本發(fā)明屬于熒光探針，具體為基于二氰基異佛爾酮熒光探針的設(shè)計(jì)合成與評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)：

1、熒光探針作為具有重要前景的實(shí)用檢測工具，在特異性檢測中發(fā)揮著越來越大的作用，包括但不限于環(huán)境污染物的定性和定量檢測、病理模型中標(biāo)志物的早期檢測等，在生物體細(xì)胞成像方面尤為突出。與電化學(xué)分析、元素分析、質(zhì)譜等傳統(tǒng)方法相比，熒光探針技術(shù)具有成本低、實(shí)時(shí)性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果易分析、檢測精度高等顯著優(yōu)勢。小分子熒光探針作為熒光探針技術(shù)的研究熱點(diǎn)，其設(shè)計(jì)和開發(fā)受到了分子生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和化學(xué)生物學(xué)等多學(xué)科的關(guān)注。在過去的幾十年里，傳統(tǒng)的熒光基團(tuán)，如香豆素、bodipy、羅丹明、花菁和半花菁染料等，被廣泛用于構(gòu)建優(yōu)良的探針，為活細(xì)胞中重要靶點(diǎn)的監(jiān)測和追蹤做出了重大貢獻(xiàn)。

2、但是上述熒光團(tuán)在展示其強(qiáng)大的能力的同時(shí)，也暴露了以下缺點(diǎn)：

3、1.光穩(wěn)定性：盡管dcip基團(tuán)可能有較好的光穩(wěn)定性，但熒光探針在連續(xù)或強(qiáng)烈的激發(fā)光照射下仍可能發(fā)生光漂白。

4、2.生物降解性：熒光探針的生物降解性是其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的關(guān)鍵因素。如果探針不能有效地被生物體清除，可能會(huì)積累并產(chǎn)生毒性。

5、3.生物分布和清除：探針在體內(nèi)的分布和清除機(jī)制需要仔細(xì)研究，以確保它們能夠到達(dá)目標(biāo)位置并有效地發(fā)揮作用，同時(shí)減少非特異性分布。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于：為了解決上述提出的問題，提供基于二氰基異佛爾酮熒光探針的設(shè)計(jì)合成與評(píng)價(jià)方法。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：基于二氰基異佛爾酮熒光探針的設(shè)計(jì)合成方法，所述合成方法包括以下步驟：

3、s1:先進(jìn)行合成二氰基異佛爾酮熒光探針的中間體的制備；稱取1.5g?d-半乳糖加入150ml的茄型瓶，然后加入5ml乙酸酐將d-半乳糖溶解，隨后將體系轉(zhuǎn)移至冰水浴環(huán)境反應(yīng)30分鐘，再緩慢滴加0.1ml高氯酸，待攪拌反應(yīng)6小時(shí)后，tlc監(jiān)測反應(yīng)完全；用飽和碳酸氫鈉將體系的ph調(diào)到中性，用乙酸乙酯萃取；用飽和氯化鈉溶液洗滌，用無水硫酸鈉吸出多余水分，最后將干燥后的有機(jī)層抽濾，把收集到的濾液進(jìn)行減壓旋蒸處理，得到淡黃色糖漿狀的粗產(chǎn)品；無需進(jìn)行純化所得，直接進(jìn)行下一步；用10ml二氯甲烷溶解上一步的粗產(chǎn)品，置于冰水浴環(huán)境繼續(xù)反應(yīng)30分鐘，然后緩慢滴加0.35ml氫溴酸，滴加完畢后將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移室溫環(huán)境下繼續(xù)反應(yīng)6小時(shí)，tlc監(jiān)測反應(yīng)完全；反應(yīng)體系后處理同上一步操作，經(jīng)過多次萃取、干燥、抽濾、減壓旋蒸處理，得到白色固體全乙酰溴代半乳糖；所得產(chǎn)物也無需純化，繼續(xù)進(jìn)行下一步反應(yīng)；將上述已得到的白色固體全乙酰溴代半乳糖溶于20ml?dmso，室溫條件下，邊攪拌邊向反應(yīng)體系中加入nan3；反應(yīng)4小時(shí)后，反應(yīng)體系用水淬滅，用乙酸乙酯萃取，用飽和氯化鈉溶液洗滌，用無水硫酸鈉吸出多余水分，最后抽濾，濃縮，用硅膠柱純化得到白色化合物1；

4、s2:將白色固體1溶解在10ml干燥的甲醇中，攪拌下加入甲醇鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的ph至10，室溫下反應(yīng)4小時(shí)，tlc檢測反應(yīng)完全；隨后加入去離子交換樹脂調(diào)節(jié)反應(yīng)體系至中性，再進(jìn)行抽濾，經(jīng)減壓旋蒸除去溶劑，最后通過硅膠柱純化分離得到白色的固體化合物2；

