽濾后上樣測定色素含量。

蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素的定量方法如下：準(zhǔn)確稱取蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品各5mg混合后用丙酮溶解并定容至100ml，取1ml，5ml，10ml混合溶解液用丙酮分別定容至50ml，制成1ug/ml，5ug/ml,10ug/ml標(biāo)準(zhǔn)品混合樣，利用uplc上樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素的含量。uplc方法：流速：1ml/min；進(jìn)樣量：5ul；0-1.0min：水：20％，乙腈：60％，異丙醇：5％，甲醇：15％；1.00-2.00min：水：0％，乙腈：80％，異丙醇：5％，甲醇：15％；2.00-8.00min：水：0％，乙腈：80％，異丙醇：5％，甲醇：15％；

結(jié)果與分析

不同夾帶劑對(duì)蝦青素提取率的影響：

在超臨界二氧化碳流體萃取過程中，考察夾帶劑的影響時(shí)，選定其他參數(shù)為：萃取溫度35℃，萃取壓力35mpa，萃取時(shí)間3h。分別用50％乙醇，75％乙醇、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯作為夾帶劑進(jìn)行試驗(yàn)。測定蝦青素提取率，結(jié)果如圖1。

由圖1可以看出，用無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯作為夾帶劑時(shí)，蝦青素提取率均較高。這說明，在超臨界狀態(tài)下，二氧化碳流體的極性非常小，而夾帶劑的加入，特別是高極性的夾帶劑，有利于蝦青素溶解于超臨界二氧化碳流體中。但丙酮、乙酸乙酯是有機(jī)溶劑，殘留難以完全去除，而無水乙醇不但安全，而且成本低，提取率相對(duì)較高，因此可以選擇無水乙醇作為最佳夾帶劑。

萃取溫度對(duì)蝦青素提取率的影響：

在超臨界二氧化碳流體萃取過程中，考察溫度的影響時(shí)，選定其他參數(shù)為：萃取壓力35mpa，萃取時(shí)間3h，夾帶劑無水乙醇，在此實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定溫度30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃。測定蝦青素提取率，結(jié)果如圖2。

由圖2可以看出，蝦青素的提取率隨溫度的升高而升高，溫度為50℃時(shí)達(dá)到最大，之后，提取率隨溫度的升高而降低。這可能由于，當(dāng)溫度升高，蒸氣壓增大，使蝦青素在超臨界二氧化碳流體中的溶解度增大，但當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)由于游離態(tài)蝦青素在高溫環(huán)境下容易受熱分解從而導(dǎo)致提取率降低。因此，超臨界二氧化碳流體萃取蝦青素的最佳溫度為50℃。

萃取壓力對(duì)蝦青素提取率的影響：

在超臨界二氧化碳流體萃取過程中，考察壓力的影響時(shí)，選定其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：溫度50℃，夾帶劑無水乙醇，萃取時(shí)間3h，，在此實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定壓力10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃。測定蝦青素提取率，結(jié)果如圖3。

由圖3可以看出，蝦青素的提取率隨著萃取壓力的增高而增加，壓力35mpa時(shí)，提取率為90％，壓力40mpa時(shí)，提取率為92％。這說明當(dāng)壓力增高，流體密度增加，引起萃取物在超臨界二氧化碳流體中的溶解度提高，致使萃取蝦青素提取率增加。雖然壓力越高，越有利于提取率的提高，但由于實(shí)驗(yàn)設(shè)備限制，并且在生產(chǎn)應(yīng)用中，壓力的過高會(huì)導(dǎo)致設(shè)備壽命降低，增加運(yùn)營成本，因此采用35mpa為最佳萃取壓力。

萃取時(shí)間對(duì)蝦青素提取率的影響：

在超臨界二氧化碳流體萃取過程中，考察萃取時(shí)間的影響時(shí)，選定其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：萃取溫度50℃，萃取壓力35mpa，夾帶劑為無水乙醇；分別萃取1.0h，1.5h，2.0h，2.5h，3.0h，3.5h，4.0h。測定蝦青素提取率，結(jié)果如圖4。

由圖4可以看出，蝦青素的提取率隨著萃取時(shí)間的增加而增加，2.5h時(shí)提取率達(dá)到最大，在4h時(shí)提取率急劇下降，這可能是由于熱敏性的蝦青素在長時(shí)間處于萃取溫度50℃，35mpa的條件下，蝦青素受熱分解造成的。因此2.5h為最佳萃取時(shí)間。

番茄果實(shí)中類胡蘿卜素含量比較分析：

在超臨界二氧化碳流體萃取過程中，在考察果實(shí)中類胡蘿卜素含量及提取率時(shí)，設(shè)定實(shí)驗(yàn)參數(shù)為蝦青素的最佳提取條件：萃取溫度50℃，萃取壓力35mpa，無水乙醇萃取2h，分別計(jì)算蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素的含量及提取率。

從圖5、表1可以看出，轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)中不僅含有蝦青素，還有番茄紅素及β胡蘿卜素。蝦青素的提取率為95％，含量為1.90mg/g干重，番茄紅素提取率為82％，含量為0.74mg/g干重，β胡蘿卜素的提取率為89％，含量為0.85mg/g干重。

表1轉(zhuǎn)基因工程番茄果實(shí)類胡蘿卜素含量

本發(fā)明的最佳技術(shù)方案：

取預(yù)先過篩的番茄果實(shí)干粉200g,調(diào)節(jié)系統(tǒng)溫度至50℃，萃取壓力35mpa,待萃取釜的溫度及壓力達(dá)到設(shè)定值且穩(wěn)定后，進(jìn)行1h的靜態(tài)萃??；靜態(tài)萃取結(jié)束后打開平流泵，將無水乙醇輸送到到設(shè)備中去，無水乙醇與二氧化碳?xì)怏w的混合流體進(jìn)入萃取釜，開始動(dòng)態(tài)萃取，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間為2h，蝦青素的提取率為95％。在此萃取條件下萃取蝦青素的同時(shí)，本發(fā)明同時(shí)還得到高價(jià)值的番茄紅素、β胡蘿卜素，其提取率分別為82％和89％。