本發(fā)明涉及合成生物學(xué)及醫(yī)藥，具體地，本發(fā)明涉及新型二萜環(huán)化酶、合成新型三尖杉烷二萜骨架的微生物、其制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、三尖杉屬植物在在中國(guó)存在7種3變種，其中6種為特有種，然而，作為傳統(tǒng)的中藥，其中一些物種由于受到人類(lèi)活動(dòng)的干擾以及種子在野外的長(zhǎng)周期發(fā)育或低再生率而被認(rèn)為是瀕危物種。

2、目前，已從這些物種中發(fā)現(xiàn)了多種化合物，包括生物堿、精油、木脂素、苯丙烷、萜類(lèi)化合物和黃酮類(lèi)化合物。值得注意的是，這些化合物顯示出抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗微生物、抗菌、抗炎和抗高血糖活性，并已被用作殺寄生蟲(chóng)劑和抑制植物生長(zhǎng)。

3、三尖杉作為國(guó)家級(jí)保護(hù)植物，屬瀕危物種。目前，獲取植物化合物的方法有：植物提取、化學(xué)合成、細(xì)胞組織培養(yǎng)和植物內(nèi)生真菌。然而，不少三尖杉屬物種中，植物次級(jí)代謝產(chǎn)物在植物中受到嚴(yán)格的調(diào)控導(dǎo)致植物中含量很低，且植物的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，提取工藝耗時(shí)長(zhǎng)等，都限制了植物提取工藝的發(fā)展?；瘜W(xué)合成的工藝雖然已經(jīng)非常成熟且生產(chǎn)成本低，相對(duì)而言，具有節(jié)約資源的優(yōu)勢(shì)；然而化學(xué)合成反應(yīng)條件比較難以控制，產(chǎn)物復(fù)雜以及合成過(guò)程中產(chǎn)生的污染問(wèn)題還有待解決。植物細(xì)胞組織培養(yǎng)具有擴(kuò)大藥物來(lái)源的優(yōu)勢(shì)，但是培養(yǎng)周期比較長(zhǎng)，合成能力低且不穩(wěn)定。內(nèi)生真菌與宿主植物之間的作用機(jī)制尚不明確，處于起步階段。目前一些藥用或工業(yè)用成分主要通過(guò)從三尖杉屬植物中提取其有效成分進(jìn)行生產(chǎn)，對(duì)三尖杉屬植物野生資源以及栽培種植產(chǎn)生了一定的壓力。

4、隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)、化學(xué)分析手段以及新興的組學(xué)技術(shù)和合成生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，依托藥用活性成分生物合成途徑解析，通過(guò)深入挖掘藥用活性成分生物合成途徑相關(guān)功能基因，利用合成生物學(xué)手段生產(chǎn)有效成分對(duì)于緩解珍稀瀕危植物資源的壓力具有非常重要的意義。

5、本領(lǐng)域目前沒(méi)有三尖杉烷二萜相關(guān)的生物合成途徑解析文獻(xiàn)報(bào)道，因此本領(lǐng)域亟待進(jìn)行有效的探索，以期闡明此類(lèi)化合物的生物合成途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種新型三尖杉烷二萜合成酶及其應(yīng)用。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備二萜母核化合物(即具有二萜母核結(jié)構(gòu)的化合物，如三尖杉烷cephalot-12(13)-ene)的方法，包括：以三尖杉烷二萜合成酶(cs)催化香葉基香葉基焦磷酸(ggpp)，產(chǎn)生二萜母核化合物產(chǎn)物；其中，所述三尖杉烷二萜合成酶為seq?id?no:1或seq?id?no:2所示氨基酸序列的酶或其保守性變異蛋白。

3、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述保守性變異蛋白包括選自：(a)將seq?id?no:1或seq?id?no:2所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)(如1-30或1-20個(gè)；較佳地1-15個(gè)；較佳地1-10個(gè)；較佳地1-5個(gè)、1-3個(gè)或1-2個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有所述催化功能的衍生的蛋白；(b)氨基酸序列與seq?id?no:1或seq?id?no:2所示氨基酸序列有80％以上(較佳地85％以上、90％以上或95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有所述催化功能的衍生的蛋白；或(c)在seq?id?no:1或seq?id?no:2所示氨基酸序列的n或c末端添加標(biāo)簽或信號(hào)肽序列后形成的蛋白。

