本公開(kāi)總體上涉及分子生物學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，其涉及用于體內(nèi)基因產(chǎn)物的靶向減少或消除的基于crispr/cas9的融合分子及其使用方法。

背景技術(shù)：

1、可被定制來(lái)靶向哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的任何基因的工程化的dna結(jié)合蛋白使得生物醫(yī)學(xué)研究取得了快速進(jìn)展，并且是基因療法的有前景的平臺(tái)。rna引導(dǎo)的crispr-cas9系統(tǒng)已經(jīng)成為可編程靶向基因調(diào)控的有前景的平臺(tái)。無(wú)催化活性的“死”cas9?(dcas9)與kruppel相關(guān)盒(krab)結(jié)構(gòu)域的融合產(chǎn)生了合成阻遏物，其能夠在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中高度特異和高效地調(diào)節(jié)或沉默靶基因。

2、然而，使用合成的dcas9-krab融合蛋白持續(xù)調(diào)節(jié)和沉默內(nèi)源基因?qū)υ隗w內(nèi)療法中的應(yīng)用提出了挑戰(zhàn)。合成阻遏物超過(guò)了病毒載體遞送方法的包裝尺寸限制。安全性、毒性、免疫原性和脫靶效應(yīng)是限制合成阻遏物在體內(nèi)使用的其它挑戰(zhàn)。本領(lǐng)域需要用于產(chǎn)生遺傳工程合成的基因阻遏物的替代方法，以及用作治療劑的合成基因阻遏物的體內(nèi)遞送。本公開(kāi)解決了現(xiàn)有技術(shù)中未滿足的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開(kāi)提供了式i的構(gòu)建體：5’-(am1-bm2)n1-casn-(am3-bm4)n2-casc-tp-e-3’?(i)，其中：a和b之一是編碼dnmt3a或其部分的多核苷酸；a和b中的另一個(gè)是編碼dnmt3l或其部分的多核苷酸；casn是編碼dcas9的n-末端部分的多核苷酸；casc是編碼dcas9的c-末端部分的多核苷酸；e是5’-(am5-bm6)n3-kr-dq-3’?or?5’-kr-dq-(am5-bm6)n3-3’；k是編碼krab或其部分的多核苷酸；d是編碼基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑的多核苷酸；t包含編碼(i)能夠結(jié)合抗體或其抗原結(jié)合片段的表位或(ii)能夠結(jié)合核酸結(jié)構(gòu)元件的多肽序列的多核苷酸；m1、m2、m3、m4、m5和m6各自獨(dú)立地是選自0至3的整數(shù)；n1、n2和n3各自獨(dú)立地是選自0至2的整數(shù)；p是選自0至20的整數(shù)；q是選自0至5的整數(shù)；r是選自0至5的整數(shù)；并且其中當(dāng)p為0時(shí)，m1、m2、m3和m4中的至少一個(gè)不為0，n1和n2中的至少一個(gè)不為0，并且q和r中的至少一個(gè)不為0。

2、在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體包含式ii：5’-casn-(am3-bm4)n2-casc-kr-dq-3’(ii)，其中：n2是選自1和2的整數(shù)；r是選自1至5的整數(shù)；q是選自0至5的整數(shù)；并且m3和m4中的至少一個(gè)不為0。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體包含式iia：5’-casn-(a-b)-casc-kr-dq-3’?(iia)。

3、在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體包含式iii：5’-(am1-bm2)n1-casn-(am3-bm4)n2-casc-tp-e-3’(iii)，其中p是選自1至20的整數(shù)。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體包含式iiia：5’-casn-casc-tp-3’?(iiia)。

4、在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體包含式iiib：5’-(am1-bm2)-casn-casc-tp-e-3’(iiib)，其中m1和m2中至少一個(gè)不為0。在一些實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含式iiib-1：5’-(a-b)-casn-casc-tp-kr-dq-3’?(iiib-1)，其中：r是選自1至5的整數(shù)；并且q是選自0至5的整數(shù)。

5、在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體包含式iiic：5’-casn-casc-tp-e-3’(iiic)，其中：n3是選自1和2的整數(shù)；r是選自1至5的整數(shù)；并且q是選自0至5的整數(shù)；并且m5和m6中的至少一個(gè)不為0。在一些實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含式iiic-1：5’-casn-casc-tp-(am5-bm6)n3-kr-dq-3’(iiic-1)。在一些實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含式iiic-2：5’-casn-casc-tp-kr-dq-(am5-bm6)n3-3’?(iiic-2)。

