本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于檢測(cè)肺結(jié)節(jié)良惡性的引物探針組合、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肺癌為呼吸系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，具有發(fā)病率和病死率高等特點(diǎn)，近年來隨醫(yī)療水平改善，雖可有效延長(zhǎng)患者生存期，但晚期肺癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲后仍具有較高病死風(fēng)險(xiǎn)。報(bào)道顯示，早期肺癌無特異性臨床癥狀，多數(shù)患者易忽略，而出現(xiàn)癥狀就診時(shí)已處于中晚期，加大治療難度，影響預(yù)后恢復(fù)。因此，早期準(zhǔn)確篩查肺癌具有重大意義。ct檢查為目前臨床診斷惡性腫瘤的主要方案，可清晰呈現(xiàn)人體內(nèi)部微小病變，但其輻射對(duì)人體存在一定危害性，一年只能做一次。cyfra21-1、nse、scc、cea等血清學(xué)標(biāo)記物檢測(cè)靈敏度與特異度不高，治療前陰性的患者治療后不能評(píng)價(jià)，不適合應(yīng)用。因此，面對(duì)如今愈發(fā)嚴(yán)峻的癌癥診療形勢(shì)，許多專家學(xué)者都在呼吁開發(fā)新的檢測(cè)指標(biāo)。特別是對(duì)于癌癥早篩領(lǐng)域。

2、表觀遺傳修飾被定義為不涉及基礎(chǔ)dna序列變化的遺傳性基因活性變化，這些修飾通過表觀遺傳因素微調(diào)基因表達(dá)程序，是控制細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等關(guān)鍵生物過程的主要分子機(jī)制，并且強(qiáng)有力的證據(jù)表明表觀遺傳重編程是癌癥動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的驅(qū)動(dòng)力。dna甲基化的變化在癌癥早期就能出現(xiàn)，而且dna甲基化與癌細(xì)胞中大量的異常改變相關(guān)，基因啟動(dòng)子區(qū)域的超甲基化被認(rèn)為具有致癌和影響預(yù)后作用。所以，dna甲基化分析可有效識(shí)別具有臨床意義的腫瘤甲基化標(biāo)志物。既往研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中存在多個(gè)基因，如shox2、dapk、hoxa7、rassf1a、itga4、fhit、gstp1的高甲基化或低甲基化，其在肺癌診斷或預(yù)后評(píng)估中均有一定的價(jià)值。

3、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal?growth?factor?receptor，egfr)，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)egfr基因發(fā)生突變時(shí)，可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控，從而引發(fā)肺癌等惡性腫瘤。egfr基因突變檢測(cè)既有助于指導(dǎo)肺癌的治療方案，還可以預(yù)測(cè)肺癌患者對(duì)某些治療方案的反應(yīng)。此外，egfr基因突變檢測(cè)還可以預(yù)測(cè)肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。因此，egfr基因突變檢測(cè)對(duì)肺癌的診療具有重要意義。

4、近年來，諸如：全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序(whole-genome?bisulfite?sequencing，wgbs)、甲基敏感限制性內(nèi)切酶測(cè)序(methyl-sensitive?restriction?enzymesequencing，mre-seq)等高通量技術(shù)(high-throughput?technologies)的出現(xiàn)加速并擴(kuò)展了人們對(duì)腫瘤發(fā)生的表觀遺傳機(jī)制的認(rèn)識(shí)，揭示了大量具有潛在價(jià)值的癌癥特異性表觀遺傳標(biāo)記或特征，這些標(biāo)記或特征可用于腫瘤診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)或其對(duì)治療的反應(yīng)評(píng)估。但是，高通量技術(shù)受限于價(jià)格昂貴、周期長(zhǎng)、所需樣本量大等問題。因此，有必要開發(fā)一種新的肺癌試劑盒，以提供更豐富、更簡(jiǎn)單以及更廉價(jià)的多組學(xué)檢測(cè)方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)肺結(jié)節(jié)良惡性的引物探針組合、試劑盒及其應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便、快捷、精準(zhǔn)的輔助鑒別肺結(jié)節(jié)良惡性的dna甲基化和基因突變的聯(lián)合檢測(cè)方案，本發(fā)明提供的引物探針組合可以同時(shí)檢測(cè)egfr?l858r突變位點(diǎn)、egfr?19del突變位點(diǎn)、hoxa7基因甲基化位點(diǎn)、ccna1基因甲基化位點(diǎn)和znf808基因甲基化位點(diǎn)。由此可見，本發(fā)明提供了一種更豐富、簡(jiǎn)單且廉價(jià)的多組學(xué)檢測(cè)方案。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)肺結(jié)節(jié)良惡性的引物探針組合，包括檢測(cè)基因突變位點(diǎn)和甲基化位點(diǎn)的引物對(duì)和探針；

