本發(fā)明屬于小干擾核酸藥物，具體地，本發(fā)明涉及一種sirna藥物、及其制藥用途，更具體地，本發(fā)明涉及一種sirna、sirna綴合物、藥物組合物及它們在制藥中的用途。

背景技術(shù)：

1、rna干擾(rna?interference，rnai)是由雙鏈rna(double-stranded?rna，dsrna)分子在mrna水平關(guān)閉同源基因的表達(dá)或使該基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。rna干擾技術(shù)又被形象地稱為基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene?silencing)，是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法，又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional?gene?silencing，ptgs)。最早有關(guān)rna干擾的報(bào)道出現(xiàn)在1990年，由兩個(gè)不同的研究小組同時(shí)報(bào)道了轉(zhuǎn)基因植物中的rna干擾現(xiàn)象，以后又在線蟲、果蠅、斑馬魚和小鼠等幾乎所有真核生物中觀察到了rna干擾現(xiàn)象。1999年，hamilton和baulcombe在發(fā)生rna干擾的植物中檢測到了長度為21-25個(gè)核苷酸的rna片段，這些rna片斷被證明是rna干擾所必需的，被稱為小干擾核酸(sirna)。雙鏈sirna與細(xì)胞源性的相關(guān)酶和蛋白質(zhì)形成rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(rna-induced?silencingcomplex，risc)。在rna干擾過程中，雙鏈sirna中的正義鏈被排除出復(fù)合體，反義鏈指導(dǎo)risc結(jié)合到靶mrna的同源位點(diǎn)，然后由復(fù)合物中的核糖核酸酶iii降解靶mrna，從而關(guān)閉靶基因的表達(dá)。

2、但是，由于小干擾核酸(sirna)的穩(wěn)定性較差，在體內(nèi)容易被核酸酶降解。目前通常采用對(duì)合成的sirna進(jìn)行化學(xué)修飾，以增加sirna的血清穩(wěn)定性，從而有效地抑制目的基因的。但是，現(xiàn)有的sirna的修飾方案中存在盲目地引入大量的修飾從而導(dǎo)致得到的修飾的小干擾核酸細(xì)胞毒性大問題。

3、因此，亟需開發(fā)一種穩(wěn)定性強(qiáng)、細(xì)胞毒性小的sirna。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提供了一種sirna，該sirna可抑制hbv的表達(dá)和復(fù)制，可阻斷hbv的一種或多種基因型進(jìn)入肝細(xì)胞。

2、在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種sirna，所述sirna中的每個(gè)核苷酸獨(dú)立地為經(jīng)修飾或未修飾的核苷酸，其包括一條正義鏈和一條反義鏈，所述反義鏈與所述正義鏈至少具有部分堿基配對(duì)的互補(bǔ)性區(qū)域；其中，所述正義鏈包括如seq?id?no:1～seq?idno:150所示的核苷酸序列中之一，或與其具有不多于5個(gè)核苷酸的差異；所述反義鏈包括seq?id?no:151～seq?id?no:300所示的核苷酸序列中之一，或與其具有不多于5個(gè)核苷酸的差異。發(fā)明人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到上述合適的小干擾rna(sirna)通過形成沉默復(fù)合體(rna-induced?silencing?complex，risc)，與靶標(biāo)基因(乙型肝炎病毒，簡稱乙肝病毒、hbv)的mrna的序列互補(bǔ)配對(duì)，使乙肝病毒的mrna降解，從而抑制hbv的表達(dá)和復(fù)制，可有效地預(yù)防和/或治療hbv引起的相關(guān)疾病。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述sirna還可以進(jìn)一步包括如下技術(shù)特征的至少之一：

3、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述正義鏈包括如下核苷酸序列之一，或與其具有不多于5個(gè)核苷酸的差異：seq?id?no:7、seq?id?no:9、seq?id?no:12、seq?id?no:13、seq?id?no:14、seq?id?no:15、seq?id?no:18、seq?id?no:20、seq?id?no:21、seq?id?no:22、seq?idno:40、seq?id?no:41、seq?id?no:46、seq?id?no:50、seq?id?no:51、seq?id?no:58、seq?idno:69、seq?id?no:93、seq?id?no:94、seq?id?no:97、seq?id?no:98、seq?id?no:99、seq?idno:115、seq?id?no:116、seq?id?no:118、seq?id?no:121、seq?id?no:122、seq?id?no:123、seq?id?no:124、seq?id?no:125、seq?id?no:127、seq?id?no:128、seq?id?no:129、seq?idno:130、seq?id?no:140、seq?id?no:148和seq?id?no:150；和/或，所述反義鏈包括如下核苷酸序列之一，或與其具有不多于5個(gè)核苷酸的差異：seq?id?no:157、seq?id?no:159、seqid?no:162、seq?id?no:163、seq?id?no:164、seq?id?no:165、seq?id?no:168、seq?id?no:170、seq?id?no:171、seq?id?no:172、seq?id?no:190、seq?id?no:191、seq?id?no:196、seqid?no:200、seq?id?no:201、seq?id?no:208、seq?id?no:219、seq?id?no:243、seq?id?no:244、seq?id?no:247、seq?id?no:248、seq?id?no:249、seq?id?no:265、seq?id?no:266、seqid?no:268、seq?id?no:271、seq?id?no:272、seq?id?no:273、seq?id?no:274、seq?id?no:275、seq?id?no:277、seq?id?no:278、seq?id?no:279、seq?id?no:280、seq?id?no:290、seqid?no:298和seq?id?no:300。

