背景技術(shù)：

1、信使rna(mrna)技術(shù)是常規(guī)小分子、dna和蛋白質(zhì)治療以及常規(guī)疫苗方法的新興替代方案，因?yàn)樗怯行У?、可編程的，并且能夠快速產(chǎn)生具有期望序列的mrna。mrna治療是一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域，并且已經(jīng)用于治療性蛋白的表達(dá)，范圍從血管再生因子(例如，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子a(vegf-a)、gata結(jié)合蛋白4(gata4)、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2c(mef2c)、t盒轉(zhuǎn)錄因子5(tbx5)、心肌蛋白(myocd))到針對(duì)covid-19、流感和寨卡病毒(zika?virus)的疫苗。盡管最近取得了臨床成功，但mrna治療仍然面臨不穩(wěn)定性、毒性、短期效力和潛在免疫應(yīng)答的挑戰(zhàn)。增加mrna的穩(wěn)定性以增強(qiáng)其體內(nèi)效力仍然是重要的問題，必須解決這個(gè)問題以增加mrna治療在臨床應(yīng)用中的可行性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本文提供了具有經(jīng)修飾的poly-a尾和/或經(jīng)修飾的5'帽以改進(jìn)mrna在細(xì)胞中和體外翻譯系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，由此增強(qiáng)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生的經(jīng)修飾的mrna，以及制備和使用此類經(jīng)修飾的mrna的方法。常規(guī)mrna包括poly-a尾，所述poly-a尾在3'端處包含大約100-250個(gè)腺苷核苷酸。poly-a尾可以被去除3'核苷酸的細(xì)胞核酸外切酶降解或去除。一旦核酸外切酶去除poly-a尾并且開始去除3'非翻譯區(qū)(utr)和/或開放閱讀框(orf)的核苷酸，mrna就無(wú)法翻譯成經(jīng)編碼的蛋白質(zhì)。對(duì)3'核酸外切酶活性更具抗性的mrna降解更慢，并且因此更穩(wěn)定，在細(xì)胞中的半衰期增加，并且因此可以從給定的mrna分子中產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)。與poly-a結(jié)合蛋白(pabp)的結(jié)合也需要poly-a尾，pabp通過與真核起始因子4復(fù)合物(eif4g)結(jié)合來增強(qiáng)mrna分子的翻譯。常規(guī)mrna還包含類似于poly-a尾的5'帽，其保護(hù)mrna免受5'核酸外切酶的影響，并且充當(dāng)用于翻譯機(jī)制募集的位點(diǎn)。含有一個(gè)或多個(gè)針對(duì)mrna的核堿基、糖或磷酸酯鍵的結(jié)構(gòu)性修飾的經(jīng)修飾的核苷酸可以干擾3'和5'核酸外切酶活性，從而使mrna更穩(wěn)定。然而，抑制核酸外切酶的相同結(jié)構(gòu)修飾也會(huì)阻礙酶將這些經(jīng)修飾的核苷酸并入到mrna中的能力，從而使經(jīng)修飾的mrna難以產(chǎn)生。

2、然而，已經(jīng)證明了在不顯著損害mrna的合成和/或翻譯的情況下增強(qiáng)mrna分子的穩(wěn)定性的替代性策略。本文公開了用于通過將多個(gè)poly-a尾連接到mrna的3'端上和/或?qū)⒍鄠€(gè)5'帽連接到5'端上來增強(qiáng)mrna穩(wěn)定性的策略。一種策略涉及將包括一個(gè)或多個(gè)用點(diǎn)擊化學(xué)柄修飾的核苷酸的寡核苷酸連接到現(xiàn)有mrna分子的3'和/或5'端上。包括3'poly-a尾或5'帽的另外的寡核苷酸進(jìn)而通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸連接(參見圖1c和1g)?？商娲兀ㄟ^點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將與樹枝狀大分子連接的寡核苷酸連接到現(xiàn)有mrna分子的3'和/或5'端上也可以獲得相同的結(jié)果。同樣用點(diǎn)擊化學(xué)柄修飾的樹枝狀大分子進(jìn)而通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與包括3'poly-a尾或5'帽的另外的寡核苷酸連接(參見圖1e和1i)。除了通過保護(hù)現(xiàn)有mrna分子免受核酸外切酶活性的影響來延長(zhǎng)mrna的壽命，由此減少orf的降解外，這些策略還可以直接增強(qiáng)mrna的翻譯，因?yàn)榕cmrna連接的每個(gè)另外的poly-a尾或5'帽都可以與經(jīng)修飾的mrna相互作用并募集其翻譯機(jī)制。這些策略可以相互配合，并且也可以與其它已知的用于增強(qiáng)mrna穩(wěn)定性的技術(shù)配合使用，所述技術(shù)包含例如，在mrna的3'和/或5'端處引入經(jīng)修飾的核苷酸、將經(jīng)修飾的核苷酸引入到mrna的3'和/或5'非翻譯區(qū)(utr)中、將核酸外切酶抗性序列引入到mrna中和/或通過連接線性mrna的末端進(jìn)行環(huán)化以產(chǎn)生環(huán)狀mrna。

