本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種具有胞嘧啶脫氨功能可應(yīng)用于人類或動物基因編輯的融合蛋白、表達(dá)構(gòu)建體、堿基編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、線粒體是重要的半自主細(xì)胞器，擁有自己的基因組。人類線粒體基因組是一個16.6kb的雙鏈環(huán)狀dna(線粒體dna,mtdna))，包含37個基因，編碼呼吸鏈復(fù)合物的13個亞基、2個rrna和22個轉(zhuǎn)移rna(trna)。根據(jù)mitomap數(shù)據(jù)，在mtdna中發(fā)現(xiàn)了超過19500個單核苷酸變異(snv)，其中超過250個被認(rèn)為與疾病相關(guān)，包括萊伯遺傳性視神經(jīng)神經(jīng)病、利氏綜合征、進(jìn)行性腦肌病、melas等。線粒體基因編輯為人類細(xì)胞系和動物線粒體遺傳性疾病的疾病建模以及未來這些疾病的治療鋪平了道路。

2、線粒體基因編輯工具包括工程化鋅指核酸酶(zfn)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)核酸酶(talen)以及成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(crispr)和crispr相關(guān)蛋白(cas)(crispr/cas)。這些基因編輯工具會在使用者選定的基因組位點引入雙鏈dna斷裂(dsb)或dna堿基的化學(xué)改變(例如胞嘧啶的脫氨處理)。dsb的dna修復(fù)以及修復(fù)過程中的化學(xué)變化會導(dǎo)致使用者所期待的dna序列變異。

3、基于crispr/cas的基因組編輯是最廣泛使用的編輯核基因組的技術(shù)，但由于crispr的引導(dǎo)rna(grna)組件難以遞送到真核生物的細(xì)胞器中，因此使用crispr/cas來編輯線粒體基因組是不可行的。目前已經(jīng)發(fā)展出兩種類型更有效的依賴轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子(transcription?activator-like?effecto，tale，也被稱為轉(zhuǎn)錄激活因子類效應(yīng)因子，是一種靶向特異dna序列的dna結(jié)合域)的細(xì)胞器基因編輯技術(shù)。

4、第一類是由細(xì)菌來源的胞嘧啶脫氨酶結(jié)構(gòu)域(雙鏈dna特異性胞苷脫氨酶，ddda)衍生的胞嘧啶堿基編輯器(ddcbe)，該編輯器的結(jié)構(gòu)如圖1所示。其中，ddda是雙鏈dna脫氨酶，因此ddcbe能以雙鏈dna為底物實現(xiàn)堿基編輯。構(gòu)建ddcbe時，由于ddda具有強(qiáng)細(xì)胞毒性，ddda被分裂為dddatoxn和dddatoxc兩部分從而避免細(xì)胞毒性。實施線粒體基因編輯過程中，一個tale陣列(tale-l)與dddatoxn融合，一個tale陣列(tale-r)與dddatoxc融合；兩種融合蛋白均進(jìn)一步與線粒體轉(zhuǎn)運肽和尿嘧啶糖基化酶抑制劑(ugi)融合。兩種融合蛋白靶向線粒體基因組靶標(biāo)序列后，dddatoxn和dddatoxc得以重新靠近并結(jié)合在一起，從而使雙鏈dna的胞苷脫氨，最終以高靶標(biāo)特異性催化人類線粒體dna(mtdna)中的c·g到t·a的轉(zhuǎn)化。

5、然而，細(xì)菌胞苷脫氨酶ddda衍生的胞嘧啶堿基編輯器(ddcbe)在很大程度上僅限于底物dna5'-tc環(huán)境中的c到t轉(zhuǎn)換(例如tc到tt轉(zhuǎn)換)，僅適用于生成所有可能的轉(zhuǎn)變(嘌呤到嘌呤和嘧啶到嘧啶)突變的1/8。同時，為避免細(xì)胞毒性，ddda被分裂為dddatoxn和dddatoxc兩部分，兩部分均由tale?dna結(jié)合域引導(dǎo)到靶標(biāo)位點。

6、第二類如圖2所示，是將foki切口酶、單鏈特異性胞苷脫氨酶及核酸外切酶與tale陣列及細(xì)胞器轉(zhuǎn)運肽融合，細(xì)胞器轉(zhuǎn)運肽和tale陣列將融合蛋白靶向目標(biāo)序列后，foki切口酶和核酸外切酶促使生成單鏈dna底物，單鏈特異性胞苷脫氨酶進(jìn)一步催化單鏈dna的胞苷脫氨，最終以催化細(xì)胞器dna中的c·g到t·a的轉(zhuǎn)化。

7、但cydent包含了一對tale、一個foki切口酶、一個單鏈特異性胞苷脫氨酶、一個核酸外切酶及一個ugi等多個組分。這些組分由四個啟動子驅(qū)動表達(dá)，這使得最終轉(zhuǎn)化載體大小超過20kb，一方面增加載體組裝難度和遺傳轉(zhuǎn)化難度，另一方面限制了往cydent載體加入更多其他組件的潛力。

