本公開尤其涉及用于遞送編碼嵌合蛋白的核酸的組合物和方法，所述嵌合蛋白可用于治療疾病或病癥，例如為用于癌癥、自身免疫和炎性病癥的免疫治療。優(yōu)先權(quán)本技術(shù)要求于2021年11月1日提交的美國臨時申請?zhí)?3/274,232、于2022年3月16日提交的美國臨時申請?zhí)?3/320,628、于2022年3月30日提交的美國臨時申請?zhí)?3/325,568以及于2022年7月29日提交的美國臨時申請?zhí)?3/369,836的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，這些申請的內(nèi)容均通過引用以其整體并入本文。序列表本技術(shù)包含序列表，該序列表已通過專利中心以xml格式提交。所述xml拷貝的名稱為“shk-061pc_116981-5054_sequence?listing”，于2022年10月31日創(chuàng)建，大小為130,810字節(jié)，其內(nèi)容通過引用以其整體并入本文。

背景技術(shù)：

0、發(fā)明背景

1、治療性蛋白為治療多種適應(yīng)癥提供了機會，包括癌癥、炎性病癥和自身免疫疾病。有多種治療性蛋白被持續(xù)開發(fā)用于作為蛋白施用，包括抗體和重組融合蛋白。在某些情況下，這些蛋白可能會表現(xiàn)出從循環(huán)中快速清除和/或有限的血清半衰期，這可能導(dǎo)致亞治療濃度和/或作用持續(xù)時間有限。因此，治療性蛋白通常需要重復(fù)、頻繁或長期施用。

2、過去幾年，核酸治療領(lǐng)域發(fā)展迅猛。核酸治療可以通過例如基因供與、替換或編輯實現(xiàn)持久或甚至永久的治療效果。然而，盡管經(jīng)過了數(shù)十年的研發(fā)努力，它們的臨床應(yīng)用仍然受到限制，主要是因為與核酸治療的遞送相關(guān)的問題。最近的事件表明，當(dāng)需要基因供與時，某些核酸治療可能會成功。例如，mrna疫苗和基于腺病毒的疫苗已被證明成功對抗covid-19等感染性疾病。此外，某些基于病毒載體的治療，例如alipogene?tiparvovec(glybera，uniqure)、voretigene?neparvovec-rzyl(luxturna，spark?therapeutics)和onasemnogene?abeparvovec(zolgensma，avexis/novartis)已被批準(zhǔn)用于治療某些遺傳性疾病。

3、因此，需要調(diào)整核酸遞送策略來提供用于治療性蛋白產(chǎn)生更方便和/或更有效的治療的替代遞送機制。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、因此，在各個方面，本公開提供了基于核酸的治療組合物和方法，其尤其可用于治療各種疾病或病癥(例如但不限于，癌癥、自身免疫、纖維化疾病和其他炎性病癥)。

2、在一個方面，本公開涉及一種用于治療癌癥、自身免疫疾病或炎性病癥受試者的方法，包括向受試者施用藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含編碼嵌合蛋白的分離的多核苷酸，所述嵌合蛋白具有以下通式結(jié)構(gòu)：n端-(a)-(b)-(c)-c端，其中：(a)是第一結(jié)構(gòu)域，其包含具有ig和itim結(jié)構(gòu)域的t細胞免疫受體(tigit)的胞外結(jié)構(gòu)域或能夠結(jié)合tigit配體的其變體或片段；(c)是第二結(jié)構(gòu)域，其包含糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的tnfr相關(guān)蛋白配體(gitrl)的胞外結(jié)構(gòu)域或能夠結(jié)合gitrl受體的其變體或片段，或light(與淋巴毒素同源，表現(xiàn)出可誘導(dǎo)的表達并與hsv糖蛋白d競爭結(jié)合皰疹病毒入侵介體，其是在t淋巴細胞上表達的受體)的胞外結(jié)構(gòu)域或能夠結(jié)合light受體的其變體或片段；(b)是連接第一和第二結(jié)構(gòu)域的接頭，其中所述接頭包含至少一個能夠形成二硫鍵的半胱氨酸殘基和/或包含鉸鏈-ch2-ch3?fc結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，tigit配體選自cd155/pvr、連接蛋白-2(nectin-2)、連接蛋白-3和連接蛋白-4。在一些實施方案中，gitrl受體是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的tnfr相關(guān)蛋白(gitr)。在一些實施方案中，light受體是tnfrsf3/ltbr。