5、s3:稱取化合物三苯基膦和1,4-二溴丁烷置于干燥的100毫升茄形瓶中，加入20ml甲苯充分溶解,在120℃氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下回流12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，減壓抽濾除去溶劑，用甲苯洗滌三次，得到白色粉末狀固體化合物3；

6、s4:稱取化合物3置于干燥的25ml圓底燒瓶中，用5ml?n,n-二甲基甲酰胺溶解，然后加入疊氮化鈉，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)3小時(shí)，加入10ml去離子水淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取，合并有機(jī)相并加入無水硫酸鈉吸走多余水分，減壓除去溶劑，再用油泵抽去多余的n,n-二甲基甲酰胺，得到棕黃色固體化合物4；

7、s5:稱取n-嗎啉和疊氮化鈉溶于20ml?n,n-二甲基甲酰胺中，在50℃氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下回流3小時(shí),反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，加大量水后用乙酸乙酯萃取，然后減壓除去溶劑，得到化合物5；

8、s6:將異佛爾酮、丙二腈、三水合乙酸鈉和9ml乙醇放入燒瓶中；混合物在50℃下攪拌加熱過夜；然后減壓除去溶劑；殘留物經(jīng)石油醚/二氯甲烷洗脫，得到白色固體化合物6；

9、s7:將2,4-二羥基苯甲醛、3-溴丙炔和碳酸鉀溶于乙腈；反應(yīng)混合物在氮?dú)猸h(huán)境下于80℃回流30分鐘；然后減壓除去溶劑；殘留物經(jīng)二氯甲烷/石油醚洗脫，得到白色固體化合物7；

10、s8:將化合物7和化合物6溶于乙腈，然后加入哌啶；混合物在氮?dú)猸h(huán)境下于80℃回流6小時(shí)，然后減壓除去溶劑；殘留物用石油醚/乙酸乙酯洗脫，得到黃色化合物8；

11、s9:將化合物8溶解在10ml無水二氯甲烷中，在0℃的氮?dú)猸h(huán)境下向溶液中逐漸加入三乙胺；反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘；然后向溶液中逐漸加入丙烯酰氯反應(yīng)30分鐘，減壓除去溶劑；殘留物用石油醚/乙酸乙酯洗脫，得到黃色固體化合物9；

12、s10:將化合物8溶解在10ml無水二氯甲烷中，在0℃的氮?dú)猸h(huán)境下向溶液中逐漸加入三乙胺；反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘，然后向溶液中逐漸加入3-噻吩甲酰氯反應(yīng)1小時(shí)，減壓除去溶劑；殘留物經(jīng)石油醚/乙酸乙酯洗脫，得到黃色固體化合物10；

13、s11:將化合物8溶解在10ml無水二氯甲烷中，在0℃的氮?dú)猸h(huán)境下向溶液中逐漸加入三乙胺；反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘，然后向溶液中逐漸加入乙酰氯反應(yīng)1小時(shí)，減壓除去溶劑；殘留物經(jīng)石油醚/乙酸乙酯洗脫，得到橙黃色固體化合物11；

14、s12:將化合物8溶解在10ml無水二氯甲烷中，在0℃的氮?dú)猸h(huán)境下向溶液中逐漸加入三乙胺；反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘，然后向溶液中逐漸加入苯甲酰氯反應(yīng)40分鐘，減壓除去溶劑；殘留物用石油醚/乙酸乙酯洗脫，得到化合物12；

15、s13:將化合物8溶解在10ml無水二氯甲烷中，在0℃的氮?dú)猸h(huán)境下向溶液中逐漸加入三乙胺；反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘，然后向溶液中逐漸加入環(huán)丙基甲酰氯反應(yīng)30分鐘，減壓除去溶劑；殘留物用石油醚/乙酸乙酯洗脫，得到化合物13；

16、s14:將化合物8溶解在10ml無水二氯甲烷中，在0℃的氮?dú)猸h(huán)境下向溶液中逐漸加入三乙胺，反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘，然后向溶液中逐漸加入二甲氨基甲酰氯反應(yīng)50分鐘，減壓除去溶劑；殘留物用石油醚/乙酸乙酯洗脫，得到橘色固體化合物14；

17、s15:將化合物8、4-硝基芐溴、碳酸鉀溶解在15ml?n,n-二甲基甲酰胺中，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4小時(shí)，減壓除去溶劑；殘留物經(jīng)石油醚/乙酸乙酯洗脫，得到黃色固體化合物15；

18、s16:將化合物8、2,4-二硝基氟苯、碳酸鉀溶解在20ml?n,n-二甲基甲酰胺中，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌6小時(shí)，減壓除去溶劑；殘留物用柱色譜法純化，其中石油醚/乙酸乙酯＝15:1，得到橙色化合物16；