3、因此，在一些方面，本公開提供了一種經(jīng)修飾的mrna，其包括：

4、(i)開放閱讀框(orf)，所述orf編碼蛋白質(zhì)；

5、(ii)poly-a區(qū)；以及

6、(iii)5'帽區(qū)；

7、其中所述poly-a區(qū)位于所述orf的3'處并且包括10個(gè)或更多個(gè)核苷酸，并且所述5'帽區(qū)位于所述orf的5'處，并且其中所述poly-a區(qū)包括兩個(gè)或更多個(gè)poly-a尾，和/或所述5'帽區(qū)包括兩個(gè)或更多個(gè)5'帽。

8、在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)修飾的mrna包括poly-a區(qū)和5'帽區(qū)，所述poly-a區(qū)包括兩個(gè)或更多個(gè)poly-a尾，所述5'帽區(qū)包括一個(gè)5'帽。在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)修飾的mrna包括poly-a區(qū)和5'帽區(qū)，所述poly-a區(qū)包括一個(gè)poly-a尾，所述5'帽區(qū)包括兩個(gè)或更多個(gè)5'帽。在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)修飾的mrna包括poly-a區(qū)和5'帽區(qū)，所述poly-a區(qū)包括兩個(gè)或更多個(gè)poly-a尾，所述5'帽區(qū)包括兩個(gè)或更多個(gè)5'帽。

9、在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)修飾的mrna包括5'非翻譯區(qū)(5'utr)和3'非翻譯區(qū)(3'utr)，其中所述orf位于所述5'utr與所述3'utr之間，其中所述3'utr位于所述orf與所述poly-a區(qū)之間，并且其中所述5'utr位于所述5'帽區(qū)與所述orf之間。

10、在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)修飾的mrna是線性mrna，其中所述5'帽區(qū)位于所述經(jīng)修飾的mrna的5'端處，并且所述poly-a區(qū)位于所述經(jīng)修飾的mrna的3'端處。

11、在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)修飾的mrna是環(huán)狀mrna，其中所述poly-a區(qū)位于所述3'utr與所述5'帽區(qū)之間。

12、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)包括兩個(gè)或更多個(gè)poly-a尾，并且所述poly-a尾的至少兩個(gè)實(shí)例通過第一接頭共價(jià)連接。

13、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)包括-(第一poly-a尾)-[(第一接頭)–(第二poly-a尾)n1]n2；其中n1的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是介于1與20之間(包含端值)的整數(shù)，n2是介于2與10之間(包含端值)的整數(shù)，所述第一poly-a尾與所述3'utr共價(jià)連接，并且所述第一接頭與所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾共價(jià)連接。

14、在一些實(shí)施例中，n1的每個(gè)實(shí)例是1。

15、在一些實(shí)施例中，所述第一接頭的至少一個(gè)實(shí)例與所述第一poly-a尾的內(nèi)部核苷酸共價(jià)連接。

16、在一些實(shí)施例中，所述第一接頭的至少一個(gè)實(shí)例在第二poly-a尾的3'核苷酸處與所述第二poly-a尾共價(jià)連接。

17、在一些實(shí)施例中，所述第一接頭的至少一個(gè)實(shí)例包括通過使兩個(gè)正交點(diǎn)擊化學(xué)柄反應(yīng)而形成的至少一個(gè)部分。

18、在一些實(shí)施例中，通過使兩個(gè)正交點(diǎn)擊化學(xué)柄反應(yīng)而形成的至少一個(gè)部分具有下式：

19、

20、在一些實(shí)施例中，所述第一接頭的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞碳環(huán)基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞雜環(huán)基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞芳基或經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞雜芳基；并且任選地所述經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜烯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜炔基的每個(gè)實(shí)例的母鏈中的一個(gè)或多個(gè)碳原子獨(dú)立地被經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞碳環(huán)基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞雜環(huán)基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞芳基或經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞雜芳基替換。

21、在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜烯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜炔基的每個(gè)實(shí)例的母鏈中的一個(gè)或多個(gè)碳原子獨(dú)立地被替換。

22、在一些實(shí)施例中，所述第一接頭的至少一個(gè)實(shí)例具有下式：l1的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-199亞烷基或經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-199亞雜烷基；并且l2的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-199亞烷基或經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-199亞雜烷基。

23、在一些實(shí)施例中，所述第一接頭的至少一個(gè)實(shí)例具有下式：

24、

25、在一些實(shí)施例中，n1的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是介于2與20之間(包含端值)的整數(shù)。

26、在一些實(shí)施例中，所述第一接頭的至少一個(gè)實(shí)例包括樹枝狀大分子。在某些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例是第一代樹枝狀大分子。在某些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例是第二代樹枝狀大分子。在某些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例是第三代樹枝狀大分子。在某些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例是第四代樹枝狀大分子。在某些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例包括2、3、4、5、6、7或8個(gè)樹突。

27、在某些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例是聚丙烯亞胺樹枝狀大分子、聚丙烯胺樹枝狀大分子、聚(谷氨酸)樹枝狀大分子、聚三聚氰胺樹枝狀大分子、聚酯樹枝狀大分子或聚乙二醇化樹枝狀大分子。在一些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例是聚酰胺胺(pamam)樹枝狀大分子。

28、在一些實(shí)施例中，所述pamam樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例具有下式：