4、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述三尖杉烷二萜合成酶的保守性變異蛋白包括：相應(yīng)于seq?id?no:1所示氨基酸序列，第833位發(fā)生c至g突變、第718位發(fā)生v至f突變、第627位發(fā)生m至f突變的變異蛋白，且所述seq?id?no:1所示氨基酸序列的酶或所述變異蛋白用于制備三尖杉烷cephalot-12(13)-ene。

5、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述三尖杉烷二萜合成酶的保守性變異蛋白包括：相應(yīng)于seq?id?no:1所示氨基酸序列，第625位發(fā)生f至v的突變的變異蛋白，且所述變異蛋白用于制備包括(但不限于)以下一或多種二萜母核化合物：(1r)-verticillia-4(20),7,11-triene、taxadiene(紫杉二烯)、verticillia-3,7,12-triene、verticillia-3,7,12(18)-triene和(1s)-verticillia-4(20),7,11-triene。

6、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述三尖杉烷二萜合成酶或其保守性變異蛋白為n端被截短的蛋白；較佳地，相應(yīng)于seq?id?no:1所示氨基酸序列的蛋白、截去其n端第2-54位氨基酸殘基，或相應(yīng)于seq?id?no:2、截去其n端第2-54位氨基酸殘基。

7、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法在體外進(jìn)行(如通過(guò)化學(xué)反應(yīng)對(duì)底物進(jìn)行催化)或在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行(如通過(guò)基因工程細(xì)胞進(jìn)行生物合成)。

8、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行；較佳地，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞(如大腸桿菌或枯草桿菌)；較佳地，所述真核細(xì)胞包括：植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞；較佳地，所述原核細(xì)胞包括大腸桿菌；較佳地，所述植物細(xì)胞為煙草細(xì)胞，或所述真菌細(xì)胞為酵母細(xì)胞(如畢赤酵母)。

9、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是含有(包括天然含有或外源/異源引入)ipp(異戊烯焦磷酸)與dmapp(二甲基烯丙基焦磷酸)合成模塊的細(xì)胞。

10、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述含有ipp與dmapp合成模塊的細(xì)胞內(nèi)包括(天然存在或外源/異源引入)：模塊i(前體合成)：包括甲羥戊酸(mevalonate，mva)途徑和/或甲基赤蘚醇磷酸通路(mep)，產(chǎn)生ipp與dmapp；模塊ii(二萜母核合成)：以ipp與dmapp為底物，產(chǎn)生ggpp(香葉基香葉基焦磷酸)。

11、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞還表達(dá)(較佳地外源/異源引入)：香葉基香葉基二磷酸合成酶(ggpps)、三尖杉烷二萜合成酶(cs)，或含有編碼所述蛋白的核酸構(gòu)建物。

12、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞(如真核細(xì)胞中，具體如煙草中)還表達(dá)hmg-coa-還原酶(hmgr)。

13、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞(如原核細(xì)胞中，具體如大腸桿菌中)還表達(dá)mva途徑和/或mep途徑的蛋白，包括選自：atob乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶)、mvas(甲羥戊二酰輔酶a合成酶)、mvae(甲羥戊二酰輔酶a還原酶)、mvk1(甲戊二羥酸激酶)、mvk2(磷酸甲戊二羥酸激酶)、mvad(甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶)和fni(異戊烯焦磷酸δ-異構(gòu)酶)。

14、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述mva途徑和/或mep途徑天然存在于所述細(xì)胞。

15、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞還表達(dá)其它mva途徑和/或mep途徑的蛋白或含有編碼所述蛋白的核酸構(gòu)建物。例如，在天然存在所述蛋白/酶的情況下進(jìn)一步重組表達(dá)，可以增加參與所述途徑的蛋白/酶的量，從而促進(jìn)所述途徑中相應(yīng)催化步驟的進(jìn)行。

