本技術涉及基因工程和分子檢測領域，是基于工程化改造crispr系統(tǒng)開發(fā)的核酸檢測方法，涉及在工程化rna的介導下由工程化的cas12b蛋白進行的靶向核酸檢測方法的建立，以及對相關檢測試劑盒開發(fā)的技術基礎和應用方向的確立，可應用于傳染病診斷、基因分型、家用便攜式診斷等方向。

背景技術：

1、基于crispr的反式切割活性于2016年首次發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)建立的核酸檢測技術已經(jīng)層出不窮，在核酸檢測領域產(chǎn)生了變革性的影響。sherlock、detectr之后，也陸續(xù)迭代了多種版本的檢測體系。尤其是自新型冠狀病毒出現(xiàn)以后，多個場景對于快速便攜、高靈敏、高特異性的檢測有了更多需求。相較于目前的金標準rt-qpcr，基于crispr建立的多種技術的核酸檢測具有快速便攜的特點，并且特異性方面可以實現(xiàn)單堿基的分辨率。然而，等溫擴增同該技術的耦聯(lián)也提升了氣溶膠污染和假陽性的風險；并且體系的不兼容影響了診斷的靈敏性和準確性。因此領域內亟需更加高效、穩(wěn)定的crispr系統(tǒng)來提升檢測試劑盒的性能。其中cas12b由于具有耐高溫、體外活性高、特異性高的特點，在開發(fā)核酸檢測試劑盒上具有很好的應用前景。因此，基于cas12b的crisper系統(tǒng)，通過進一步提升反式切割活性從而提升檢測準確性和靈敏性，是必要的。

技術實現(xiàn)思路

1、本技術提供一種基于工程化cas12b及sgrna骨架的核酸檢測方法，能夠特異性檢測dna。該專利通過工程化改造cas12b和sgrna骨架并且優(yōu)化了工程化的cas12b和sgrna的反式切割條件，旨在將工程化改造的cas12b在核酸檢測領域發(fā)揮更深遠廣泛的應用價值。其基于其反式切割活性相較于改造前更高的特點，更容易進行表達和用于下游應用，成本更低，具有廣泛的應用前景。該技術能夠提供快速簡便的dna或者rna檢測方法，適用于重大疾病篩查、基因檢測、醫(yī)藥健康、農業(yè)、化工業(yè)污染分析等各領域應用。

2、本技術涉及如下內容：

3、1.一種檢測生物樣品中靶核酸分子的存在和/或量的方法，所述方法包括以下步驟：

4、(a)使所述生物樣品接觸：i)cas12b蛋白，ii)針對所述靶核酸分子中的靶序列的grna，和iii)被切割后產(chǎn)生可檢測信號的單鏈dna報告分子，從而形成反應混合物；

5、(b)檢測所述反應混合物中產(chǎn)生的可檢測信號的存在和/或水平；

6、其中所述可檢測信號的存在和/或水平代表所述靶核酸分子的存在和/或量。

7、2.根據(jù)項1所述的方法，其中所述方法在體內或體外進行，或者所述方法為非診斷方法，優(yōu)選地，所述cas12b蛋白能夠識別的pam位點為nttn、ntan、ntcn、ntgn、naan、natn、nacn、nagn、nctn、ncan、nccn、ncgn、ngtn、ngan、ngcn、nggn(其中n為a、t、c、g中的任意一個堿基)。

8、3.根據(jù)項1或2的方法，所述靶核酸分子是雙鏈dna分子、單鏈dna分子或rna分子。

9、4.根據(jù)項1～3中任一項所述的方法，其中，所述grna是sgrna。

10、5.根據(jù)項1～4中任一項所述的方法，其中所述cas12b蛋白包含：

11、(1)與seq?id?no:1-2中任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列；

12、(2)相對于seq?id?no:1-2中任一序列具有一或多個氨基酸殘基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或