29、

30、其中n3的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是介于1與10之間(包含端值)的整數(shù)；n4的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是介于0與10之間(包含端值)的整數(shù)；r2的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是氫或條件是r2的至少三個(gè)實(shí)例是r1的每個(gè)實(shí)例是經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜烯基或經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜炔基；任選地所述經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜烯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜炔基的每個(gè)實(shí)例的母鏈中的一個(gè)或多個(gè)碳原子獨(dú)立地被經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞碳環(huán)基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞雜環(huán)基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞芳基或經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞雜芳基替換；并且n5的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是介于0與10之間(包含端值)的整數(shù)。

31、在一些實(shí)施例中，所述pamam樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例包括：

32、

33、在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜烯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜炔基的每個(gè)實(shí)例的母鏈中的一個(gè)或多個(gè)碳原子獨(dú)立地被替換。

34、在一些實(shí)施例中，所述第一接頭的至少一個(gè)實(shí)例具有下式：

35、

36、在一些實(shí)施例中，所述第一接頭的至少一個(gè)實(shí)例與所述第一poly-a尾的所述3'核苷酸共價(jià)連接。

37、在一些實(shí)施例中，所述第一接頭的至少一個(gè)實(shí)例與所述第二poly-a尾的所述3'核苷酸共價(jià)連接。

38、在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)修飾的mrna的所述poly-a區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸。

39、在一些實(shí)施例中，所述兩個(gè)或更多個(gè)poly-a尾中的至少一個(gè)poly-a尾的最后10個(gè)核苷酸中的3個(gè)或更多個(gè)核苷酸是經(jīng)修飾的核苷酸和/或非腺苷核苷酸。

40、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸是經(jīng)修飾的腺苷核苷酸。

41、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸是經(jīng)修飾的非腺苷核苷酸。

42、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸包括經(jīng)修飾的核堿基。

43、在一些實(shí)施例中，由所述poly-a區(qū)的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸包括的所述經(jīng)修飾的核堿基選自由以下組成的組：黃嘌呤、烯丙基氨基尿嘧啶、烯丙基氨基胸苷、次黃嘌呤、地高辛化腺嘌呤、地高辛化胞嘧啶、地高辛化鳥嘌呤、地高辛化尿嘧啶、6-氯嘌呤核苷、n6-甲基腺嘌呤、甲基假尿嘧啶、2-硫代胞嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、4-硫代胸苷、4-硫尿嘧啶、5,6-二氫-5-甲基尿嘧啶、5,6-二氫尿嘧啶、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-n-烯丙基]尿嘧啶、5-氨基烯丙基胞嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-羧基胞嘧啶、5-羧甲基酯尿嘧啶、5-羧基尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-甲?；奏?、5-甲酰基尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、5-羥基尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-炔丙基氨基胞嘧啶、5-炔丙基氨基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氮雜胞嘧啶、6-氮雜尿嘧啶、6-氯嘌呤、6-硫鳥嘌呤、7-脫氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、7-鳥嘌呤-7-炔丙基氨基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-炔丙基氨基鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、8-疊氮基腺嘌呤、8-氯腺嘌呤、8-氧代腺嘌呤、8-氧代鳥嘌呤、阿糖腺嘌呤、阿糖胞嘧啶、阿糖鳥嘌呤、阿糖尿嘧啶、生物素-16-7-脫氮雜-7-炔丙基氨基鳥嘌呤、生物素-16-氨基烯丙基胞嘧啶、生物素-16-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁3-5-炔丙基氨基胞嘧啶、花菁3-6-炔丙基氨基尿嘧啶、花菁3-氨基烯丙基胞嘧啶、花菁3-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁5-6-炔丙基氨基胞嘧啶、花菁5-6-炔丙基氨基尿嘧啶、花菁5-氨基烯丙基胞嘧啶、花菁5-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁7-氨基烯丙基尿嘧啶、dabcyl-5-3-氨基烯丙基尿嘧啶、脫硫生物素-16-氨基烯丙基-尿嘧啶、脫硫生物素-6-氨基烯丙基胞嘧啶、異鳥嘌呤、n1-乙基假尿嘧啶、n1-甲氧基甲基假尿嘧啶、n1-甲基腺嘌呤、n1-甲基假尿嘧啶、n1-丙基假尿嘧啶、n2-甲基鳥嘌呤、n4-生物素-obea-胞嘧啶、n4-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、o6-甲基鳥嘌呤、假異胞嘧啶、假尿嘧啶、噻吩并胞嘧啶、噻吩并鳥嘌呤、噻吩并尿嘧啶、黃苷、3-脫氮雜腺嘌呤、2,6-二氨基腺嘌呤、2,6-二氨基鳥嘌呤、5-甲酰胺-尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、n6-異戊烯基腺嘌呤(i6a)、2-甲基-硫代-n6-異戊烯基腺嘌呤(ms2i6a)、2-甲基硫代-n6-甲基腺嘌呤(ms2m6a)、n6-(順式-羥基異戊烯基)腺嘌呤(io6a)、2-甲基硫代-n6-(順式-羥基異戊烯基)腺嘌呤(ms2io6a)、n6-甘氨酰基氨基甲?；汆堰?g6a)、n6-蘇氨酰基氨基甲?；汆堰?t6a)、2-甲基硫代-n6-蘇氨酰基氨基甲?；汆堰?ms2t6a)、n6-甲基-n6-蘇氨?；被柞；汆堰?m6t6a)、n6-羥基正纈氨酰基氨基甲?；汆堰?hn6a)、2-甲基硫代-n6-羥基正纈氨?；被柞；汆堰?ms2hn6a)、n6,n6-二甲基腺嘌呤(m62a)和n6-乙?；汆堰?ac6a)。