16、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為煙草細(xì)胞，所述表達(dá)在煙草植物體中進(jìn)行。

17、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法還包括由細(xì)胞或含有細(xì)胞的植物體中分離得到二萜母核化合物(如cephalot-12(13)-ene)或由其形成的三尖杉烷二萜化合物(如海南粗榧內(nèi)酯(harringtonolide))的步驟。

18、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，由細(xì)胞分離得到所述化合物的步驟包括：破碎細(xì)胞后使用有機(jī)溶劑萃取并濃縮和/或干燥，所述有機(jī)溶劑較佳地包括正己烷。

19、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所獲得的二萜母核化合物包括cephalot-12(13)-ene，能進(jìn)一步形成海南粗榧內(nèi)酯(harringtonolide)。

20、在本發(fā)明的另一方面，提供三尖杉烷二萜合成酶的應(yīng)用，用于催化香葉基香葉基焦磷酸(ggpp)形成二萜母核化合物；其中，所述三尖杉烷二萜合成酶為具有seq?id?no:1或seq?id?no:2所示氨基酸序列的酶或其保守性變異蛋白。

21、在本發(fā)明的另一方面，提供一種三尖杉烷二萜合成酶，其為具有seq?id?no:1或seq?id?no:2所示氨基酸序列的酶或其保守性變異蛋白。

22、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述seq?id?no:1所示氨基酸序列的酶是日本粗榧(cephalotaxus?harringtonia)來(lái)源的；

23、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述seq?id?no:1所示氨基酸序列的酶是海南粗榧(cephalotaxus?hainanensis)來(lái)源的。

24、在本發(fā)明的另一方面，提供一種核酸分子，其編碼所述的三尖杉烷二萜合成酶。

25、在本發(fā)明的另一方面，提供一種核酸構(gòu)建物，含有所述的核酸分子。

26、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述核酸構(gòu)建物是載體，例如克隆載體、整合載體或表達(dá)載體。

27、在本發(fā)明的另一方面，提供一種宿主細(xì)胞，該細(xì)胞：(1)表達(dá)所述的三尖杉烷二萜合成酶，或(2)含有所述的核酸分子和/或所述的核酸構(gòu)建物。

28、在本發(fā)明的另一方面，提供所述宿主細(xì)胞是含有(包括天然含有或外源/異源引入)ipp與dmapp合成模塊的細(xì)胞；較佳地，所述含有ipp與dmapp合成模塊的細(xì)胞內(nèi)包括：模塊i(前體合成)：包括甲羥戊酸(mevalonate，mva)途徑和/或甲基赤蘚醇磷酸通路(mep)，產(chǎn)生ipp與dmapp；模塊ii(二萜母核合成)：以ipp與dmapp為底物，產(chǎn)生ggpp(香葉基香葉基焦磷酸)。

29、在一種或多種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞還表達(dá)(較佳地外源/異源引入)：香葉基香葉基二磷酸合成酶(ggpps)或含有編碼所述蛋白的核酸構(gòu)建物；較佳地，所述細(xì)胞還表達(dá)hmg-coa-還原酶(hmgr)。

30、在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于制備二萜母核化合物的試劑盒，其中包括：所述的三尖杉烷二萜合成酶，或編碼該酶的核酸分子，或含有所述核酸分子的核酸構(gòu)建物；較佳地還包括：香葉基香葉基二磷酸合成酶(ggpps)，或編碼該酶的核酸分子，或含有所述核酸分子的核酸構(gòu)建物；較佳地，還包括表達(dá)hmg-coa-還原酶(hmgr)，或編碼該酶的核酸分子，或含有所述核酸分子的核酸構(gòu)建物；

31、在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于制備二萜母核化合物的試劑盒，其中包括：前面任一所述的宿主細(xì)胞。

32、在一種或多種實(shí)施方式中，所述試劑盒中還包括細(xì)胞培養(yǎng)基。

33、在一種或多種實(shí)施方式中，所述試劑盒中還包括說(shuō)明制備二萜母核化合物的方法的使用說(shuō)明書(shū)。

34、本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。