本發(fā)明屬于生物，具體涉及啟動(dòng)子元件及其在3-羥基丙酸生物合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、公開(kāi)該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

2、解脂耶氏酵母(yarrowia?lipolytica)是一種非常規(guī)酵母，具有獨(dú)特的生理和代謝優(yōu)勢(shì)，是一種極具潛力的真核微生物細(xì)胞工廠。合成生物學(xué)元件的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用極大地提高了細(xì)胞工廠構(gòu)建的靈活性。

3、其中，啟動(dòng)子元件是合成生物學(xué)和代謝工程中基因表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)。但是，目前缺乏針對(duì)解脂耶氏酵母中天然啟動(dòng)子的系統(tǒng)研究，并且可供選擇的啟動(dòng)子種類十分有限，特別是通用型動(dòng)態(tài)調(diào)控啟動(dòng)子尚無(wú)報(bào)道。因此，深入挖掘解脂耶氏酵母的啟動(dòng)子元件，擴(kuò)展合成生物學(xué)工具包成為亟須解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明目的在于提供啟動(dòng)子元件及其在3-羥基丙酸生物合成中的應(yīng)用。具體的，本發(fā)明對(duì)不同培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)階段的解脂耶氏酵母野生菌株po1f進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，根據(jù)轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)強(qiáng)度和趨勢(shì)，選取不同的天然啟動(dòng)子作為候選，成功篩選得到一系列生長(zhǎng)調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子和梯度強(qiáng)度型啟動(dòng)子。同時(shí)，將篩選到的啟動(dòng)子應(yīng)用于解脂耶氏酵母中3-羥基丙酸(3-hp)生物合成途徑的模塊化構(gòu)建，優(yōu)化解脂耶氏酵母的代謝途徑和生物過(guò)程，并獲得一株利用葡萄糖高效合成3-hp的解脂耶氏酵母菌株。基于上述研究成果，從而完成本發(fā)明。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種啟動(dòng)子元件，所述啟動(dòng)子元件為如下(a)-(b)任一項(xiàng)所示：

4、(a)：如下表所示的啟動(dòng)子：

5、

6、

7、

8、(b)在(a)中所示啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上，將所述啟動(dòng)子的核苷酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加；

9、其中，所述“多個(gè)”可以為不多于400個(gè)，如在啟動(dòng)子5’端添加(延長(zhǎng))400bp或200bp；或者在啟動(dòng)子5’端進(jìn)行缺失(截短)400bp、200bp、100bp、50bp、25bp等，在此不做具體限定。

10、本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供上述啟動(dòng)子元件在3-羥基丙酸生物合成中的應(yīng)用。

11、具體的，本發(fā)明以解脂耶氏酵母po1f為出發(fā)菌株，通過(guò)引入并優(yōu)化c.aurantiacus來(lái)源的丙二酰-輔酶a還原酶mcr，構(gòu)建不同強(qiáng)度啟動(dòng)子組合平衡mcr-c與mcr-n的基因表達(dá)量，動(dòng)態(tài)下調(diào)fas1基因來(lái)弱化競(jìng)爭(zhēng)途徑對(duì)3-hp直接前體的消耗，并增強(qiáng)前體供應(yīng)基因表達(dá)。以一種動(dòng)態(tài)和平衡調(diào)節(jié)的新策略成功構(gòu)建一株以葡萄糖為碳源，高效生產(chǎn)3-hp的工程菌株，最后利用該菌株在5-l發(fā)酵罐中進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，分批補(bǔ)料發(fā)酵中，3-hp產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)速率分別達(dá)到100.37g/l、0.21g/g、0.48g/l/h。這是目前為止已報(bào)道以葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)3-hp的最高產(chǎn)量。從而表明上述不同調(diào)控類型的啟動(dòng)子元件在解脂耶氏酵母代謝工程中的應(yīng)用潛力。

12、因此，本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供一株高產(chǎn)3-羥基丙酸工程菌，所述高產(chǎn)3-羥基丙酸工程菌以解脂耶氏酵母為底盤(pán)菌，表達(dá)c.aurantiacus來(lái)源的丙二酰-輔酶a還原酶，且構(gòu)建不同強(qiáng)度啟動(dòng)子組合平衡mcr-c與mcr-n的基因表達(dá)量，通過(guò)動(dòng)態(tài)下調(diào)型啟動(dòng)子動(dòng)態(tài)下調(diào)fas1基因，并基于強(qiáng)啟動(dòng)子促進(jìn)前體供應(yīng)基因表達(dá)。