3、在一個方面，本公開涉及一種治療癌癥、自身免疫疾病或炎性病癥受試者的方法，包括向受試者施用藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含編碼嵌合蛋白的分離的多核苷酸，所述嵌合蛋白具有以下通式結(jié)構(gòu)：n端-(a)-(b)-(c)-c端，其中：(a)是第一結(jié)構(gòu)域，其包含程序性死亡-1(pd-1)的胞外結(jié)構(gòu)域或能夠結(jié)合pd-1配體的其變體或片段；(c)是第二結(jié)構(gòu)域，其包含ox40配體(ox40l)的胞外結(jié)構(gòu)域或能夠結(jié)合ox40l受體的其變體或片段，或4-1bb配體(4-1bbl)的胞外結(jié)構(gòu)域或能夠結(jié)合4-1bbl受體的其變體或片段；(b)是連接第一和第二結(jié)構(gòu)域的接頭，其中所述接頭包含至少一個能夠形成二硫鍵的半胱氨酸殘基和/或包含鉸鏈-ch2-ch3?fc結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，pd-1配體是pd-l1或pd-l2。在一些實施方案中，ox40l受體是ox40。在一些實施方案中，4-1bbl受體是4-1bb。

4、在一個方面，本公開涉及一種治療癌癥、自身免疫疾病或炎性病癥受試者的方法，包括向受試者施用藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含編碼嵌合蛋白的分離的多核苷酸，所述嵌合蛋白具有以下通式結(jié)構(gòu)：n端-(a)-(b)-(c)-c端，其中：(a)是第一結(jié)構(gòu)域，其包含t細胞免疫球蛋白粘蛋白受體3(tim3)的胞外結(jié)構(gòu)域或能夠結(jié)合tim3配體的其變體或片段；(c)是第二結(jié)構(gòu)域，其包含cd40配體(cd40l)的胞外結(jié)構(gòu)域或能夠結(jié)合cd40l受體的其變體或片段；(b)是連接第一和第二結(jié)構(gòu)域的接頭，其中所述接頭包含至少一個能夠形成二硫鍵的半胱氨酸殘基和/或包含鉸鏈-ch2-ch3?fc結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，tim3配體選自半乳糖凝集素9(galectin?9)、磷脂酰絲氨酸(ptdser)、ceacam1和高遷移率族蛋白b1(hmgb1)。在一些實施方案中，cd40l受體是cd40。

5、在一個方面，本公開涉及一種治療癌癥、自身免疫疾病或炎性病癥受試者的方法，包括向受試者施用藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含編碼嵌合蛋白的分離的多核苷酸，所述嵌合蛋白具有以下通式結(jié)構(gòu)：n端-(a)-(b)-(c)-c端，其中：(a)為第一結(jié)構(gòu)域，其包含含v-set和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白8(vsig8)的胞外結(jié)構(gòu)域或能夠結(jié)合vsig8配體的其變體或片段，(c)為第二結(jié)構(gòu)域，其包含4-1bb配體(4-1bbl)的胞外結(jié)構(gòu)域或能夠結(jié)合4-1bbl受體的其變體或片段，(b)為連接第一和第二結(jié)構(gòu)域的接頭，其中所述接頭包含至少一個能夠形成二硫鍵的半胱氨酸殘基和/或包含鉸鏈-ch2-ch3?fc結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，4-1bbl受體是4-1bb。

6、在一個方面，本公開涉及一種藥物組合物，其包含分離的修飾mrna(mmrna)，所述分離的mmrna編碼異源嵌合蛋白，所述異源嵌合蛋白具有與選自seq?id?no:80-93的氨基酸序列具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列。

7、在一些實施方案中，mmrna還包含3'非翻譯區(qū)(utr)。在一些實施方案中，3’utr包含至少一個microrna-122(mir-122)結(jié)合位點。在一些實施方案中，mir-122結(jié)合位點是mir-122-3p結(jié)合位點或mir-122-5結(jié)合位點。在一些實施方案中，mmrna還在開放閱讀框和mirna結(jié)合位點之間包含間隔序列。在一些實施方案中，間隔序列包含至少約10個核苷酸、至少約20個核苷酸、至少約30個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約60個核苷酸、至少約70個核苷酸、至少約80個核苷酸、至少約90個核苷酸或至少約100個核苷酸。