4、所述基因突變位點(diǎn)包括egfr?l858r位點(diǎn)和egfr?19del位點(diǎn)；所述甲基化位點(diǎn)包括hoxa7基因甲基化位點(diǎn)、ccna1基因甲基化位點(diǎn)和znf808基因甲基化位點(diǎn)；

5、檢測(cè)所述egfr?l858r位點(diǎn)的引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no.1-2所示，探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

6、檢測(cè)所述egfr?19del位點(diǎn)的引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no.4-5所示，探針的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

7、檢測(cè)所述hoxa7基因甲基化位點(diǎn)的引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no.10-11所示，探針的核苷酸序列如seq?id?no.12所示；

8、檢測(cè)所述ccna1基因甲基化位點(diǎn)的引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no.13-14所示，探針的核苷酸序列如seq?id?no.15所示；

9、檢測(cè)所述znf808基因甲基化位點(diǎn)的引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no.16-17所示，探針的核苷酸序列如seq?id?no.18所示。

10、優(yōu)選的，檢測(cè)所述egfr?l858r位點(diǎn)、所述egfr?19del位點(diǎn)、所述hoxa7基因甲基化位點(diǎn)、所述ccna1基因甲基化位點(diǎn)和所述znf808基因甲基化位點(diǎn)的探針，其5'端均標(biāo)記熒光基團(tuán)，3'端均標(biāo)記淬滅基團(tuán)。

11、優(yōu)選的，所述熒光基團(tuán)為fam、vic、hex、rox和cy5中的一種；所述淬滅集團(tuán)為mgb、super?quencher?1、bhq1、bhq2和bhq3中的一種。

12、優(yōu)選的，檢測(cè)所述egfr?l858r位點(diǎn)的探針的第12位-第15位堿基為隨機(jī)錯(cuò)配序列；檢測(cè)所述egfr?19del位點(diǎn)的探針的第11位-第14位堿基為隨機(jī)錯(cuò)配序列。

13、本發(fā)明提供了上述的引物探針組合在制備鑒別肺結(jié)節(jié)良惡性的試劑盒中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明提供了一種用于鑒別肺結(jié)節(jié)良惡性的試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物探針組合。

15、本發(fā)明提供了上述的引物探針組合在制備肺癌早期篩選的試劑盒中的應(yīng)用。

16、本發(fā)明提供了一種用于肺癌早期篩選的試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物探針組合。

17、本發(fā)明提供了上述的引物探針組合在構(gòu)建肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型中的應(yīng)用。

18、本發(fā)明提供了一種肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，利用上述的引物探針組合對(duì)檢測(cè)樣本進(jìn)行熒光擴(kuò)增檢測(cè)，得到egfr?l858r基因突變的熔曲rm、egfr?19del基因突變的熔曲rm、hoxa7基因甲基化位點(diǎn)的ct值、ccna1基因甲基化位點(diǎn)的ct值和znf808甲基化位點(diǎn)的ct值；

19、以所述egfr?l858r基因突變的熔曲rm、egfr?19del基因突變的熔曲rm、hoxa7基因甲基化位點(diǎn)的ct值、ccna1基因甲基化位點(diǎn)的ct值和znf808甲基化位點(diǎn)的ct值為輸入變量，構(gòu)建肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型；所述肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型按照以下方程計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)值p：

20、p＝-0.146*egfr?l858r基因突變的熔曲rm+0.145*egfr?19del基因突變的熔曲rm-0.359*ccna1基因甲基化位點(diǎn)的ct值-0.466*hoxa7基因甲基化位點(diǎn)的ct值-0.306*znf808甲基化位點(diǎn)的ct值+48.037；