6、在一些實(shí)施方案中，t包含(a)編碼能夠結(jié)合抗體或其抗原結(jié)合片段的表位的多核苷酸，并且還在(a)中多核苷酸的3’末端包含(b)編碼自切割肽的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，編碼自切割肽的核苷酸的3’末端還包含編碼(c)能夠結(jié)合表位的抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸。

7、在一些實(shí)施方案中，t包含(a)編碼能夠結(jié)合核苷酸序列元件的多肽序列的多核苷酸，并且還在(a)中多核苷酸的3’末端包含編碼自切割肽的多核苷酸。

8、在一些實(shí)施方案中，自切割肽選自由t2a、p2a、e2a和f2a自切割肽組成的組。在一些實(shí)施方案中，自切割肽是t2a。在一些實(shí)施方案中，t2a包含seq?id?no:?99的氨基酸序列。

9、在一些實(shí)施方案中，dnmt3a包含seq?id?no:?69的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，編碼dnmt3a的多核苷酸包含seq?id?no:?83的核酸序列。

10、在一些實(shí)施方案中，dnmt3l包括智人dnmt3l、小家鼠dnmt3l、卡氏小鼠( mus? caroli)?dnmt3l、錫金小鼠( mus?pahari)?dnmt3l、褐家鼠( rattus?norvegicus)?dnmt3l、黑家鼠( rattus?rattus)?dnmt3l、尼羅河草鼠( arvicanthis?niloticus)?dnmt3l、叢林鼠( grammomys?surdaster)?dnmt3l或白鼻乳鼠( mastomys?coucha)?dntm3l。在一些實(shí)施方案中，dnmt3l包含seq?id?no:?74-82中的任一項(xiàng)的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，編碼dnmt3l的多核苷酸包含seq?id?no:?84-92中的任一項(xiàng)的核酸序列。

11、在一些實(shí)施方案中，krab包含seq?id?no:?51、53或230-241的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，編碼krab的多核苷酸包含seq?id?no:?52、54、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226或228的核酸序列。

12、在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑包含kruppel相關(guān)抑制盒(krab)、zete同源物的增強(qiáng)子2?(ezh2)、g9a、賴氨酸特異性組蛋白脫甲基酶1a?(lsd1)、異染色質(zhì)蛋白1?(hp1)、gata蛋白之友1?(friend?of?gata?protein?1)(fog1)、組蛋白脫乙酰酶(hdac3)和/或dot1l。在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑包含seq?id?no:?51、53、55、57、59、61、63、65或67的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，編碼基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑的多核苷酸包含seq?id?no:52、54、56、58、60、62、64、66或68的核酸序列。

13、在一些實(shí)施方案中，dcas9包括金黃色葡萄球菌( staphylococcus?aureus)dcas9、化膿性鏈球菌( streptococcus?pyogenes)dcas9、空腸彎曲桿菌( campylobacter? jejuni)?dcas9、白喉棒狀桿菌( corynebacterium?diphtheria)?dcas9、凸腹真桿菌( eubacterium?ventriosum)?dcas9、巴氏鏈球菌( streptococcus?pasteurianus)?dcas9、香腸乳桿菌( lactobacillus?farciminis)?dcas9、球形球毛殼菌( sphaerochaeta?globus)dcas9、固氮螺菌屬( azospirillum?)(例如，菌株b510)?dcas9、重氮葡糖酸醋桿菌( gluconacetobacter?diazotrophicus)?dcas9、灰奈瑟氏球菌( neisseria?cinerea)dcas9、腸道羅斯拜瑞氏菌( roseburia?intestinalis)?dcas9、食清潔劑細(xì)小棒菌( parvibaculum?lavamentivorans)?dcas9、鹵水硝酸鹽裂解菌( nitratifractor? salsuginis)(例如菌株dsm?16511)?dcas9、紅嘴鷗彎曲桿菌( campylobacter?lari)(例如菌株cf89-12)?dcas9、嗜熱鏈球菌( streptococcus?thermophilus)(例如菌株lmd-9)dcas9。在一些實(shí)施方案中，dcas9包含seq?id?no:?106-122中任一項(xiàng)的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，編碼dcas9的多核苷酸包含seq?id?no:?26的核酸序列。