13、(3)seq?id?no:1-2中任一所示的氨基酸序列。

14、6.根據(jù)項4的方法，所述sgrna包括由選自seq?id?no:3-13之一的核酸序列編碼的骨架序列。

15、7.根據(jù)項4或6的方法，所述sgrna包括位于支架序列3’端的間隔區(qū)序列，其與靶序列或靶序列的互補序列特異性雜交。

16、8.根據(jù)權利要求7的方法，所述間隔區(qū)序列與靶序列具有至少一個核苷酸錯配。

17、9.根據(jù)項1～8任一項的方法，其中所述單鏈dna報告分子在兩端分別包含熒光基團和相應的淬滅基團，例如，所述熒光基團選自fam、tex、hex、cy3或cy5，所述淬滅基團選自bhq1、bhq2、bhq3或tamra。

18、10.根據(jù)項1～9任一項的方法，其中所述單鏈dna報告分子長度為大約2個～大約100個核苷酸。

19、11.根據(jù)項1～10任一項的方法，其中所述單鏈dna報告分子為聚腺苷酸、聚胞苷酸或聚胸苷酸。

20、12.根據(jù)項1～11任一項的方法，還包括在步驟(a)之前對所述生物樣品中的核酸分子進行擴增的步驟。

21、13.根據(jù)項12的方法，所述擴增包括但不限于pcr擴增、重組酶聚合酶擴增或環(huán)介導恒溫擴增(lamp)，優(yōu)選地，所述擴增是環(huán)介導恒溫擴增(lamp)。

22、14.根據(jù)項13的方法，所述環(huán)介導恒溫擴增進行約10分鐘～約60分鐘。

23、15.根據(jù)項1～14任一項的方法，其中在與所述生物樣品接觸之前，所述cas12b蛋白已經(jīng)與所述grna預先復合形成cas12b-grna復合物。

24、16.根據(jù)項1～15任一項的方法，所述步驟(a)的反應進行約1分鐘-約180分鐘，例如約1分鐘、約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約60分鐘、約90分鐘、約120分鐘，或之間的任何時間。

25、17.根據(jù)項1～16任一項的方法，步驟(a)在nebuffertm2、nebuffertm2.1、nebuffertm3.1、nebuffertm4、lamp?buffer、rnaseh?buffer、exo?buffer或buffer緩沖液中進行。

26、18.根據(jù)項1～17任一項的方法，其中所述生物樣品選自全血、血漿、血清、腦脊液、尿液、糞便、細胞或組織提取物。

27、19.根據(jù)項17的方法，其中所述生物樣品是提取自細胞或組織的核酸樣品。

28、20.來自alicyclobacillus?acidiphilus的cas12b蛋白或工程化改造的cas12b蛋白，在制備試劑或試劑盒中的用途，所述試劑或試劑盒用于通過包含以下步驟的方法檢測生物樣品中靶核酸分子的存在和/或量：

29、(a)使所述生物樣品接觸：i)所述cas12b蛋白，ii)針對所述靶核酸分子中的靶序列的grna，和iii)被切割后產(chǎn)生可檢測信號的單鏈dna報告分子，從而形成反應混合物；

30、(b)檢測所述反應混合物中產(chǎn)生的可檢測信號的存在和/或水平；

31、其中所述可檢測信號的存在和/或水平代表所述靶核酸分子的存在和/或量，優(yōu)選地，所述cas12b蛋白能夠識別的pam位點為nttn、ntan、ntcn、ntgn、naan、natn、nacn、nagn、nctn、ncan、nccn、ncgn、ngtn、ngan、ngcn、nggn，其中n為a、t、c、g中的任意一個堿基。

32、21.根據(jù)項20所述的用途，其中，所述cas12b蛋白包含：

33、(1)與seq?id?no:1-2中任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列；

34、(2)相對于seq?id?no:1-2中任一序列具有一或多個氨基酸殘基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或