8、在一些實施方案中，mmrna還包含5'utr。在一些實施方案中，5'utr含有kozak序列和/或形成刺激延伸因子結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)。

9、在一些實施方案中，mmrna還包含5'端帽。在一些實施方案中，5'端帽是cap0、cap1、arca、肌苷、n1-甲基-鳥苷、2'氟-鳥苷、7-脫氮-鳥苷、8-氧代-鳥苷、2-氨基-鳥苷、lna-鳥苷、2-疊氮鳥苷、cap2、cap4、5'甲基g帽或其類似物。

10、在本文公開的任一實施方案中，mmrna可包含一個或多個修飾。在本文公開的任一實施方案中，mmrna可包含至少一個修飾。在一些實施方案中，修飾是核苷修飾。在一些實施方案中，修飾是堿基修飾。在一些實施方案中，修飾是糖-磷酸骨架修飾。

11、在一些實施方案中，修飾選自吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、假尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-?；撬峒谆蜍?、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、n4-乙酰胞苷、5-甲酰胞苷、n4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、澤布拉林(zebularine)、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫代-澤布拉林、2-硫代-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-2-氨基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2-氨基嘌呤、7-去氮雜-2,6-二氨基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、n6-甲基腺苷、n6-異戊烯基腺苷、n6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-n6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、n6-甘氨酰氨基甲酰基腺苷、n6-蘇氨酰氨基甲?；佘铡?-甲基硫代-n6-蘇氨酰氨基甲?；佘?、n6,n6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷(inosine)、1-甲基-肌苷、懷俄苷(wyosine)、懷丁苷(wybutosine)、7-去氮雜-鳥苷、7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、6-硫代-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫代-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、n2-甲基鳥苷、n2,n2-二甲基鳥苷、8-氧代-鳥苷、7-甲基-8-氧代-鳥苷、1-甲基-6-硫代-鳥苷、n2-甲基-6-硫代-鳥苷和n2,n2-二甲基-6-硫代-鳥苷，以及其中任意兩種或更多種的組合。在一些實施方案中，修飾選自假尿苷(ψ)、n1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫代尿苷(s2u)、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2'-o-甲基尿苷、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5u)、5-甲基胞苷(m5c)、α-硫代-鳥苷、α-硫代-腺苷、5-氰基尿苷、4'-硫代尿苷、7-去氮雜-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1a)、2-甲基-腺嘌呤(m2a)、n6-甲基-腺苷(m6a)、2,6-二氨基嘌呤、(i),1-甲基肌苷(m1i)、懷俄苷(img)、甲基懷俄苷(mimg)、7-去氮雜-鳥苷、7-氰基-7-去氮雜-鳥苷(preq0)、7-氨基甲基-7-去氮雜-鳥苷(preq1)、7-甲基-鳥苷(m7g)、1-甲基-鳥苷(m1g)、8-氧代-鳥苷、7-甲基-8-氧代-鳥苷，以及其中任意兩種或更多種的組合。在一些實施方案中，修飾選自假尿苷、n1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷以及它們的組合。

12、在一些實施方案中，mmrna包含至少一個n1-甲基假尿苷。在一些實施方案中，mmrna用化學(xué)修飾的尿苷完全修飾。在一些實施方案中，mmrna用n1-甲基假尿苷完全修飾。

13、在一些實施方案中，修飾選自吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、假尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-?；撬峒谆蜍?、1-?；撬峒谆?假尿苷、5-?；撬峒谆?2-硫代-尿苷、1-?；撬峒谆?4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷，或其任意兩種或更多種的組合。

14、在一些實施方案中，修飾選自5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、n4-乙酰胞苷、5-甲酰胞苷、n4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、澤布拉林、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫代-澤布拉林、2-硫代-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷。

15、在一些實施方案中，修飾選自2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-2-氨基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2-氨基嘌呤、7-去氮雜-2,6-二氨基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、n6-甲基腺苷、n6-異戊烯基腺苷、n6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-n6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、n6-甘氨酰氨基甲?；佘铡6-蘇氨酰氨基甲?；佘铡?-甲基硫代-n6-蘇氨酰氨基甲酰腺苷、n6,n6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤。