19、s17:進(jìn)行目標(biāo)化合物的合成：將抗壞血酸鈉和cuso4.5h2o溶于h2o中,混合物在室溫下攪拌30分鐘；然后將混合物加入溶有化合物9和化合物2的thf溶液中，反應(yīng)12小時(shí)；用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉除去水分，減壓蒸發(fā)溶劑；用二氯甲烷/甲醇為洗脫劑，得到黃色固體dcx-1，之后即可結(jié)束整個(gè)基于二氰基異佛爾酮熒光探針的設(shè)計(jì)合成方法。

20、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟s17中，將抗壞血酸鈉和cuso4.5h2o溶于h2o中,混合物在室溫下攪拌30分鐘。然后將混合物加入溶有化合物10和化合物2的thf溶液中，反應(yīng)過夜。用二氯甲烷萃取，用無水硫酸鈉除去多余水分，減壓除去溶劑。殘留物經(jīng)二氯甲烷/甲醇洗脫，得到黃色固體dcx-2。

21、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，將抗壞血酸鈉和cuso4.5h2o溶于h2o中,混合物在室溫下攪拌30分鐘。然后將混合物加入溶有化合物11和化合物2的thf溶液中，反應(yīng)過夜。用二氯甲烷萃取，用無水硫酸鈉吸干多余水分，減壓除去溶劑。殘留物經(jīng)二氯甲烷/甲醇洗脫，得到黃色化合物dcx-3。

22、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，將抗壞血酸鈉和cuso4.5h2o溶于h2o中,混合物在室溫下攪拌30分鐘。然后將混合物加入溶有化合物13和化合物2的thf溶液中，反應(yīng)過夜。用二氯甲烷萃取，用無水硫酸鈉吸走多余水分，減壓除去溶劑。殘留物用二氯甲烷/甲醇洗脫，得到黃色固體dcx-5。

23、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，將抗壞血酸鈉和cuso4.5h2o溶于h2o中,混合物在室溫下攪拌30分鐘。然后將混合物加入溶有化合物14和化合物2的thf溶液中，反應(yīng)過夜。用二氯甲烷萃取，用無水硫酸鈉吸去水分，減壓蒸發(fā)溶劑。殘留物用二氯甲烷/甲醇洗脫，收到黃色目標(biāo)物dcx-6。

24、在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，評(píng)價(jià)方法包括以下步驟：

25、s1:進(jìn)行光譜的測試，稱取一定量的dcx-1和cys分別溶于dmso和pbs中，制成10mm的探針dcx-1儲(chǔ)備液和50mm的cys儲(chǔ)備液。其他測試溶液，如小分子硫醇、陰離子、陽離子、氨基酸等，均溶解在pbs中，制成濃度為50mm的溶液。紫外光譜和熒光光譜的掃描范圍為460-800nm。狹縫寬度為5nm×5nm。測試內(nèi)容包括紫外光譜實(shí)驗(yàn)、熒光選擇性實(shí)驗(yàn)、探針的抗干擾性實(shí)驗(yàn)、濃度滴定實(shí)驗(yàn)、job?plot等實(shí)驗(yàn)

26、s2:進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，將lo2細(xì)胞接種到96孔板中，在37℃，5％?co2條件下孵育24小時(shí)，再用不同濃度的探針處理24小時(shí)。除去上清液并加入10μl?mtt。在37℃條件下再孵育4小時(shí)，最后用elx800吸光度酶標(biāo)儀記錄在488nm處的吸光度

27、s3進(jìn)行探針在細(xì)胞中的檢測，首先將hepg2細(xì)胞均勻接種到24孔板中培養(yǎng)24小時(shí)，然后對培養(yǎng)的hepg2細(xì)胞進(jìn)行不同的處理，分為空白細(xì)胞組、純探針組、cys補(bǔ)充組和nem預(yù)處理組。純探針組:10μm探針dcx-1孵育30分鐘，然后固定并滴加抗熒光淬滅劑。cys補(bǔ)充組：10μm探針dcx-1孵育30分鐘，用pbs洗滌3次。然后探針dcx-1與100μm?cys一起孵育60分鐘，用pbs洗滌3次，然后固定并滴加抗熒光淬滅劑。nem預(yù)處理組：用1mm?nem預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí)，用pbs洗滌3次，然后加入10μm探針dcx-1孵育30分鐘，固定并滴加抗熒光淬滅劑。

28、為了探究探針dcx-1能否精準(zhǔn)定位到肝細(xì)胞，對hepg2、a549、hela和sgc-7901四種細(xì)胞進(jìn)行相同的處理。然后將抗熒光淬滅劑滴加到載玻片上，扣緊并密封。所有圖像均由leica?sp8激光掃描共聚焦顯微鏡采集。探針的激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長的收集范圍為560-650nm。