4、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述正義鏈包括如下核苷酸序列之一，或與其具有不多于5個(gè)核苷酸的差異：seq?id?no:12、seq?id?no:20、seq?id?no:40、seq?id?no:93、seq?id?no:97、seq?id?no:98、seq?id?no:99、seq?id?no:115、seq?id?no:116、seq?id?no:121、seq?idno:123、seq?id?no:124、seq?id?no:125、seq?id?no:129和seq?id?no:130；和/或，所述反義鏈包括如下核苷酸序列之一，或與其具有不多于5個(gè)核苷酸的差異：seq?id?no:162、seqid?no:170、seq?id?no:190、seq?id?no:243、seq?id?no:247、seq?id?no:248、seq?id?no:249、seq?id?no:265、seq?id?no:266、seq?id?no:271、seq?id?no:273、seq?id?no:274、seqid?no:275、seq?id?no:279和seq?id?no:280。

5、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述sirna包括如下之一：

6、具有如seq?id?no:12所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:162所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

7、具有如seq?id?no:20所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:170所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

8、具有如seq?id?no:40所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:190所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

9、具有如seq?id?no:93所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:243所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

10、具有如seq?id?no:97所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:247所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

11、具有如seq?id?no:98所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:248所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

12、具有如seq?id?no:99所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:249所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

13、具有如seq?id?no:115所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:265所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

14、具有如seq?id?no:116所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:266所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

15、具有如seq?id?no:121所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:271所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

16、具有如seq?id?no:123所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:273所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

17、具有如seq?id?no:124所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:274所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

18、具有如seq?id?no:125所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:275所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

19、具有如seq?id?no:129所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:279所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈；

20、具有如seq?id?no:130所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的正義鏈，具有如seq?id?no:280所示的核苷酸序列或與其區(qū)別不多于5個(gè)核苷酸的核苷酸序列的反義鏈。

21、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述正義鏈和/或反義鏈包含3’突出端和/或5’突出端，所述3’突出端或5’突出端包括至少1個(gè)核苷酸。

22、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述3’突出端或5’突出端包含至少2個(gè)核苷酸。

23、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述正義鏈和/或反義鏈包含3’突出端，所述3’突出端包含2個(gè)核苷酸。

24、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述正義鏈包含5’-gguuuuucuuguugacaaa-3’(seq?id?no:330)，且所述正義鏈的長度不超過21個(gè)核苷酸，所述反義鏈包含5’-uuugucaacaagaaaaacccc-3’(seq?id?no:190)，且所述反義鏈的長度不超過23個(gè)核苷酸，所述正義鏈和反應(yīng)鏈中的每個(gè)核苷酸均為經(jīng)修飾的核苷酸。

25、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述正義鏈和/或所述反義鏈包括至少一個(gè)修飾的核苷酸，所述修飾的核苷酸獨(dú)立任選地選自下列的至少之一：非天然堿基的核苷酸、脫氧核苷酸、2'-氟代修飾的核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、2’-o-烯丙基修飾的核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、2'–o-烷基修飾的核苷酸、鎖核苷酸、非鎖核苷酸、構(gòu)型限制性核苷酸、2'-烯丙基修飾的核苷酸、無堿基核苷酸、嗎啉基核苷酸、四氫吡喃修飾的核苷酸、1,5-脫水己糖醇修飾的核苷酸、環(huán)己烯基修飾的核苷酸、peg修飾的核苷酸、5'-氨基磷酸酯修飾的核苷酸、5'-硫代磷酸酯基修飾的核苷酸、5'-甲基膦酸酯基修飾的核苷酸、5'-磷酸酯模擬物修飾的核苷酸、5'-甲基化胞嘧啶修飾的核苷酸。

26、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述正義鏈和/或所述反義鏈中所有核苷酸均為修飾的核苷酸，所述修飾的核苷酸獨(dú)立任選地選自2'-甲氧基修飾的核苷酸、2'-氟代修飾的核苷酸和5'-硫代磷酸酯基修飾的核苷酸中的至少之一。

27、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述正義鏈和/或所述反義鏈中，2'-氟代修飾的核苷酸存在于以下位置：

28、所述正義鏈的5'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第5位、第7位、第8位和第9位；和/或

29、所述反義鏈的5'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第2位、第6位、第8位、第9位、第14位和第16位。

30、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述正義鏈和/或所述反義鏈中，5'-硫代磷酸酯基修飾的核苷酸存在于以下位置所組成：

31、所述正義鏈的5'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第1位和第2位；和/或

32、所述反義鏈的5'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第1位和第2位，和/或所述反義鏈的3'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第2位和第3位。