44、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸包括經(jīng)修飾的糖。

45、在一些實(shí)施例中，由所述poly-a區(qū)的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸包括的所述經(jīng)修飾的糖選自由以下組成的組：2'-硫代核糖、2',3'-二脫氧核糖、2'-氨基-2'-脫氧核糖、2'脫氧核糖、2'-疊氮基-2'-脫氧核糖、2'-氟-2'-脫氧核糖、2'-o-甲基核糖、2'-o-甲基脫氧核糖、3'-氨基-2',3'-二脫氧核糖、3'-疊氮基-2',3'-二脫氧核糖、3'-脫氧核糖、3'-o-(2-硝基芐基)-2'-脫氧核糖、3'-o-甲基核糖、5'-氨基核糖、5'-硫代核糖、5-硝基-1-吲哚基-2'-脫氧核糖、5'-生物素-核糖、2'-o,4'-c-亞甲基連接的核糖、2'-o,4'-c-氨基連接的核糖和2'-o,4'-c-硫代連接的核糖。

46、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸包括經(jīng)修飾的磷酸酯。

47、在一些實(shí)施例中，由所述poly-a區(qū)的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸包括的所述經(jīng)修飾的磷酸酯選自由以下組成的組：硫代磷酸酯(phosphorothioate，ps)、硫代磷酸酯(thiophosphate)、5'-o-甲基膦酸酯、3'-o-甲基膦酸酯、5'-羥基膦酸酯、羥基膦酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、硒代磷酸酯(selenophosphate)、氨基磷酸酯、碳膦酸酯、甲基膦酸酯、苯基膦酸酯、乙基膦酸酯、h-膦酸酯、胍環(huán)、三唑環(huán)、硼磷酸酯(bp)、甲基膦酸酯和胍基丙基氨基磷酸酯。

48、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)包括1至3、3至5、5至10、10至15、15至30、30至50、50至100或100至200個(gè)硫代磷酸酯。

49、在一些實(shí)施例中，其中所述poly-a區(qū)包括5至30個(gè)硫代磷酸酯。

50、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)包括3至5、5至10、10至15、15至30、30至50、50至100或100至200個(gè)脫氧核糖。

51、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)包括5至30個(gè)脫氧核糖。

52、在一些實(shí)施例中，所述mrna包括3'末端核苷酸，其中所述3'末端核苷酸是二脫氧腺苷、二脫氧胞苷、二脫氧鳥苷、二脫氧胸苷、二脫氧尿苷或反向脫氧胸苷。

53、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)包括25至500個(gè)核苷酸。

54、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)包括50至100、100至150、150至200、200至300、300至400或400至500個(gè)核苷酸。

55、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)包括10個(gè)或更多個(gè)腺苷核苷酸。

56、在一些實(shí)施例中，所述poly-a區(qū)的核苷酸的25-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、95-100％、96-100％、97-100％、98-100％或99-100％是腺苷核苷酸。

57、在一些實(shí)施例中，所述第一poly-a尾包括10至50個(gè)腺苷核糖核苷酸、1至10個(gè)包括連接點(diǎn)的經(jīng)修飾的尿苷脫氧核糖核苷酸和3'末端雙脫氧核糖核苷酸或反向脫氧核糖核苷酸；并且所述第二poly-a尾包括10至50個(gè)腺苷核糖核苷酸。

58、在一些實(shí)施例中，所述第一poly-a尾包括如以下所示的核苷酸序列：5'-rarararararadu(a1)rarararararararararararadu(a1)rarararararararararararad?u(a1)ddc-3'(seq?id?no:1)；其中所述第二poly-a尾的至少一個(gè)實(shí)例包括如以下所示的核苷酸序列：5'-rarararararararararararararararararararararararara*ra*ra*ra*ra*ra*(b1)-3'(seq?id?no:2)；并且所述第一接頭的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是其中“ra”表示腺苷核糖核苷酸；“du(a1)”表示經(jīng)修飾的尿苷脫氧核糖核苷酸；“ddc”表示胞嘧啶雙脫氧核糖核苷酸；“*”表示硫代磷酸酯鍵；du(a1)的每個(gè)實(shí)例的a1表示所述du(a1)的尿苷上的連接點(diǎn)；ra*(b1)的b1表示所述ra*(b1)的*上的連接點(diǎn)；a1的每個(gè)實(shí)例與a2的實(shí)例連接；并且b1的每個(gè)實(shí)例與b2的實(shí)例連接。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的尿苷脫氧核糖核苷酸是5-辛二炔基脫氧尿苷。

59、在一些實(shí)施例中，所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾包括10至50個(gè)腺苷核糖核苷酸和3'末端疊氮化物部分。

60、在一些實(shí)施例中，所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾包括10至50個(gè)腺苷核糖核苷酸和5'末端疊氮化物部分。

61、在一些實(shí)施例中，所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾包括如以下所示的核苷酸序列：5'-rarararararararararararararararararararararararara*ra*ra*ra*ra*ra*/疊氮化物n/-3'(seq?id?no:3)；其中“疊氮化物n”表示3'疊氮化物部分，并且“*”表示硫代磷酸酯鍵。