29、綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：

30、1、本發(fā)明中，設(shè)計(jì)并合成出8個(gè)以β-半乳糖為靶向基團(tuán)的肝細(xì)胞靶向熒光探針，通過連接不同的識(shí)別基團(tuán)(乙酰氯、丙烯酰氯、噻吩甲酰氯、苯甲酰氯、2,4-二硝基氟苯等)，用于檢測cys、h2s、過氧化氫、硝基還原酶、乙酰膽堿酯酶等生物標(biāo)志物，通過1h?nmr、13c?nmr和hr-esi-ms表征確定了每個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)并合成出6個(gè)以嗎啉為靶向基團(tuán)的溶酶體靶向熒光探針，通過連接不同的識(shí)別基團(tuán)(丙烯酰氯、4-硝基芐溴、苯甲酰氯、噻吩甲酰氯等)，用于檢測cys、h2s、過氧化氫、羧酸酯酶、胰凝乳蛋白酶等生物標(biāo)志物，通過1h?nmr、13cnmr和hr-esi-ms表征確定了每個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。

31、2、本發(fā)明中，設(shè)計(jì)并合成出6個(gè)以三苯基膦為靶向基團(tuán)的線粒體靶向熒光探針，通過連接不同的識(shí)別基團(tuán)(4-硝基芐溴、噻吩甲酰氯、乙酰氯、環(huán)丙基甲酰氯等)，用于檢測h2s、cys、過氧化氫、羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶等生物標(biāo)志物，通過1h?nmr、13cnmr和hr-esi-ms表征確定了每個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。

32、3、本發(fā)明中，設(shè)計(jì)合成的探針dcx-1結(jié)構(gòu)中含有丙烯酸酯單元，能夠選擇性的與半胱氨酸進(jìn)行反應(yīng)，形成硫醇化合物并脫去一分子七元環(huán)，釋放出熒光結(jié)構(gòu)，從而發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。探針dcx-1對半胱氨酸具有較強(qiáng)的選擇性，只能響應(yīng)半胱氨酸，對其他分析物(clo-、co32-、so42-、i-、br-、hs-、cu2+、na+、ca2+、fe3+、h2o2、gsh、hcy、gln、gly、tyr、arg、lys、bsa、胰蛋白酶、溶菌酶、維生素c、尿素等)無響應(yīng)。探針dcx-1具有出色的抗干擾能力，不會(huì)受到gsh、hcy、gln、tyr、arg、ala、ile、lys、phe、met、thr、gly、his的影響。探針dcx-1的斯托克斯位移可以達(dá)到173nm，檢測限低至0.31μm,能夠?qū)Π腚装彼峥焖夙憫?yīng)，在生理ph條件下穩(wěn)定。探針dcx-1具有良好的細(xì)胞和組織穿透性，可用于檢測細(xì)胞和斑馬魚中的內(nèi)源性和外源性半胱氨酸。由于引入了半乳糖基團(tuán)，因此具有出色的肝細(xì)胞靶向性和低細(xì)胞毒性。探針dcx-1可用于生物體內(nèi)半胱氨酸的精準(zhǔn)檢測，為檢測半胱氨酸相關(guān)疾病提供了有效工具，并有助于了解半胱氨酸在生命系統(tǒng)中的作用和功能。

33、4、本發(fā)明中，本文基于熒光探針的設(shè)計(jì)原理和經(jīng)典的有機(jī)合成方法，首次設(shè)計(jì)并成功合成出一系列基于二氰基異佛爾酮熒光基團(tuán)的，同時(shí)具有靶向能力和相關(guān)指標(biāo)檢測能力的雙功能熒光探針dcx-1～20，能夠精準(zhǔn)定位到肝細(xì)胞、溶酶體和線粒體，可以用于檢測h2s、cys、過氧化氫、羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶等生物標(biāo)志物。合成的代表性肝靶向熒光探針dcx-1具有優(yōu)異的光物理特性，對cys良好的選擇性,對其他分析物(clo-,co32-,so42-,i-,br-,hs-,cu2+,na+,ca2+,fe3+,h2o2，gsh，hcy，gln，gly，tyr，arg，lys，bsa，胰蛋白酶，溶菌酶，維生素c，尿素等)沒有響應(yīng)，卓越的抗干擾能力，良好的穩(wěn)定性，較低的細(xì)胞毒性，優(yōu)良的活細(xì)胞成像及肝靶向能力，并且可以用于斑馬魚體內(nèi)的cys成像，實(shí)現(xiàn)了生物體內(nèi)尤其是肝細(xì)胞中cys的可視化。