33、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述正義鏈和/或所述反義鏈中，2'-甲氧基修飾的核苷酸存在于以下位置：

34、所述正義鏈的5'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第1位、第2位、第3位、第4位、第6位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位和第19位；和/或

35、所述反義鏈的5'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第1位、第3位、第4位、第5位、第7位、第10位、第11位、第12位、第13位、第15位、第17位、第18位、第19位、第20位或第21位。

36、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述正義鏈和/或所述反義鏈中，2'-甲氧基修飾的核苷酸、2'-氟代修飾的核苷酸和5'-硫代磷酸酯基修飾的核苷酸存在于以下位置：

37、所述正義鏈的5'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第1位、第2位、第3位、第4位、第6位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位和第19位；和/或

38、所述反義鏈的5'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第1位、第3位、第4位、第5位、第7位、第10位、第11位、第12位、第13位、第15位、第17位、第18位、第19位、第20位或第21位；和/或

39、所述正義鏈的5'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第5位、第7位、第8位和第9位；和/或

40、所述正義鏈的5'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第1位和第2位；和/或

41、所述反義鏈的5'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第2位、第6位、第8、第9、第14位和第16位；和/或

42、所述反義鏈的5'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第1位和第2位，和/或反義鏈的3'末端的核苷酸為起始點(diǎn)的第2位和第3位。

43、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述sirna包括如下之一：

44、

45、

46、其中，所述正義鏈和反義鏈中，a、g、c和u分別為2'-o-甲基(2'-ome)a、2'-ome?g、2'-omec和2'-ome?u；af、cf、gf和uf分別為2'-氟a、2'-氟c、2'-氟g和2'-氟u；s表示核苷酸具有5'-硫代磷酸酯基修飾。

47、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述sirna包括sirna?id?no:152、sirna?id?no:153、sirnaid?no:155、sirna?id?no:162、sirna?id?no:163、sirna?id?no:164、sirna?id?no:165和sirna?id?no:166中之一：

48、

49、其中，所述正義鏈和反義鏈中，a、g、c和u分別為2'-o-甲基(2'-ome)a、2'-ome?g、2'-omec和2'-ome?u；af、cf、gf和uf分別為2'-氟a、2'-氟c、2'-氟g和2'-氟u；s表示核苷酸具有5'-硫代磷酸酯基修飾。

50、在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種sirna綴合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述sirna綴合物包括：本發(fā)明前述的sirna；配體，所述sirna與配體相連。本發(fā)明的sirna綴合物因?yàn)榕潴w的加入，可將很好地將藥物遞送至細(xì)胞，進(jìn)一步提高對(duì)乙肝病毒的mrna的降解，可有效地預(yù)防和/或治療hbv引起的相關(guān)疾病。

51、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明所述的sirna綴合物還可以進(jìn)一步包括如下技術(shù)特征的至少之一：

52、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述配體與所述正義鏈和/或反義鏈相連。

53、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述配體與所述正義鏈和/或反義鏈通過硫代磷酸酯鍵或磷酸酯鍵相連。

54、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述配體與所述正義鏈的5’端或3’端連接；或者，所述配體與所述反義鏈的5’端或3’端連接。

55、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述配體包括至少一個(gè)n-乙?；?半乳糖胺。

56、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述配體為galnac化合物。

57、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述galnac化合物包括l96或其異構(gòu)體(如立體異構(gòu)等)、daw4007-4或其異構(gòu)體(如立體異構(gòu)等)中的至少之一。

58、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述綴合物具有如下所述結(jié)構(gòu)或其異構(gòu)體(如立體異構(gòu)體)之一：

59、

60、其中，a為本發(fā)明所述的sirna。

61、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，a為具有如seq?id?no:312所示的核苷酸序列的正義鏈和具有如seq?id?no:328所示的核苷酸序列的反義鏈的sirna。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，a具體為sirna?id?no:163:ss(5’-3’)gs-gs-u-u-uf-u-uf-cf-uf-u-g-u–u-g-a–c-a-a-a(seq?idno?312)，as(5’-3’)us-ufs-u-g-u-cf-a-af-cf-a-a-g-a-af-a-af-a-c-cs-cs-c(seq?idno?328)，ss表示正義鏈，as表示反義鏈。

62、在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括：本發(fā)明前述的sirna或前述的sirna綴合物。由前可知，前述的sirna和sirna綴合物均可使乙型肝炎病毒的mrna降解，抑制hbv的表達(dá)和復(fù)制。由此，本發(fā)明的藥物組合物可有效地預(yù)防和/或治療hbv引起的相關(guān)疾病。

63、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物組合物進(jìn)一步包括：藥學(xué)上可接受的載體或輔料。

64、在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種前述的sirna、前述的sirna綴合物或前述的藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制乙型肝炎病毒基因的表達(dá)或活性。

65、在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種前述的sirna、前述的sirna綴合物或前述的藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎病毒引起的相關(guān)疾病。

66、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述乙型肝炎病毒引起的相關(guān)疾病包括急性乙型肝炎、急性暴發(fā)性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、末期肝病、肝纖維化、肝硬化和肝癌。

67、本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。