62、在一些實(shí)施例中，所述第一poly-a尾和所述第二poly-a尾包括如以下所示的核苷酸序列：5'-5/疊氮化物n/rarararararararararararararararararararararararar?a*ra*ra*ra*ra*ra-3'(seq?id?no:27)；其中“疊氮化物n”表示3'疊氮化物部分，并且“*”表示硫代磷酸酯鍵。

63、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)包括兩個(gè)或更多個(gè)5'帽，并且所述5'帽的至少兩個(gè)實(shí)例通過第二接頭共價(jià)連接。

64、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)包括-(第一5'帽)-[(第二接頭)-(第二5'帽)m1]m2；其中m1的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是介于1與20之間(包含端值)的整數(shù)；m2是介于2與10之間(包含端值)的整數(shù)；所述第一5'帽與所述5'utr共價(jià)連接；并且所述第二接頭與所述第一5'帽和所述第二5'帽共價(jià)連接。

65、在一些實(shí)施例中，m1的每個(gè)實(shí)例是1。

66、在一些實(shí)施例中，所述第二接頭的至少一個(gè)實(shí)例與所述第一5'帽的內(nèi)部核苷酸共價(jià)連接。

67、在一些實(shí)施例中，所述第二接頭的至少一個(gè)實(shí)例在第二5'帽的所述3'核苷酸處與所述第二5'帽共價(jià)連接。

68、在一些實(shí)施例中，所述第二接頭的至少一個(gè)實(shí)例包括通過使兩個(gè)正交點(diǎn)擊化學(xué)柄反應(yīng)而形成的至少一個(gè)部分。

69、在一些實(shí)施例中，通過使兩個(gè)正交點(diǎn)擊化學(xué)柄反應(yīng)而形成的至少一個(gè)部分具有下式：

70、

71、在一些實(shí)施例中，所述第二接頭的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞碳環(huán)基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞雜環(huán)基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞芳基或經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞雜芳基；并且任選地所述經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜烯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜炔基的每個(gè)實(shí)例的母鏈中的一個(gè)或多個(gè)碳原子獨(dú)立地被經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞碳環(huán)基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞雜環(huán)基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞芳基或經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞雜芳基替換。

72、在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜烯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-200亞雜炔基的每個(gè)實(shí)例的母鏈中的一個(gè)或多個(gè)碳原子獨(dú)立地被替換。

73、在一些實(shí)施例中，所述第二接頭的至少一個(gè)實(shí)例具有下式：l3的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-199亞烷基或經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-199亞雜烷基；并且l4的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-199亞烷基或經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-199亞雜烷基。

74、在一些實(shí)施例中，所述第二接頭的至少一個(gè)實(shí)例具有下式：

75、

76、在一些實(shí)施例中，m1的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是介于2與20之間(包含端值)的整數(shù)。

77、在一些實(shí)施例中，第二接頭的至少一個(gè)實(shí)例包括樹枝狀大分子。在某些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例是第一代樹枝狀大分子。在某些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例是第二代樹枝狀大分子。在某些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例是第三代樹枝狀大分子。在某些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例是第四代樹枝狀大分子。在某些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例包括2、3、4、5、6、7或8個(gè)樹突。

78、在某些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例是聚丙烯亞胺樹枝狀大分子、聚丙烯胺樹枝狀大分子、聚(谷氨酸)樹枝狀大分子、聚三聚氰胺樹枝狀大分子、聚酯樹枝狀大分子或聚乙二醇化樹枝狀大分子。在一些實(shí)施例中，所述樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例是聚酰胺胺(pamam)樹枝狀大分子。

79、在一些實(shí)施例中，所述pamam樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例具有下式：

80、

81、其中m3的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是介于1與10之間(包含端值)的整數(shù)；m4的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是介于0與10之間(包含端值)的整數(shù)；r12的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是氫或條件是r12的至少三個(gè)實(shí)例是r11的每個(gè)實(shí)例是經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜烯基或經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜炔基；任選地所述經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜烯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜炔基的每個(gè)實(shí)例的母鏈中的一個(gè)或多個(gè)碳原子獨(dú)立地被經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞碳環(huán)基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞雜環(huán)基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞芳基或經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的亞雜芳基替換；并且m5的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是介于0與10之間(包含端值)的整數(shù)。

82、在一些實(shí)施例中，所述pamam樹枝狀大分子的至少一個(gè)實(shí)例包括：

83、

84、在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞烯基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞炔基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜烯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的c1-10亞雜炔基的每個(gè)實(shí)例的母鏈中的一個(gè)或多個(gè)碳原子獨(dú)立地被替換。

85、在一些實(shí)施例中，所述第一接頭的至少一個(gè)實(shí)例具有下式：

86、

87、在一些實(shí)施例中，所述第二接頭的至少一個(gè)實(shí)例與所述第一5'帽的3'核苷酸共價(jià)連接。

88、在一些實(shí)施例中，所述第二接頭的至少一個(gè)實(shí)例與所述第二5'帽的至少一個(gè)實(shí)例的3'核苷酸共價(jià)連接。

89、在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)修飾的mrna的所述5'帽區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸。

