本發(fā)明屬于生物，更具體地，本發(fā)明涉及一種細(xì)胞外囊泡長鏈rna文庫制備方法。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞外囊泡(extracellular?vesicle，ev)是細(xì)胞釋放到胞外間隙的膜結(jié)構(gòu)，它大小不一(從40納米到幾微米)，由磷脂雙分子層膜包裹。最近的研究表明，ev可以作為轉(zhuǎn)移生物活性分子的載體，運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)、脂質(zhì)、dna和rna，完成細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息交流。同時(shí)它還參與到多種生理和病理的過程中，比如炎癥反應(yīng)、免疫失調(diào)、神經(jīng)性疾病和癌癥。因此，這一研究領(lǐng)域得到人們越來越多的關(guān)注。

2、腫瘤細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡中含有腫瘤所特有的一些內(nèi)容物，如特異表達(dá)的表面蛋白、腫瘤特有的突變的dna片段和特有高表達(dá)的rna片段等。越來越多的研究認(rèn)為腫瘤來源的細(xì)胞外囊泡能夠隨著血液循環(huán)并影響其受體細(xì)胞的功能和代謝，創(chuàng)建新的適合腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此血液中的細(xì)胞外囊泡可以作為一種新型的腫瘤鑒定的分子標(biāo)志物使用，其數(shù)量、大小和種類等信息和其中含有的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、dna和rna等生物大分子皆可以用于相關(guān)腫瘤的鑒定。其中大量存在的rna分子，信息豐富且能真實(shí)體現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的生理狀態(tài)，是一種優(yōu)秀的腫瘤鑒定標(biāo)志物。

3、細(xì)胞外囊泡中rna與細(xì)胞內(nèi)rna的組成和大小都有較大差異。細(xì)胞內(nèi)rna大小分布在400-12,000nt之間，而細(xì)胞外囊泡中rna在500nt以下，主要是一些長rna碎片和不同類型的小rna，包括mrna碎片、lncrna碎片、mirna、pirna、rrna碎片、trna碎片和y-rna碎片等，這導(dǎo)致了其長鏈文庫的制備存在技術(shù)瓶頸。

4、高通量測序手段是一種高效的研究rna分子組成和豐度的方法，能夠用于快速的篩選腫瘤鑒定的rna標(biāo)志物。得益于小rna測序技術(shù)的成熟，細(xì)胞外囊泡中小rna種類和表達(dá)已經(jīng)被人們所熟知，且廣泛用于腫瘤等疾病的早期篩查、預(yù)后和復(fù)發(fā)檢測。相比于小rna，研究者們對細(xì)胞外囊泡中長鏈rna的了解不多，其中一個(gè)關(guān)鍵因素在于細(xì)胞外囊泡中長鏈rna分子的特殊性，導(dǎo)致當(dāng)前常用的rnas-seq方法都不適用：細(xì)胞外囊泡長鏈rna一般是碎片化的rna，比較短且不具有poly(a)尾巴，因此無法使用基于oligo-dt反轉(zhuǎn)錄的方式進(jìn)行文庫的制備；細(xì)胞外囊泡rna的產(chǎn)量比較低，平均1ml血漿只能夠獲得大約2-5ng細(xì)胞外囊泡rna，因此大多數(shù)基于隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄的方法因靈敏度不足而無法使用。

5、因此，當(dāng)前針對細(xì)胞外囊泡長鏈rna文庫制備方法缺乏，極大地限制了對細(xì)胞外囊泡長鏈rna種類和豐度的研究，也極大地阻礙了使用細(xì)胞外囊泡長鏈rna信息作為疾病診療標(biāo)志物的發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞外囊泡長鏈rna文庫的制備方法，該方法以細(xì)胞外囊泡rna為模板，使用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄，通過“預(yù)擴(kuò)增-純化-再擴(kuò)增”的方法，結(jié)合cas9-sgrna處理，獲得細(xì)胞外囊泡長鏈rna文庫。本發(fā)明也提供了制備獲得的細(xì)胞外囊泡長鏈rna文庫及其應(yīng)用。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供一種細(xì)胞外囊泡(ev)長鏈rna文庫的制備方法，其包括：

3、i)提供細(xì)胞外囊泡rna，進(jìn)行rna片段化，獲得片段化產(chǎn)物；

4、ii)使用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄，獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；

5、iii)對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行第一次擴(kuò)增(預(yù)擴(kuò)增)，純化獲得cdna；

6、iv)通過crispr/cas方法，以靶向核糖體rna(rrna)的sgrna去除核糖體rna；

7、v)進(jìn)行第二次擴(kuò)增，純化cdna，從而獲得細(xì)胞外囊泡長鏈rna文庫。

8、在一種或多種實(shí)施方式中，所述的長鏈為鏈長80-6000nt、優(yōu)選地100-1000nt的核酸鏈。

9、在一種或多種實(shí)施方式中，所述cas為cas9。

10、在一種或多種實(shí)施方式中，所述細(xì)胞外囊泡rna為從細(xì)胞外囊泡中提取的rna；較佳地，所述細(xì)胞外囊泡來源于細(xì)胞、組織及體液；更佳地，所述細(xì)胞外囊泡來源于細(xì)胞上清液、血清、血漿、尿液、腦脊髓液、唾液、鼻分泌液、肺泡沖洗液、乳汁、滑液、精液、宮腔液、膽汁、淋巴液、糞便、脂肪組織、腦組織、羊水、胚胎培養(yǎng)液。

