本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程，尤其涉及一種微操作機(jī)器人的載細(xì)胞微凝膠組裝方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、載細(xì)胞微凝膠組裝技術(shù)是一種將細(xì)胞培養(yǎng)在微米尺度的凝膠載體中，并對(duì)形成的細(xì)胞球體(即載細(xì)胞微凝膠)進(jìn)行組裝和培養(yǎng)的方法。這種技術(shù)可以提供一種支架或基質(zhì)，使得細(xì)胞可以在其中生長(zhǎng)、擴(kuò)增和相互作用。而基于細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的載細(xì)胞微凝膠組裝技術(shù)則是將不同類型的細(xì)胞分別載入到微凝膠中，使它們能夠在這個(gè)微環(huán)境中相遇、交流和相互作用。

2、這種技術(shù)的背景可以追溯到細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程領(lǐng)域的發(fā)展。傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)通常是將細(xì)胞直接培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，這種方式難以模擬細(xì)胞在生物體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境和相互作用。而載細(xì)胞微凝膠組裝技術(shù)則通過(guò)提供一種三維結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間距離的控制，更好地模擬了生物體內(nèi)細(xì)胞的微環(huán)境，從而有助于研究細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的機(jī)制和調(diào)控。微凝膠是組織工程中的多功能平臺(tái)，能夠模仿組織重復(fù)構(gòu)建單元和工程細(xì)胞微環(huán)境。此外，微凝膠的組裝可形成更大的支架，滿足了干細(xì)胞研究、個(gè)性化疾病模型以及微型組織工程等領(lǐng)域?qū)w外生成具有受控和空間組織異質(zhì)性所具有的3d細(xì)胞微環(huán)境的需求，這一需求正日益增長(zhǎng)。由于細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)相互作用對(duì)于細(xì)胞和組織功能至關(guān)重要，因此對(duì)細(xì)胞微環(huán)境的精確控制對(duì)于制造仿生組織結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。此外，組裝來(lái)自不同組的負(fù)載細(xì)胞可以在簡(jiǎn)化的條件下模擬復(fù)雜的體內(nèi)過(guò)程，從而產(chǎn)生組織異質(zhì)性。使用微組織作為構(gòu)建塊的生物制造比單個(gè)細(xì)胞具有顯著的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槲⒔M織自組裝更快、更高效，從而縮短了3d構(gòu)建體的成熟時(shí)間。

3、由細(xì)胞間相互作用的微凝膠組裝主要通過(guò)模具法實(shí)現(xiàn)，將細(xì)胞接種到微凝膠表面，或者允許細(xì)胞從充滿細(xì)胞的微凝膠內(nèi)遷移/增殖到表面，最后通過(guò)成型方法獲得的宏觀3d結(jié)構(gòu)。例如，在單分散微凝膠的表面培養(yǎng)細(xì)胞，然后將細(xì)胞包被的微凝膠堆疊在模具中以觸發(fā)細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用。

4、但模具法將載細(xì)胞微凝膠置于特定形狀的模具中，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，建立起細(xì)胞間的相互作用而組裝在一起，這種方法存在一些限制。首先，固定模具形狀可能限制了組裝的靈活性和變化性，而且單一組裝模式只能實(shí)現(xiàn)特定的結(jié)構(gòu)。此外，為不同形狀或尺寸的微凝膠定制模具可能增加成本和降低生產(chǎn)效率，特別是對(duì)于小批量或個(gè)性化生產(chǎn)而言。另外，模具法難以在組裝過(guò)程中進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)整或修正，并且在復(fù)雜環(huán)境中的應(yīng)用受到限制。

5、在上述組裝過(guò)程中，位于不同微凝膠表面的細(xì)胞形成細(xì)胞-細(xì)胞連接，細(xì)胞培養(yǎng)基擴(kuò)散穿過(guò)微凝膠之間的空腔以提供營(yíng)養(yǎng)。而這種組裝是細(xì)胞自發(fā)發(fā)生的，不需要額外的化學(xué)物質(zhì)或外部刺激(例如紫外線或交聯(lián)劑)，表明沒(méi)有潛在的生物毒性風(fēng)險(xiǎn)。利用模具法對(duì)載細(xì)胞微凝膠進(jìn)行組裝的方法簡(jiǎn)單易行、成本低廉且適用于批量生產(chǎn)，然而受限于模具形狀、尺寸和空間分辨率，難以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)和精確的細(xì)胞位置控制。因此，盡管在資源有限的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下具有一定優(yōu)勢(shì)，但在需要更精確控制和復(fù)雜結(jié)構(gòu)的研究需求下可能不夠適用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提出了一種微操作機(jī)器人的載細(xì)胞微凝膠組裝方法及應(yīng)用，克服了模板法組裝微凝膠的局限性，增加了組裝的靈活性和變化性。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

3、一方面，本發(fā)明提供了一種微操作機(jī)器人的載細(xì)胞微凝膠組裝方法，所述組裝方法，包括以下步驟：

4、制備多孔微凝膠，所述多孔微凝膠與不同類型的細(xì)胞共同培養(yǎng)，培養(yǎng)成細(xì)胞球體，所述細(xì)胞球體作為基本組裝單元；

5、利用微操作機(jī)器人調(diào)整所述細(xì)胞球體的位置，通過(guò)所述細(xì)胞球體的細(xì)胞之間相互作用，將基本組裝單元組裝一起。

6、在此技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述不同類型的細(xì)胞的數(shù)目為5×104個(gè)/ml。

7、在此技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述載細(xì)胞微凝膠的粒徑為300-500μm。

8、在此技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述微操作機(jī)器人的數(shù)目至少為2個(gè)。