90、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸包括經(jīng)修飾的核堿基。

91、在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)修飾的核堿基選自由以下組成的組：黃嘌呤、烯丙基氨基尿嘧啶、烯丙基氨基胸苷、次黃嘌呤、地高辛化腺嘌呤、地高辛化胞嘧啶、地高辛化鳥嘌呤、地高辛化尿嘧啶、6-氯嘌呤核苷、n6-甲基腺嘌呤、甲基假尿嘧啶、2-硫代胞嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、4-硫代胸苷、4-硫尿嘧啶、5,6-二氫-5-甲基尿嘧啶、5,6-二氫尿嘧啶、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-n-烯丙基]尿嘧啶、5-氨基烯丙基胞嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-羧基胞嘧啶、5-羧甲基酯尿嘧啶、5-羧基尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-甲?；奏?、5-甲?；蜞奏?、5-羥基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、5-羥基尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-炔丙基氨基胞嘧啶、5-炔丙基氨基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氮雜胞嘧啶、6-氮雜尿嘧啶、6-氯嘌呤、6-硫鳥嘌呤、7-脫氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、7-鳥嘌呤-7-炔丙基氨基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-炔丙基氨基鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、8-疊氮基腺嘌呤、8-氯腺嘌呤、8-氧代腺嘌呤、8-氧代鳥嘌呤、阿糖腺嘌呤、阿糖胞嘧啶、阿糖鳥嘌呤、阿糖尿嘧啶、生物素-16-7-脫氮雜-7-炔丙基氨基鳥嘌呤、生物素-16-氨基烯丙基胞嘧啶、生物素-16-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁3-5-炔丙基氨基胞嘧啶、花菁3-6-炔丙基氨基尿嘧啶、花菁3-氨基烯丙基胞嘧啶、花菁3-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁5-6-炔丙基氨基胞嘧啶、花菁5-6-炔丙基氨基尿嘧啶、花菁5-氨基烯丙基胞嘧啶、花菁5-氨基烯丙基尿嘧啶、花菁7-氨基烯丙基尿嘧啶、dabcyl-5-3-氨基烯丙基尿嘧啶、脫硫生物素-16-氨基烯丙基-尿嘧啶、脫硫生物素-6-氨基烯丙基胞嘧啶、異鳥嘌呤、n1-乙基假尿嘧啶、n1-甲氧基甲基假尿嘧啶、n1-甲基腺嘌呤、n1-甲基假尿嘧啶、n1-丙基假尿嘧啶、n2-甲基鳥嘌呤、n4-生物素-obea-胞嘧啶、n4-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、o6-甲基鳥嘌呤、假異胞嘧啶、假尿嘧啶、噻吩并胞嘧啶、噻吩并鳥嘌呤、噻吩并尿嘧啶、黃苷、3-脫氮雜腺嘌呤、2,6-二氨基腺嘌呤、2,6-二氨基鳥嘌呤、5-甲酰胺-尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、n6-異戊烯基腺嘌呤(i6a)、2-甲基-硫代-n6-異戊烯基腺嘌呤(ms2i6a)、2-甲基硫代-n6-甲基腺嘌呤(ms2m6a)、n6-(順式-羥基異戊烯基)腺嘌呤(io6a)、2-甲基硫代-n6-(順式-羥基異戊烯基)腺嘌呤(ms2io6a)、n6-甘氨?；被柞；汆堰?g6a)、n6-蘇氨?；被柞；汆堰?t6a)、2-甲基硫代-n6-蘇氨?；被柞；汆堰?ms2t6a)、n6-甲基-n6-蘇氨?；被柞；汆堰?m6t6a)、n6-羥基正纈氨?；被柞；汆堰?hn6a)、2-甲基硫代-n6-羥基正纈氨?；被柞；汆堰?ms2hn6a)、n6,n6-二甲基腺嘌呤(m62a)和n6-乙?；汆堰?ac6a)。

92、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸包括經(jīng)修飾的糖。

93、在一些實(shí)施例中，由所述5'帽區(qū)的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸包括的所述經(jīng)修飾的糖選自由以下組成的組：2'-硫代核糖、2',3'-二脫氧核糖、2'-氨基-2'-脫氧核糖、2'脫氧核糖、2'-疊氮基-2'-脫氧核糖、2'-氟-2'-脫氧核糖、2'-o-甲基核糖、2'-o-甲基脫氧核糖、3'-氨基-2',3'-二脫氧核糖、3'-疊氮基-2',3'-二脫氧核糖、3'-脫氧核糖、3'-o-(2-硝基芐基)-2'-脫氧核糖、3'-o-甲基核糖、5'-氨基核糖、5'-硫代核糖、5-硝基-1-吲哚基-2'-脫氧核糖、5'-生物素-核糖、2'-o,4'-c-亞甲基連接的核糖、2'-o,4'-c-氨基連接的核糖和2'-o,4'-c-硫代連接的核糖。

94、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸包括經(jīng)修飾的磷酸酯。

95、在一些實(shí)施例中，由所述5'帽區(qū)的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸包括的所述經(jīng)修飾的磷酸酯選自由以下組成的組：硫代磷酸酯(phosphorothioate，ps)、硫代磷酸酯(thiophosphate)、5'-o-甲基膦酸酯、3'-o-甲基膦酸酯、5'-羥基膦酸酯、羥基膦酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、硒代磷酸酯(selenophosphate)、氨基磷酸酯、碳膦酸酯、甲基膦酸酯、苯基膦酸酯、乙基膦酸酯、h-膦酸酯、胍環(huán)、三唑環(huán)、硼磷酸酯(bp)、甲基膦酸酯和胍基丙基氨基磷酸酯。