14、在一些實(shí)施方案中，dcas9包含seq?id?no:?1的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，dcas9的n-末端部分包含seq?id?no:?2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，dcas9的c-末端部分包含seq?id?no:?3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25的氨基酸序列。

15、在一些實(shí)施方案中，編碼dcas9的多核苷酸包含seq?id?no:?26的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，編碼dcas9的n-末端部分的多核苷酸包含seq?id?no:?27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，編碼dcas9的c-末端部分的多核苷酸包含seq?id?no:?28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50的核酸序列。

16、在一些實(shí)施方案中，能夠結(jié)合抗體或其抗原結(jié)合片段的多肽選自由gcn4、t2a、10xgcn4和10×gfp-11組成的組。在一些實(shí)施方案中，gcn4包含seq?id?no:?97的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，編碼gcn4的多核苷酸包含seq?id?no:?101的核酸序列。

17、在一些實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是單結(jié)構(gòu)域抗體、scfv、fab、vh、vhh或抗體模擬物。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合片段是scfv。

18、在一些實(shí)施方案中，能夠結(jié)合核酸結(jié)構(gòu)元件的多肽序列選自由ms2噬菌體外殼蛋白(mcp)、pp7和pcp組成的組。在一些實(shí)施方案中，能夠結(jié)合核酸結(jié)構(gòu)元件的多肽序列是mcp。在一些實(shí)施方案中，mcp包含seq?id?no:?100的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，編碼mcp的多核苷酸包含seq?id?no:?105的核酸序列。

19、在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)構(gòu)元件是rna發(fā)夾基序。在一些實(shí)施方案中，rna發(fā)夾基序選自由ms2和pp7組成的組。在一些實(shí)施方案中，rna發(fā)夾基序是ms2?rna發(fā)夾基序。在一些實(shí)施方案中，ms2?rna發(fā)夾基序包含seq?id?no:?104的核酸序列。

20、在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體包含seq?id?no:?134-162的核酸序列。

21、本公開(kāi)提供了由本文所述的任一種構(gòu)建體表達(dá)的多肽。本公開(kāi)提供了包含本文描述的任一種構(gòu)建體的載體。

22、在一些實(shí)施方案中，載體還包含編碼單一引導(dǎo)rna?(sgrna)的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，編碼sgrna的多核苷酸還包含2-20個(gè)拷貝的核酸結(jié)構(gòu)元件。

23、本公開(kāi)提供了包含本文所述的任一種構(gòu)建體的細(xì)胞。本公開(kāi)提供了包含本文所述的任一種多肽的細(xì)胞。本公開(kāi)提供了包含本文所述的任一種載體的細(xì)胞。

24、在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞還包含至少一種sgrna。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種sgrna還包含2-20個(gè)拷貝的核酸結(jié)構(gòu)元件。

25、本公開(kāi)提供了包含本文所述的任一種構(gòu)建體的組合物。本公開(kāi)提供了包含本文所述的任一種多肽的組合物。本公開(kāi)提供了包含本文所述的任一種載體的組合物。

26、在一些實(shí)施方案中，所述組合物還包含至少一種sgrna。在一些實(shí)施方案中，所述sgrna還包含2-20個(gè)拷貝的核酸結(jié)構(gòu)元件。在一些實(shí)施方案中，所述組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。

27、本公開(kāi)提供了在細(xì)胞群中改變基因產(chǎn)物的表達(dá)并使脫靶修飾最小化的方法，其包括向細(xì)胞群中引入以下物質(zhì)的步驟：i)本文所述的任一種構(gòu)建體或由該構(gòu)建體表達(dá)的一種或多種多肽；和ii)至少一種sgrna，其中krab和/或基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑提供基因附近和/或基因調(diào)控元件內(nèi)至少一個(gè)核苷酸的修飾，從而改變基因產(chǎn)物的表達(dá)。