11、在一種或多種實(shí)施方式中，所述步驟i)還包括：去除細(xì)胞外囊泡rna中的dna。

12、在一種或多種實(shí)施方式中，所述去除細(xì)胞外囊泡rna中的dna包括：dna酶處理法去除細(xì)胞外囊泡rna中的dna。

13、在一種或多種實(shí)施方式中，所述dna酶包括：dnase?i、turbo?dnase。

14、在一種或多種實(shí)施方式中，對應(yīng)1ng細(xì)胞外囊泡rna，使用0.25-0.50個(gè)單位dna酶。

15、在一種或多種實(shí)施方式中，對應(yīng)1ng細(xì)胞外囊泡rna，使用0.28-0.45個(gè)單位dna酶，如使用0.30、0.32、0.33、0.35、0.38、0.40、0.42個(gè)單位dna酶。

16、在一種或多種實(shí)施方式中，所述dna酶處理的溫度為37±5℃；較佳地37±3℃或37±2℃或37±1℃。

17、在一種或多種實(shí)施方式中，所述dna酶處理的時(shí)間為30±15分鐘；較佳地為30±10分鐘；更佳地為30±5分鐘。

18、在一種或多種實(shí)施方式中，所述步驟i)中，所述rna片段化包括：通過化學(xué)法和/或酶消化法進(jìn)行rna打斷處理；較佳地，rna片段化后，rna片段大小為80～300nt；更佳地，rna在含鎂離子的反轉(zhuǎn)錄緩沖液中片段化。

19、在一種或多種實(shí)施方式中，所述片段化在高溫下進(jìn)行。

20、在一種或多種實(shí)施方式中，所述片段化的溫度為84±20℃；較佳地為84±15℃、84±10℃或84±5℃。

21、在一種或多種實(shí)施方式中，所述片段化的時(shí)間為2±1分鐘；較佳地為2±0.5分鐘；更佳地為2±0.3分鐘。

22、在一種或多種實(shí)施方式中，所述鎂離子的濃度為1-5mm。

23、在一種或多種實(shí)施方式中，所述反轉(zhuǎn)錄緩沖液為tris-hcl,ph?8.3?25℃。

24、在一種或多種實(shí)施方式中，所述步驟ii)包括：使用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄并添加3’接頭序列，以及模板轉(zhuǎn)換并添加5’接頭序列。

25、在一種或多種實(shí)施方式中，所述隨機(jī)引物攜帶兼容illumina測序接頭序列，更佳地，所述illumina測序接頭序列如seq?id?no:1或2所示。

26、在一種或多種實(shí)施方式中，所述模板轉(zhuǎn)換是通過模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸，使得cdna的末端添加上5’端的接頭序列；更佳地，所述模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸序列如seq?id?no:3或29所示。

27、在一種或多種實(shí)施方式中，所述步驟iv)中，所述sgrna包括選自如seq?id?no：30～108所示核苷酸序列的sgrna(如含有至少20、30、40、50、60、70、80條)。

28、在一種或多種實(shí)施方式中，所述步驟iii)和所述步驟v)中所述的純化方法為利用磁珠進(jìn)行純化；較佳地，利用磁珠純化后獲得的cdna片段大小為200-500bp。

29、在一種或多種實(shí)施方式中，所述步驟iii)和所述步驟v)中所述的擴(kuò)增為pcr擴(kuò)增；較佳地，所述步驟iii)中pcr擴(kuò)增為低循環(huán)數(shù)(5～7個(gè)循環(huán))的pcr擴(kuò)增，所述步驟v)中pcr擴(kuò)增為高循環(huán)數(shù)(7～10個(gè)循環(huán))的pcr擴(kuò)增。

30、在一種或多種實(shí)施方式中，步驟iii)中，進(jìn)行第一次擴(kuò)增時(shí)，以seq?id?no:5和6、或seq?id?no:7和8所示的引物進(jìn)行擴(kuò)增，和/或，步驟v)中，進(jìn)行第二次擴(kuò)增時(shí)，以seq?idno:7和8、或seq?id?no:27和28所示的引物進(jìn)行擴(kuò)增。

31、在一種或多種實(shí)施方式中，所述制備方法還包括：對獲得的細(xì)胞外囊泡長鏈rna文庫進(jìn)行質(zhì)檢，和/或測序。

32、在一種或多種實(shí)施方式中，所述質(zhì)檢包括：cdna文庫濃度的測定、文庫大小分布的檢測和/或熒光定量pcr分析。

33、在本發(fā)明的第二方面，提供一種細(xì)胞外囊泡長鏈rna文庫，其通過本發(fā)明所述的細(xì)胞外囊泡長鏈rna文庫的制備方法制備獲得。

34、在本發(fā)明的第三方面，提供本發(fā)明所述的細(xì)胞外囊泡長鏈rna文庫的制備方法的應(yīng)用，包括(但不限于)用于：

35、進(jìn)行測序分析或序列比較；

36、進(jìn)行基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)或調(diào)控的分析；

37、篩選或分析功能基因；

38、篩選或分析疾病基因(致病基因)；

39、監(jiān)控或分析試管胚胎質(zhì)量或精子質(zhì)量；或

40、分析基因豐度。

41、在一種或多種實(shí)施方式中，所述疾病包括(但不限于)：腫瘤、先兆子癇、帕金森。

42、在一種或多種實(shí)施方式中，所述篩選或分析包括在沒有患病，疾病早期、中期、晚期或預(yù)后進(jìn)行篩選或分析。

43、在本發(fā)明的第四方面，提供一種從細(xì)胞外囊泡rna的cdna產(chǎn)物(較佳地為預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物)中去除核糖體rna的方法，其包括：利用靶向核糖體rna的sgrna、通過crispr/cas方法去除核糖體rna；較佳地，所述sgrna包括選自如seq?id?no：30～108所示核苷酸序列的sgrna(如含有至少20、30、40、50、60、70、80條)。

44、本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。