8、因此，更具適用范圍和潛力的細(xì)胞編輯器仍有待開發(fā)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、由此，本發(fā)明提供一種可克服基序依賴性且更為簡化的適用人類細(xì)胞系和動物線粒體基因組以及核基因組的胞嘧啶堿基編輯器，同時本發(fā)明還提供了該編輯器的具體應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一方面是提供了一種融合蛋白，其含有胞嘧啶脫氨功能域，該胞嘧啶脫氨功能域包括sdd和ddda的e1347a突變體；上述sdd和ddda的e1347a突變體之間通過接頭進(jìn)行連接，該接頭為如seq?id?no.7所示的氨基酸序列。

3、本發(fā)明中，上述sdd包括但不限于sdd7、sdd3、sdd6等中的任一種。在本發(fā)明的一種具體實施方式中，上述sdd為sdd7。

4、在本發(fā)明的一種具體實施方式中，上述融合蛋白還包括靶向結(jié)構(gòu)域，該靶向結(jié)構(gòu)域為tale。

5、在本發(fā)明的一種具體實施方式中，上述融合蛋白還包括一個或多個定位序列，該定位序列為線粒體轉(zhuǎn)運肽(mts)或核定位信號肽(bpnls)。

6、在本發(fā)明的一種具體實施方式中，上述融合蛋白還可包括尿嘧啶dna糖基化酶抑制劑，或上述融合蛋白可與尿嘧啶dna糖基化酶抑制劑共表達(dá)。

7、在本發(fā)明的一種具體實施方式中，上述融合蛋白從n端開始依次包括：定位序列、tale、sdd、ddda的e1347a突變體(dddae1347a)以及尿嘧啶dna糖基化酶抑制劑。其中sdd和dddae1347a之間通過如seq?id?no.7所示的氨基酸序列的接頭進(jìn)行連接。

8、本發(fā)明的第二方面是提供了一組融合蛋白，其包括左融合蛋白和右融合蛋白，其中，左融合蛋白由定位序列、tale-l、e1347a突變體和ugi所組成，所述右融合蛋白由定位序列、tale-r和sdd所組成。

9、在本發(fā)明的一種具體實施方式中，上述融合蛋白中的sdd包括但不限于sdd7、sdd3、sdd6等中的任一種。

10、在本發(fā)明的一種具體實施方式中，上述融合蛋白中的定位序列為線粒體轉(zhuǎn)運肽(mts)或核定位信號肽(bpnls)。

11、本發(fā)明的第三方面一種表達(dá)構(gòu)建體，該表達(dá)構(gòu)建體含有編碼如本發(fā)明上述第一和第二方面提及的任一種融合蛋白的核苷酸序列。

12、本發(fā)明的第四方面是提供了一種堿基編輯系統(tǒng)，該堿基編輯系統(tǒng)含有如本發(fā)明上述第一和第二方面提及的任一種融合蛋白，和/或如本發(fā)明上述第三方面提及的任一種表達(dá)構(gòu)建體。

13、本發(fā)明的第五方面是提供了一種堿基編輯方法，該堿基編輯方法采用如上述第四方面提及的堿基編輯系統(tǒng)與人類或動物的雙鏈dna反應(yīng)。

14、本發(fā)明的第六方面是提供了上述第一和第二方面的任一種融合蛋白、第三方面的表達(dá)構(gòu)建體或第四方面的堿基編輯系統(tǒng)在人類或動物基因編輯領(lǐng)域的應(yīng)用。

15、本發(fā)明提供了可應(yīng)用于人類或動物基因編輯的包含dddae1347a與sdd的融合蛋白，該融合蛋白包括單融合蛋白模式(單一融合蛋白)和雙融合蛋白模式(左融合蛋白和右融合蛋白)。兩種模式下該融合蛋白均可實現(xiàn)對雙鏈dna的非5'-tc序列基序依賴性的胞嘧啶脫氨功能，其在保持高堿基編輯效率的基礎(chǔ)上極大地克服ddcbe對底物dna5'-tc序列基序依賴性，從而擴(kuò)大c到t堿基編輯的適用范圍。

16、進(jìn)一步的，上述單融合模式相對簡化胞嘧啶堿基編輯器組分，由單體緊湊的tlae融合蛋白即可完成線粒體dna的c到t堿基編輯，從而簡化載體構(gòu)建過程，并使緊湊的胞嘧啶堿基編輯器可便于與更多的組分配合使用。同時，本發(fā)明中的胞嘧啶堿基編輯器不局限于人類或動物的線粒體基因編輯，其適用范圍擴(kuò)大到人類或動物的細(xì)胞核基因組的堿基編輯。