28、在一些實(shí)施方案中，(a)包含式i的5’-(am1-bm2)n1-casn-(am3-bm4)n2-casc-tp-3’部分、式iii的5’-(am1-bm2)n1-casn-(am3-bm4)n2-casc-tp-3’部分、式iiib的5’-(am1-bm2)-casn-casc-tp-3’?部分、式iiib-1的5’-(a-b)-casn-casc-tp-3’?部分、式iiic的5’-casn-casc-tp-3’部分、式iiic-1的5’-casn-casc-tp-3’部分、式iiic-2的5’-casn-casc-tp-3’部分的i)的多肽以及ii)的sgrna被募集到基因組基因座上，和(b)多拷貝的包含式i的5’-e-3’部分、式iii的5’-e-3’部分、式iiib的5’-e-3’部分、式iiib-1的5’-kr-dq-3’部分、式iiic的5’-e-3’部分、式iiic-1的5’-(am5-bm6)n3-kr-dq-3’部分或式iiic-2的5’-kr-dq-(am5-bm6)n3-3’?部分的i)的多肽通過(guò)抗體或其抗原結(jié)合片段與表位的結(jié)合而被募集到基因組基因座上，從而將由構(gòu)建體表達(dá)的多肽募集到基因組基因座上，并改變細(xì)胞群中基因產(chǎn)物的表達(dá)。

29、在一些實(shí)施方案中，該方法還包括向細(xì)胞引入：iii)包含e的5’-(am5-bm6)n3-kr-dq-3’?or?5’-kr-dq-(am5-bm6)n3-3’的第二構(gòu)建體或由第二構(gòu)建體表達(dá)的多肽，其中包含式iiia的5’-casn-casc-tp-3’部分的i)的多肽和sgrna被募集到基因組基因座上，其中多拷貝的iii)的多肽通過(guò)抗體或其抗原結(jié)合片段與表位的結(jié)合而被募集到基因組基因座上，從而將由i)的構(gòu)建體和iii)的構(gòu)建體表達(dá)的多肽募集到基因組基因座上，并改變細(xì)胞群中基因產(chǎn)物的表達(dá)。

30、在一些實(shí)施方案中，(a)包含式i的5’-(am1-bm2)n1-casn-(am3-bm4)n2-casc-tp-3’部分、式iii的5’-(am1-bm2)n1-casn-(am3-bm4)n2-casc-tp-3’部分、式iiib的the?5’-(am1-bm2)-casn-casc-tp-3’?部分、式iiib-1的5’-(a-b)-casn-casc-tp-3’部分、式iiic的5’-casn-casc-tp-3’部分、式iiic-1的5’-casn-casc-tp-3’部分或式iiic-2的5’-casn-casc-tp-3’部分的i)的多肽以及ii)的sgrna被募集到基因組基因座上，以及(b)多拷貝的包含式i的5’-e-3’部分、式iii的5’-e-3’部分、式iiib的5’-e-3’部分、式iiib-1的5’-kr-dq-3’部分、式iiic的5’-e-3’部分、式iiic-1的5’-(am5-bm6)n3-kr-dq-3’部分或式iiic-2的5’-kr-dq-(am5-bm6)n3-3’?部分的i)的多肽通過(guò)能夠與核酸結(jié)構(gòu)元件結(jié)合的多肽序列與所述核酸結(jié)構(gòu)元件的結(jié)合而被募集到基因組基因座上，從而將由構(gòu)建體表達(dá)的多肽募集到基因組基因座上，并改變細(xì)胞群中基因產(chǎn)物的表達(dá)。

31、在一些實(shí)施方案中，該方法還包括向細(xì)胞引入：iii)包含e的5’-(am5-bm6)n3-kr-dq-3’或5’-kr-dq-(am5-bm6)n3-3’部分的第二構(gòu)建體或由第二構(gòu)建體表達(dá)的多肽，其中包含式iiia的5’-casn-casc-tp-3’部分的i)的多肽和sgrna被募集到基因組基因座，其中多拷貝的iii)的多肽通過(guò)能夠與核酸結(jié)構(gòu)元件結(jié)合的多肽序列與所述核酸結(jié)構(gòu)元件的結(jié)合而被募集到基因組基因座上，從而將由構(gòu)建體表達(dá)的多肽募集到基因組座位上，并改變細(xì)胞群中基因產(chǎn)物的表達(dá)。

32、本公開(kāi)提供了減少或消除受試者中基因產(chǎn)物表達(dá)的體內(nèi)方法，其包括向受試者的細(xì)胞中引入以下物質(zhì)的步驟：i)本文所述的任一種構(gòu)建體或由該構(gòu)建體表達(dá)的一種或多種多肽；和ii)至少一種sgrna，其中krab和/或基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑提供基因附近和/或基因調(diào)控元件內(nèi)的至少一個(gè)核苷酸的修飾，從而改變受試者中基因產(chǎn)物的表達(dá)。