35、(3)seq?id?no:1-2中任一所示的氨基酸序列。

36、22.根據(jù)項20或21所述的用途，所述靶核酸分子是雙鏈dna分子、單鏈dna分子或rna分子。

37、23.根據(jù)項20～22中任一項所述的用途，其中所述grna是sgrna。

38、24.根據(jù)項23所述的用途，所述sgrna包括由選自seq?id?no:3-13之一的核酸序列編碼的骨架序列。

39、25.根據(jù)項21或24所述的用途，所述sgrna包括位于支架序列3’端的間隔區(qū)序列，其與靶序列或靶序列的互補序列特異性雜交。

40、26.根據(jù)項25所述的用途，所述間隔區(qū)序列與靶序列具有至少一個核苷酸錯配。

41、27.根據(jù)項20～26中任一項所述的用途，其中所述單鏈dna報告分子在兩端分別包含熒光基團和相應的淬滅基團。

42、28.根據(jù)項27所述的用途，其中所述熒光基團選自fam、tex、hex、cy3或cy5，所述淬滅基團選自bhq1、bhq2、bhq3或tamra。

43、29.根據(jù)項20～28中任一項所述的用途，其中所述單鏈dna報告分子長度為2個～100個核苷酸。

44、30.根據(jù)項20～29中任一項所述的用途，其中所述單鏈dna報告分子為聚腺苷酸、聚胞苷酸或聚胸苷酸。

45、31.根據(jù)項20～30中任一項所述的用途，還包括在步驟(a)之前對所述生物樣品中的核酸分子進行擴增的步驟。

46、32.根據(jù)項31所述的用途，所述擴增是pcr擴增、重組酶聚合酶擴增或環(huán)介導恒溫擴增(lamp)。

47、33.根據(jù)項32所述的用途，所述重組酶聚合酶擴增進行10分鐘～60分鐘。

48、34.根據(jù)項20～33中任一項所述的用途，其中在與所述生物樣品接觸之前，所述cas12b蛋白已經(jīng)與所述grna預先復合形成cas12b-grna復合物。

49、35.根據(jù)項20～34中任一項所述的用途，所述步驟(a)的反應進行1分鐘～180分鐘。

50、36.根據(jù)項20～35中任一項所述的用途，步驟(a)在nebuffertm2、nebuffertm2.1、nebuffertm3.1、nebuffertm4、lamp?buffer、rnaseh?buffer、exo?buffer或buffer緩沖液中進行。

51、37.根據(jù)項20～36中任一項所述的用途，其中所述生物樣品選自全血、血漿、血清、腦脊液、尿液、糞便、細胞或組織提取物。

52、38.根據(jù)項37所述的用途，其中所述生物樣品是提取自細胞或組織的核酸樣品。

53、39.一種檢測生物樣品中靶核酸分子的存在和/或量的試劑盒，其包括：

54、(a)cas12b蛋白；

55、(b)針對所述靶核酸分子中的靶序列的grna，優(yōu)選地，所述cas12b蛋白能夠識別的pam位點為nttn、ntan、ntcn、ntgn、naan、natn、nacn、nagn、nctn、ncan、nccn、ncgn、ngtn、ngan、ngcn、nggn，其中n為a、t、c、g中的任意一個堿基)。

56、40.根據(jù)項39所述的試劑盒，其中，

57、所述cas12b蛋白包含：

58、(1)與seq?id?no:1-2中任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列；

59、(2)相對于seq?id?no:1-2中任一序列具有一或多個氨基酸殘基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或

60、(3)seq?id?no:1-2中任一所示的氨基酸序列；或者

61、所述grna是sgrna，優(yōu)選所述sgrna包括由選自seq?id?no:3-13之一的核酸序列編碼的支架序列。

62、發(fā)明效果

63、本技術改進后的工程化改造的cas12bmax能夠具有更高的反式切割活性和反應速度，cas12bmax可以將原本活性較差的位點的動力學曲線的平臺期提前，縮短了反應所需的時間。同時工程化的蛋白和sgrna的檢測體系也具有可以靶向更多的基因位點的潛能。

64、此外，利用本技術改進后的工程化改造的cas12bmax能夠在多種buffer中具有更高的反式切割活性和反應速度，兼容更多的體系。進一步的，在優(yōu)化的sgrna骨架體系中，工程化的cas12bmax具有更高的反式切割活性和更快的反應速率。且工程化改造的cas12bmax與優(yōu)化的sgrna骨架組合相較于其他組合，具有更高的熱穩(wěn)定性，更加廣泛的活性溫度，更高的反式切割活性更快的反應速率，大幅度提升了檢測試劑盒的檢測性能。

65、利用本技術的方法能夠有效地對猴痘病毒的存在和/或含量進行檢測。