16、在一些實施方案中，修飾選自肌苷、1-甲基-肌苷、懷俄苷、懷丁苷、7-去氮雜-鳥苷、7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、6-硫代-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫代-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、n2-甲基鳥苷、n2,n2-二甲基鳥苷、8-氧代-鳥苷、7-甲基-8-氧代-鳥苷、1-甲基-6-硫代-鳥苷、n2-甲基-6-硫代-鳥苷和n2,n2-二甲基-6-硫代-鳥苷。

17、在一些實施方案中，修飾存在于主溝側(cè)面上。在一些實施方案中，尿嘧啶的c-5上的氫被甲基或鹵素基團取代。

18、在一些實施方案中，mmrna還包含選自以下的一種或多種修飾：5′-o-(1-硫代磷酸)-腺苷、5′-o-(1-硫代磷酸)-胞苷、5′-o-(1-硫代磷酸)-鳥苷、5′-o-(1-硫代磷酸)-尿苷和5′-o-(1-硫代磷酸)-假尿苷。

19、在本文公開的任何實施方案中，藥物組合物還可包含類脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂質(zhì)復(fù)合物(lipoplex)、脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒、肽、蛋白、細胞、納米顆粒模擬物、納米管或綴合物。在一些實施方案中，藥物組合物被配制成脂質(zhì)納米顆粒(lnp)、脂質(zhì)復(fù)合物或脂質(zhì)體。

20、在一些實施方案中，所述藥物組合物被配制成脂質(zhì)納米顆粒(lnp)。在一些實施方案中，所述lnp包含摩爾比為約20-60％的可電離氨基脂質(zhì)、約5-25％的磷脂、約25-55％的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)和約0.5-1.5％的peg脂質(zhì)。在一些實施方案中，所述lnp包含摩爾比為約50％的可電離氨基脂質(zhì)、約8-12％的磷脂、約37-40％的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)和約1-2％的peg脂質(zhì)。在一些實施方案中，所述脂質(zhì)納米顆粒包含選自可電離脂質(zhì)(例如選自dlin-dma、dlin-k-dma、dlin-kc2-dma、dlin-mc3-dma、98n12-5和c12-200的可電離陽離子脂質(zhì))；結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(例如，二硬脂酰磷脂酰膽堿(dspc))；膽固醇，和聚乙二醇(peg)-脂質(zhì)(例如，peg-二酰基甘油(dag)、peg-二烷氧基丙基(daa)、peg-磷脂、peg-神經(jīng)酰胺(cer)或其混合物，或peg-二月桂酰氧基丙基(c12)、peg-二肉豆蔻酰氧基丙基(c14)、peg-二棕櫚酰氧基丙基(c16)或peg-二硬脂酰氧基丙基(c18))；1,2-二油?；?3-三甲基銨丙烷(dotap)；二油?；字Ｒ掖及?dope)。在一些實施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包含(a)陽離子脂質(zhì)，其占顆粒中存在的總脂質(zhì)的50mol％至85mol％；(b)非陽離子脂質(zhì)，其占顆粒中存在的總脂質(zhì)的13mol％至49.5mol％；和(c)抑制顆粒聚集的綴合脂質(zhì)，其占顆粒中存在的總脂質(zhì)的0.5mol％至2mol％。在一些實施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包含選自sm-102、dlin-dma、dlin-k-dma、dlin-kc2-dma、dlin-mc3-dma、98n12-5和c12-200的脂質(zhì)；膽固醇；和peg-脂質(zhì)。

21、在本文公開的任一實施方案中，所述藥物組合物被配制成用于胃腸外施用。在本文公開的任一實施方案中，所述藥物組合物被配制成用于局部(topical)施用。

22、在一個方面，本公開涉及一種用于在有需要的人受試者中誘導(dǎo)淋巴細胞邊緣化的方法，該方法包括向受試者施用藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含編碼嵌合蛋白的分離的多核苷酸，所述嵌合蛋白具有以下通式結(jié)構(gòu)：n端-(a)-(b)-(c)-c端。在一些實施方案中，分離的多核苷酸是本文公開的任何實施方案中的分離的多核苷酸。