33、本公開(kāi)提供了用于治療或減輕受試者的基因產(chǎn)物相關(guān)病癥的癥狀的方法，其包括向受試者的細(xì)胞引入以下物質(zhì)的步驟：i)本文所述的任一種構(gòu)建體或由該構(gòu)建體表達(dá)的一種或多種多肽；和ii)至少一種sgrna，其中krab和/或基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑提供基因附近和/或基因調(diào)控元件內(nèi)的至少一個(gè)核苷酸的修飾，從而改變基因產(chǎn)物的表達(dá)并治療或減輕受試者的基因產(chǎn)物相關(guān)病癥的癥狀。

34、在一些實(shí)施方案中，與野生型細(xì)胞群相比，基因產(chǎn)物在多個(gè)經(jīng)修飾的細(xì)胞中的表達(dá)降低了50-100%。在一些實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物的中靶修飾(on-site?modification)與基因產(chǎn)物的脫靶修飾(off-site?modification)的比率為約10:1。

35、在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷酸的修飾是dna甲基化或組蛋白修飾。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷酸的修飾是dna甲基化。

36、在一些實(shí)施方案中，基因調(diào)控元件是核心啟動(dòng)子、近端啟動(dòng)子、遠(yuǎn)端增強(qiáng)子、沉默子、絕緣體元件(insulator?element)、邊界元件(boundary?element)或基因座控制區(qū)。

37、在一些實(shí)施方案中，基因附近和/或基因調(diào)控元件內(nèi)的至少一個(gè)核苷酸的修飾位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約100?bp、約200?bp、約300?bp、約400?bp、約500?bp、約600bp、約700?bp、約800?bp、約900?bp、約1000?bp、約1100?bp、約1200?bp、約1300?bp、約1400?bp或約1500?bp內(nèi)。

38、在一些實(shí)施方案中，基因附近和/或基因調(diào)控元件內(nèi)的至少一個(gè)核苷酸的修飾位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游約100?bp、約200?bp、約300?bp、約400?bp、約500?bp、約600bp、約700?bp、約800?bp、約900?bp、約1000?bp、約1100?bp、約1200?bp、約1300?bp、約1400?bp或約1500?bp內(nèi)。

39、在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體是脫氧核糖核酸(dna)。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體是信使核糖核酸(mrna)。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體被配制在脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒中。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體和sgrna被配制在脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒中。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體和sgrna被配制在相同的脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒中。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體和sgrna被配制在不同的脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒中。

40、在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒包含可電離脂質(zhì)(20%-70%，摩爾比)、聚乙二醇化脂質(zhì)(0%-30%，摩爾比)、支撐脂質(zhì)(30%-50%，摩爾比)和膽固醇(10%-50%，摩爾比)。在一些實(shí)施方案中，可電離脂質(zhì)選自ph響應(yīng)性可電離脂質(zhì)、熱響應(yīng)性可電離脂質(zhì)和光響應(yīng)性可電離脂質(zhì)。

41、在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體被配制在aav載體中。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體和sgrna被配制在aav載體中。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體和sgrna被配制在相同的aav載體中。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建體和sgrna被配制在不同的aav載體中。

42、在一些實(shí)施方案中，通過(guò)局部注射、全身輸注或其組合將構(gòu)建體或由構(gòu)建體表達(dá)的一種或多種多肽遞送至細(xì)胞。

43、在一些實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物選自由以下組成的組：vegfa基因產(chǎn)物、pcsk9基因產(chǎn)物、angptl3基因產(chǎn)物、ptbp1基因產(chǎn)物、ttr基因產(chǎn)物、ube3a-ats基因產(chǎn)物、ptp1b基因產(chǎn)物、apoc3基因產(chǎn)物、hsd17b13基因產(chǎn)物、bcl11a基因產(chǎn)物和tgf-β基因產(chǎn)物。

44、在一些實(shí)施方案中，受試者是人。在一些實(shí)施方案中，所述疾病或病癥選自由以下組成的組：家族性高膽固醇血癥(fh)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、帕金森病、肝纖維化(hf)、年齡相關(guān)性黃斑病(amd)、安格爾曼綜合征(as)、ii型糖尿病、β-地中海貧血和肝細(xì)胞癌。