21、當(dāng)所述p＞-0.64時(shí)，樣本檢測(cè)結(jié)果為陽性；當(dāng)所述p≤-0.64時(shí)，樣本檢測(cè)結(jié)果為陰性。

22、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

23、本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)肺結(jié)節(jié)良惡性的引物探針組合，基于自主研發(fā)的j-star-2m多色擴(kuò)增熔解曲線法技術(shù)，在同一擴(kuò)增程序條件下，采用taq?dna聚合酶和引物探針組合，可實(shí)現(xiàn)基因突變和基因甲基化位點(diǎn)的兼容性檢測(cè)。

24、該引物探針組合包括檢測(cè)基因突變位點(diǎn)和甲基化位點(diǎn)的引物對(duì)和探針，可實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)同時(shí)覆蓋egfr?l858r突變位點(diǎn)、egfr?19del突變位點(diǎn)以及hoxa7、ccna1和znf808基因甲基化位點(diǎn)。由此可見，本發(fā)明是一種簡(jiǎn)便、快捷、精準(zhǔn)的輔助鑒別肺結(jié)節(jié)良惡性的dna甲基化和基因突變的聯(lián)合檢測(cè)方案；同時(shí)該引物探針組合能夠?qū)崿F(xiàn)癌前快速篩查，還具有精準(zhǔn)用藥指導(dǎo)以及預(yù)后轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)等應(yīng)用價(jià)值。

25、本發(fā)明還提供了一種試劑盒，該試劑盒包含包括上述的引物探針組合，根據(jù)基因突變位點(diǎn)和基因甲基化位點(diǎn)分為兩個(gè)反應(yīng)管，即反應(yīng)管1和反應(yīng)管2，其中，反應(yīng)管1為egfrl858r突變位點(diǎn)和egfr?19del突變位點(diǎn)檢測(cè)管，反應(yīng)管2為hoxa7、ccna1和znf808基因甲基化檢測(cè)管。本發(fā)明采用冷凍干燥技術(shù)，將反應(yīng)管1和反應(yīng)管2中的酶、引物、探針、酶保護(hù)劑、一價(jià)和二價(jià)陽離子化合物以及緩沖劑等物質(zhì)進(jìn)行凍干，凍干后，密封于真空避光袋中，可實(shí)現(xiàn)常溫運(yùn)輸與室溫穩(wěn)定保存。

26、本發(fā)明提供的試劑盒的反應(yīng)管1中的探針為阻斷修飾熒光探針，通過在探針5’端設(shè)置隨機(jī)堿基與發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在不存在錯(cuò)配的情況下，與dna模板結(jié)合穩(wěn)定性強(qiáng)于核苷酸探針與dna模板；在錯(cuò)配情況下，阻斷修飾熒光探針與dna模板結(jié)合穩(wěn)定性弱于核苷酸探針與dna模板。因此，對(duì)于單個(gè)堿基的錯(cuò)配，阻斷修飾熒光探針相比核苷酸探針具有更大的熔解溫度差，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)野生型擴(kuò)增信號(hào)的抑制，提高在高比例野生型背景條件下的突變型檢測(cè)靈敏度和特異性；本發(fā)明試劑盒的反應(yīng)管2中的探針為短序列肽核酸修飾探針，通過在甲基化位點(diǎn)處，設(shè)計(jì)肽核酸修飾，當(dāng)肽核酸修飾位點(diǎn)存在甲基化時(shí)，肽核酸修飾探針與dna模版結(jié)合親合度強(qiáng)于普通taqman探針，進(jìn)而提高甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)靈敏度。此外，肽核酸修飾可提高探針的熔鏈溫度，可實(shí)現(xiàn)探針的短序列化，進(jìn)而增強(qiáng)探針的特異性。

27、而且本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明提供的試劑盒能夠有效區(qū)分惡性肺結(jié)節(jié)患者和良性肺結(jié)節(jié)受試者，實(shí)現(xiàn)低侵襲性、低成本、高靈敏性、高特異性的檢測(cè)肺結(jié)節(jié)良惡性，其檢測(cè)惡性肺結(jié)節(jié)血液樣本的總靈敏性可達(dá)89.61％，檢測(cè)良性肺結(jié)節(jié)血液樣本的特異性可達(dá)95.30％，能夠降低假陰性結(jié)果的檢出，檢測(cè)準(zhǔn)確度高。