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      基于工程化Cas12b及sgRNA骨架的核酸檢測方法與流程

      文檔序號:40278238發(fā)布日期:2024-12-11 13:14閱讀:來源:國知局

      技術(shù)特征:

      1.一種檢測生物樣品中靶核酸分子的存在和/或量的方法,所述方法包括以下步驟:

      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述方法在體內(nèi)或體外進行,或者所述方法為非診斷方法,優(yōu)選地,所述cas12b蛋白能夠識別的pam位點為nttn、ntan、ntcn、ntgn、naan、natn、nacn、nagn、nctn、ncan、nccn、ncgn、ngtn、ngan、ngcn、nggn,其中n為a、t、c、g中的任意一個堿基。

      3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法,所述靶核酸分子是雙鏈dna分子、單鏈dna分子或rna分子。

      4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法,其中,所述grna是sgrna。

      5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的方法,其中所述cas12b蛋白包含:

      6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法,所述sgrna包括由選自seq?id?no:3-13之一的核酸序列編碼的骨架序列。

      7.根據(jù)權(quán)利要求4或6的方法,所述sgrna包括位于支架序列3’端的間隔區(qū)序列,其與靶序列或靶序列的互補序列特異性雜交。

      8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法,所述間隔區(qū)序列與靶序列具有至少一個核苷酸錯配。

      9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項的方法,其中所述單鏈dna報告分子在兩端分別包含熒光基團和相應(yīng)的淬滅基團,例如,所述熒光基團選自fam、tex、hex、cy3或cy5,所述淬滅基團選自bhq1、bhq2、bhq3或tamra。

      10.根據(jù)權(quán)利要求1~9任一項的方法,其中所述單鏈dna報告分子中單鏈dna的長度為大約2個~大約100個核苷酸。

      11.根據(jù)權(quán)利要求1~10任一項的方法,其中所述單鏈dna報告分子為聚腺苷酸、聚胞苷酸或聚胸苷酸。

      12.根據(jù)權(quán)利要求1~11任一項的方法,還包括在步驟(a)之前對所述生物樣品中的核酸分子進行擴增的步驟。

      13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法,所述擴增包括但不限于pcr擴增、重組酶聚合酶擴增或環(huán)介導恒溫擴增(lamp),優(yōu)選地,所述擴增是環(huán)介導恒溫擴增(lamp)。

      14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法,所述環(huán)介導恒溫擴增進行約10分鐘~約60分鐘。

      15.根據(jù)權(quán)利要求1~14任一項的方法,其中在與所述生物樣品接觸之前,所述cas12b蛋白已經(jīng)與所述grna預(yù)先復(fù)合形成cas12b-grna復(fù)合物。

      16.根據(jù)權(quán)利要求1~15任一項的方法,所述步驟(a)的反應(yīng)進行約1分鐘~約180分鐘,例如約1分鐘、約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約60分鐘、約90分鐘、約120分鐘,或之間的任何時間。

      17.根據(jù)權(quán)利要求1~16任一項的方法,步驟(a)在nebuffertm2、nebuffertm2.1、nebuffertm3.1、nebuffertm4、lamp?buffer、rnaseh?buffer、exo?buffer或buffer緩沖液中進行。

      18.根據(jù)權(quán)利要求1~17任一項的方法,其中所述生物樣品選自全血、血漿、血清、腦脊液、尿液、糞便、細胞或組織提取物。

      19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法,其中所述生物樣品是提取自細胞或組織的核酸樣品。

      20.來自alicyclobacillus?acidiphilus的cas12b蛋白或工程化改造的cas12b蛋白,在制備試劑或試劑盒中的用途,所述試劑或試劑盒用于通過包含以下步驟的方法檢測生物樣品中靶核酸分子的存在和/或量:

      21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途,其中,所述cas12b蛋白包含:

      22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的用途,所述靶核酸分子是雙鏈dna分子、單鏈dna分子或rna分子。

      23.根據(jù)權(quán)利要求20~22中任一項所述的用途,其中所述grna是sgrna。

      24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的用途,所述sgrna包括由選自seq?id?no:3-13之一的核酸序列編碼的骨架序列。

      25.根據(jù)權(quán)利要求21或24所述的用途,所述sgrna包括位于支架序列3’端的間隔區(qū)序列,其與靶序列或靶序列的互補序列特異性雜交。

      26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的用途,所述間隔區(qū)序列與靶序列具有至少一個核苷酸錯配。

      27.根據(jù)權(quán)利要求20-26中任一項所述的用途,其中所述單鏈dna報告分子在兩端分別包含熒光基團和相應(yīng)的淬滅基團。

      28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的用途,其中所述熒光基團選自fam、tex、hex、cy3或cy5,所述淬滅基團選自bhq1、bhq2、bhq3或tamra。

      29.根據(jù)權(quán)利要求20~28中任一項所述的用途,其中所述單鏈dna報告分子中單鏈dna的長度為2個~100個核苷酸。

      30.根據(jù)權(quán)利要求20~29中任一項所述的用途,其中所述單鏈dna報告分子為聚腺苷酸、聚胞苷酸或聚胸苷酸。

      31.根據(jù)權(quán)利要求20~30中任一項所述的用途,還包括在步驟(a)之前對所述生物樣品中的核酸分子進行擴增的步驟。

      32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的用途,所述擴增是pcr擴增、重組酶聚合酶擴增或環(huán)介導恒溫擴增(lamp)。

      33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的用途,所述重組酶聚合酶擴增進行10分鐘~60分鐘。

      34.根據(jù)權(quán)利要求20~33中任一項所述的用途,其中在與所述生物樣品接觸之前,所述cas12b蛋白已經(jīng)與所述grna預(yù)先復(fù)合形成cas12b-grna復(fù)合物。

      35.根據(jù)權(quán)利要求20~34中任一項所述的用途,所述步驟(a)的反應(yīng)進行1分鐘~180分鐘。

      36.根據(jù)權(quán)利要求20~35中任一項所述的用途,步驟(a)在nebuffertm2、nebuffertm2.1、nebuffertm3.1、nebuffertm4、lamp?buffer、rnaseh?buffer、exo?buffer或buffer緩沖液中進行。

      37.根據(jù)權(quán)利要求20~36中任一項所述的用途,其中所述生物樣品選自全血、血漿、血清、腦脊液、尿液、糞便、細胞或組織提取物。

      38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的用途,其中所述生物樣品是提取自細胞或組織的核酸樣品。

      39.一種檢測生物樣品中靶核酸分子的存在和/或量的試劑盒,其包括:

      40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的試劑盒,其中,


      技術(shù)總結(jié)
      本申請涉及基于工程化Cas12b及sgRNA骨架的核酸檢測方法,所述方法包括以下步驟:(a)使所述生物樣品接觸:i)Cas12b蛋白,ii)針對所述靶核酸分子中的靶序列的gRNA,和iii)被切割后產(chǎn)生可檢測信號的單鏈DNA報告分子,從而形成反應(yīng)混合物;(b)檢測所述反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的可檢測信號的存在和/或水平;其中所述可檢測信號的存在和/或水平代表所述靶核酸分子的存在和/或量。

      技術(shù)研發(fā)人員:李偉,周琪,陳陽燦,王鑫閣,駱勝球,毛邦煒
      受保護的技術(shù)使用者:北京干細胞與再生醫(yī)學研究院
      技術(shù)研發(fā)日:
      技術(shù)公布日:2024/12/10
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