96、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)包括1至3、3至5、5至10、10至15、15至30、30至50、50至100或100至200個(gè)硫代磷酸酯。

97、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)包括5至30個(gè)硫代磷酸酯。

98、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)包括3至5、5至10、10至15、15至30、30至50、50至100或100至200個(gè)脫氧核糖。

99、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)包括5至30個(gè)脫氧核糖。

100、在一些實(shí)施例中，所述mrna包括3'末端核苷酸，其中所述3'末端核苷酸是二脫氧腺苷、二脫氧胞苷、二脫氧鳥苷、二脫氧胸苷、二脫氧尿苷或反向脫氧胸苷。

101、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)包括25-500個(gè)核苷酸。

102、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)包括50至100、100至150、150至200、200至300、300至400或400至500個(gè)核苷酸。

103、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)包括1至3、3至5、5至7或7至10個(gè)5'帽。

104、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)包括5'-5'三磷酸酯鍵的7-甲基鳥苷酸帽。

105、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)包括5'-5'三磷酸酯鍵的2,2,7-三甲基鳥苷帽。

106、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的5'帽。

107、在一些實(shí)施例中，一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的5'帽是經(jīng)鎖定核酸(lna)修飾的帽、包括由5'-硫代磷酸酯修飾的5'-5'三磷酸酯鍵的5'帽或包括5'-5'四磷酸酯鍵的5'帽。

108、在一些實(shí)施例中，所述5'帽區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)包括一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸的5'帽。

109、在一些實(shí)施例中，由所述5'帽包括的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸是2'-o-甲基化核苷酸。

110、在一些實(shí)施例中，所述第一5'帽包括10至50個(gè)核糖核苷酸、1至10個(gè)包括連接點(diǎn)的經(jīng)修飾的尿苷脫氧核糖核苷酸和5'帽；并且所述第二5'帽包括10至50個(gè)核糖核苷酸和5'帽。

111、在一些實(shí)施例中，所述第一5'帽包括如以下所示的核苷酸序列：5'-/cap/rgrgrgrararadu(c1)rarargrargrargrarararargrarargrargdu(c1)rarargrarargrararadu(c1)ra-3'(seq?id?no:4)；所述第二5'帽包括如以下所示的核苷酸序列：5'-/cap/rgrgrgrargrarcrtrgrcrcrarcrcra*ra*ra*ra*ra*ra*(d1)-3'(seq?id?no:5)；并且所述第二接頭的每個(gè)實(shí)例獨(dú)立地是

112、“ra”表示腺苷核糖核苷酸；“rt”表示胸苷核糖核苷酸；“rc”表示胞苷核糖核苷酸；“rg”表示鳥苷核糖核苷酸；“du(c1)”表示經(jīng)修飾的尿苷脫氧核糖核苷酸；“du(c1)”表示經(jīng)修飾的尿苷脫氧核糖核苷酸；其中“*”表示硫代磷酸酯鍵；“cap”表示5'帽；du(c1)的每個(gè)實(shí)例的c1表示所述du(c1)的尿苷上的連接點(diǎn)；ra*(d1)的d1表示所述ra*(d1)的*上的連接點(diǎn)；c1的每個(gè)實(shí)例與c2的實(shí)例連接；并且d1的每個(gè)實(shí)例與d2的實(shí)例連接。在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)修飾的尿苷脫氧核苷酸是5-辛二炔基脫氧尿苷。

113、在一些實(shí)施例中，所述第一5'帽包括5至10個(gè)核糖核苷酸和5'疊氮化物部分；并且所述第二5'帽包括10至50個(gè)核糖核苷酸、3'疊氮化物部分和5'帽。

114、在一些實(shí)施例中，所述第一5'帽包括如以下所示的核苷酸序列：5'-/5疊氮化物n/rarara?rara-3'；并且所述第二5'帽包括如以下所示的核苷酸序列：5'-/cap/rgrgrgrargrarcrtrgrcrcrarcrcra*ra*ra*ra*ra*ra*/3疊氮化物n/-3'(seq?id?no:6)；其中“ra”表示腺苷核糖核苷酸；“rt”表示胸苷核糖核苷酸；“rc”表示胞苷核糖核苷酸；“rg”表示鳥苷核糖核苷酸；“du(c1)”表示經(jīng)修飾的尿苷脫氧核糖核苷酸；“5疊氮化物n”表示5'疊氮化物部分；“3疊氮化物n”表示3'疊氮化物部分，“*”表示硫代磷酸酯鍵，并且“cap”表示5'帽。

115、在一些方面，本公開提供了一種產(chǎn)生本文所描述的經(jīng)修飾的mrna中的任一種的方法，所述方法包括在存在rna連接酶的情況下，將包括編碼蛋白質(zhì)的開放閱讀框(orf)的第一rna與包括兩個(gè)或更多個(gè)poly-a尾的加尾核酸和/或包括兩個(gè)或更多個(gè)5'帽的加帽核酸連接，由此所述rna連接酶在所述第一rna的3'核苷酸與所述加尾核酸的5'核苷酸之間形成共價(jià)鍵，和/或在所述第一rna的5'核苷酸與所述加帽核酸的3'核苷酸之間形成共價(jià)鍵，以產(chǎn)生所述經(jīng)修飾的mrna。