13、其中，所述底盤(pán)菌為解脂耶氏酵母po1f。

14、所述表達(dá)c.aurantiacus來(lái)源的丙二酰-輔酶a還原酶mcr，且構(gòu)建不同強(qiáng)度啟動(dòng)子組合平衡mcr-c與mcr-n的基因表達(dá)量的具體方法包括：將mcr拆分為mcr-n(第1-549個(gè)氨基酸殘基部分)和mcr-c(第550-1219個(gè)氨基酸殘基部分)，mcr-c和mcr-n基因使用上述啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控，構(gòu)建整合型表達(dá)載體，并將其整合到解脂耶氏酵母基因組中。

15、進(jìn)一步的，對(duì)所述丙二酰-輔酶a還原酶mcr進(jìn)行突變，從而提高mcr-c的酶活，所述突變位點(diǎn)為n940v，k1106w和s1114r。

16、進(jìn)一步的，所述mcr-c由pc48啟動(dòng)子調(diào)控；所述mcr-n基因由pc12(seq?id?no.9)、pc37(seq?id?no.10)、pu01(seq?id?no.1)、pu06(seq?id?no.3)、pu04(seq?id?no.2)中的任意一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控，優(yōu)選啟動(dòng)子為pc37。

17、進(jìn)一步的，所述通過(guò)動(dòng)態(tài)下調(diào)型啟動(dòng)子動(dòng)態(tài)下調(diào)fas1基因中，所述動(dòng)態(tài)下調(diào)型啟動(dòng)子包括pd19(seq?id?no.6)、pd20(seq?id?no.7)和pd21(seq?id?no.8)，優(yōu)選為pd19。

18、進(jìn)一步的，基于強(qiáng)啟動(dòng)子促進(jìn)前體供應(yīng)基因表達(dá)中，所述強(qiáng)啟動(dòng)子包括pu12(seqid?no.4)、pu13(seq?id?no.5)、pc48(seq?id?no.11)中的任意一個(gè)。

19、前體供應(yīng)基因包括acl1、acl2、acc1、pdc、ald和acs基因中的任意一個(gè)或多個(gè)；

20、更具體的，所述基于強(qiáng)啟動(dòng)子促進(jìn)前體供應(yīng)基因表達(dá)為使用pu13促進(jìn)前體供應(yīng)基因acc1的表達(dá)。

21、本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供一種生物合成3-羥基丙酸的方法，所述方法包括：對(duì)上述高產(chǎn)3-羥基丙酸工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

22、進(jìn)一步的，所述發(fā)酵培養(yǎng)方式可以為分批補(bǔ)料發(fā)酵，具體發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，葡萄糖的初始濃度為40g/l，發(fā)酵液ph控制在6.0，攪拌轉(zhuǎn)速在200～700rpm，通氣量為1vvm，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度低于10g/l時(shí)，及時(shí)的補(bǔ)加適量滅菌處理的70％葡萄糖母液。

23、上述一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案的有益技術(shù)效果：

24、(1)上述技術(shù)方案基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，結(jié)合熒光表征結(jié)果，獲得了一系列解脂耶氏酵母生長(zhǎng)調(diào)節(jié)型天然啟動(dòng)子和梯度強(qiáng)度型天然啟動(dòng)子，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)上調(diào)或下調(diào)，這是首次在解脂耶氏酵母中獲得通用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子；梯度強(qiáng)度型啟動(dòng)子擴(kuò)大了可調(diào)控基因表達(dá)的范圍，同時(shí)，有3個(gè)啟動(dòng)子(pu12、pc48、pu13)的表達(dá)強(qiáng)度分別為目前報(bào)道的強(qiáng)啟動(dòng)子ptefin的1.10倍、1.48倍和1.69倍。以上挖掘到的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子和新型強(qiáng)啟動(dòng)子為合成生物學(xué)和代謝工程提供了新的通用型元件。

25、(2)上述技術(shù)方案利用篩選到的新型啟動(dòng)子組合構(gòu)建3-hp生物合成途徑，并通過(guò)動(dòng)態(tài)下調(diào)型啟動(dòng)子調(diào)控競(jìng)爭(zhēng)途徑、強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控前體供應(yīng)的模塊化調(diào)控策略，優(yōu)化解脂耶氏酵母的代謝途徑和生物過(guò)程，獲得了一株利用葡萄糖高效合成3-hp的解脂耶氏酵母菌株，產(chǎn)量達(dá)到100.37g/l，這是目前為止已報(bào)道以葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)3-hp的最高產(chǎn)量，對(duì)于提升微生物工業(yè)化生產(chǎn)3-hp打下了良好基礎(chǔ)。

26、(3)通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行精細(xì)截短，挖掘潛在的新的上游激活序列(uas)，為構(gòu)建人工合成的雜交啟動(dòng)子提供了更多選擇。