9、在此技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述利用微操作機(jī)器人調(diào)整所述細(xì)胞球體的位置，具體步驟如下：

10、所述微操作機(jī)器人夾持微針，對(duì)微針的針尖在載物臺(tái)上進(jìn)行空間定位，所述微操作機(jī)器人使用所述微針將不同類型的細(xì)胞的載細(xì)胞微凝膠，培養(yǎng)成熟形成細(xì)胞球體，對(duì)所述細(xì)胞球體進(jìn)行聚焦，不斷調(diào)整位置，使所述細(xì)胞球體按需求在空間中分布。

11、在此技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述制備多孔微凝膠，其制備方法，包括以下步驟：

12、將第一內(nèi)流體容器同軸嵌套第一外流體容器，使用第一連接器進(jìn)行密封，所述第一內(nèi)流體容器的入口端為第一入口，所述第一連接器的入口為第二入口，所述第一入口注入內(nèi)流體，所述第二入口注入外流體，混合形成第一前體溶液；

13、將第二內(nèi)流體容器同軸嵌套第二外流體容器，使用第二連接器進(jìn)行密封，所述第二連接器的入口端為第三入口，所述第二內(nèi)流體容器與所述第一外流體容器同軸嵌套，且所述第二內(nèi)流體容器的入口端用于注入所述第一前體溶液，所述第三入口注入連續(xù)流體，所述第二內(nèi)流體容器的出口端用于混合所述第一前體溶液與所述連續(xù)流體，形成第二前體溶液；

14、所述第二前體溶液在剪切力作用下形成液滴，所述液滴經(jīng)過(guò)紫外光照射，得到所述微凝膠。

15、在此技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述第一入口注入內(nèi)流體，所述第二入口注入外流體，混合形成第一前體溶液，所述外流體的成分預(yù)先加熱發(fā)生分解，在所述第一前體溶液中形成氣孔，并在混合中將氣孔帶入所述第二前體溶液，形成液滴，經(jīng)過(guò)紫外光照射，得到所述微凝膠。

16、在此技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述內(nèi)流體的成分包括羧甲基纖維素鈉溶液，所述外流體的成分包括水凝膠溶液，所述連續(xù)流體的成分包括玉米油。

17、在此技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述羧甲基纖維素鈉溶液具體為1％wt羧甲基纖維素鈉溶解于dmem。

18、在此技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述水凝膠溶液具體為8％wt的明膠甲基丙烯酰胺、0.4wt％的羧甲基纖維素鈉和0.25wt％的苯基(2,4,6-三甲基苯甲?；?磷酸鋰鹽，5wt％碳酸氫銨溶解于hepes緩沖液中。

19、在此技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述玉米油具體為玉米油，加入了0.6wt％的司班。

20、第二方面，本發(fā)明還提供了一方面所述基于微操作機(jī)器人的載細(xì)胞微凝膠組裝方法在細(xì)胞培養(yǎng)、藥物釋放或細(xì)胞成像中的應(yīng)用。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)效果主要是：

22、現(xiàn)階段載細(xì)胞微凝膠的組裝主要是基于模具法，相比于模具法，微操作機(jī)器人在載細(xì)胞微凝膠組裝中具有明顯優(yōu)勢(shì)。微操作機(jī)器人具備靈活性和可變性，能夠適應(yīng)不同形狀和尺寸的微凝膠，而無(wú)需重新設(shè)計(jì)模具。其高精度和精確性使得能夠?qū)崿F(xiàn)微米級(jí)的組裝，而自動(dòng)化程度則提高了生產(chǎn)效率并減少了人為錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)。與模具法相比，微操作機(jī)器人可以在組裝過(guò)程中進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)整和監(jiān)控，此外，還可以調(diào)控微凝膠負(fù)載細(xì)胞的類型的密度，因此更適用于各種實(shí)驗(yàn)需求，包括在復(fù)雜環(huán)境中的應(yīng)用。

23、同時(shí)還通過(guò)油包水包水形成液滴，兩個(gè)水相發(fā)生相互作用，由于流體間粘度的差異，會(huì)發(fā)生流體的粘性不穩(wěn)定性，高粘流體在低粘流體里匯流時(shí)，來(lái)自外流的粘性應(yīng)力將作用于內(nèi)流。因此，內(nèi)部流體發(fā)生流動(dòng)振蕩并形成彎曲而不是膨脹，以最大限度地減少粘性耗散，這種現(xiàn)象稱為粘性不穩(wěn)定性。正是因?yàn)檎承圆环€(wěn)定性使得所制備的微凝膠具有內(nèi)部螺旋通道，多孔微凝膠的多層次孔隙結(jié)構(gòu)和內(nèi)部螺旋通道結(jié)合，極大豐富了結(jié)構(gòu)層次性，高比表面積為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了充足的生長(zhǎng)空間和附著位點(diǎn)。

24、本發(fā)明通過(guò)利用細(xì)胞間的自組裝能力或特定的生物材料性質(zhì)，使微凝膠能夠在自然狀態(tài)下自行組裝成所需的結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了無(wú)需模具的組裝過(guò)程。

25、同時(shí)，本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)多尺度范圍內(nèi)的載細(xì)胞微凝膠組裝，包括微米級(jí)到毫米級(jí)的組裝結(jié)構(gòu)，從而滿足不同應(yīng)用場(chǎng)景下對(duì)組裝結(jié)構(gòu)尺度的需求。

26、高通量組裝技術(shù)：創(chuàng)新的技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高通量的組裝過(guò)程，通過(guò)微流控技術(shù)、自動(dòng)化控制系統(tǒng)或并行操作，實(shí)現(xiàn)多個(gè)載細(xì)胞微凝膠的同時(shí)組裝，提高了組裝效率和產(chǎn)量。