116、在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)修飾的mrna包括5'非翻譯區(qū)(5'utr)和3'非翻譯區(qū)(3'utr)，其中所述orf位于所述5'utr與所述3'utr之間，其中所述3'utr位于所述orf與所連接的加尾核酸之間，并且其中所述5'utr位于所述orf與所連接的加帽核酸之間。

117、在一些實(shí)施例中，所述加尾核酸包括第一poly-a尾和一個(gè)或多個(gè)第二poly-a尾，其中所述第一poly-a尾與所述3'utr共價(jià)連接。

118、在一些方面，本公開提供了一種通過本文所提供的產(chǎn)生經(jīng)修飾的mrna的方法產(chǎn)生的經(jīng)修飾的mrna。

119、在一些方面，本公開提供了一種遞送劑，其包括本文所提供的經(jīng)修飾的mrna中的任一種，其中所述遞送劑包括脂質(zhì)、肽、蛋白質(zhì)、抗體、碳水化合物、納米顆?；蛭⒘?。

120、在一些實(shí)施例中，本文所提供的納米顆?；蛭⒘Ｊ侵|(zhì)納米顆?；蛑|(zhì)微粒、聚合物納米顆?；蚓酆衔镂⒘?、蛋白質(zhì)納米顆粒或蛋白質(zhì)微?；蚬腆w納米顆粒或固體微粒。

121、在一些方面，本公開提供了包括本文所提供的經(jīng)修飾的mrna中的任一種的細(xì)胞。

122、在一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

123、在一些方面，本公開提供了一種組合物，其包括本文所提供的經(jīng)修飾的mrna、本文所提供的遞送劑或本文所提供的細(xì)胞中的任一者。

124、在一些實(shí)施例中，所述組合物進(jìn)一步包括另外的藥劑。在一些實(shí)施例中，所述另外的藥劑是在向受試者施用時(shí)具有治療作用的藥劑。在一些實(shí)施例中，所述另外的藥劑是核苷酸、核酸、氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、小分子、適體、脂質(zhì)或碳水化合物。在一些實(shí)施例中，所述另外的藥劑是shrna、sirna或aso。在一些實(shí)施例中，所述另外的藥劑是抗原或佐劑。

125、在一些實(shí)施例中，所述組合物是藥物組合物，其中所述藥物組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。

126、在一些方面，本公開提供了一種方法，其包括將本文所提供的經(jīng)修飾的mrna、本文所提供的遞送劑或本文所提供的組合物中的任一者引入到細(xì)胞中。

127、在一些方面，本公開提供了一種方法，其包括將本文所提供的經(jīng)修飾的mrna、本文所提供的遞送劑、本文所提供的細(xì)胞或本文所提供的組合物中的任一者引入到受試者中。

128、在一些方面，本公開提供了一種預(yù)防有需要的受試者的疾病的方法，所述方法包括將有效量的本文所提供的經(jīng)修飾的mrna、本文所提供的遞送劑、本文所提供的細(xì)胞或本文所提供的組合物中的任一者引入到所述受試者體內(nèi)，其中所述經(jīng)修飾的mrna的所述開放閱讀框編碼蛋白質(zhì)。

129、在一些方面，本公開提供了一種治療有需要的受試者的疾病的方法，所述方法包括將有效量的本文所提供的經(jīng)修飾的mrna、本文所提供的遞送劑、本文所提供的細(xì)胞或本文所提供的組合物中的任一者引入到所述受試者體內(nèi)，其中所述經(jīng)修飾的mrna的所述開放閱讀框編碼蛋白質(zhì)。

130、在一些實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)是來自引起所述疾病的細(xì)胞或病毒的蛋白質(zhì)抗原或其片段。

131、在一些實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)是在所述受試者體內(nèi)以比參考值的水平更低的水平表達(dá)的蛋白質(zhì)。

132、在一些方面，本公開提供了一種替換受試者體內(nèi)的酶的方法，所述方法包括將本文所提供的經(jīng)修飾的mrna、本文所提供的遞送劑、本文所提供的細(xì)胞或本文所提供的組合物中的任一者引入到所述受試者體內(nèi)，其中所述經(jīng)修飾的mrna的所述開放閱讀框編碼酶。

133、在一些實(shí)施例中，所述受試者是人。

134、在一些方面，本公開提供了本文所提供的經(jīng)修飾的mrna、本文所提供的遞送劑、本文所提供的細(xì)胞或本文所提供的組合物中的任一者，其用于治療有需要的受試者的疾病。

135、在一些方面，本公開提供了一種試劑盒，其包括所述第一rna以及產(chǎn)生本文所提供的經(jīng)修飾的mrna中的任一種的方法中的所述加尾核酸和/或所述加帽核酸。

136、在一些實(shí)施例中，所述試劑盒進(jìn)一步包括rna連接酶。

137、在一些方面，本公開提供了一種試劑盒，其包括本文所提供的藥物組合物、用于將所述藥物組合物施用于受試者的裝置以及用于將所述藥物組合物施用于受試者的說明書。