本發(fā)明屬于生物傳感器，具體涉及一種基于poly?a金膠比色生物傳感器及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、金納米顆粒(aunps)由于其穩(wěn)定性、易于合成和易于與生物分子(包括dna)功能化以及強(qiáng)的光吸收和散射特性，被廣泛用作生物傳感器中的一種替代信號(hào)報(bào)告劑。這些理想的特性促進(jìn)了一系列分析物(包括金屬離子、小分子和生物分子)的納米金比色法分析的快速發(fā)展，能夠以方便的方式進(jìn)行可視化檢測(cè)。

2、近年來(lái)出現(xiàn)了一種新的基于無(wú)巰基多聚腺嘌呤-aunps(poly?a-au)相互作用的dna探針固定方法，以替代傳統(tǒng)的巰基標(biāo)記的dna探針。poly?a在粘附過(guò)程中可以通過(guò)疏水塌陷的方式高親和力地粘附在金表面，因此用poly?a標(biāo)記的dna探針可以很容易地固定在金表面上。

3、mirnas(micro-rnas)是存在于動(dòng)物、植物和一些病毒中的非編碼短rna，在基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域具有至關(guān)重要的作用。先前的證據(jù)表明，mirnas是轉(zhuǎn)錄后的重要調(diào)節(jié)因子，通過(guò)靶基因降解或翻譯抑制導(dǎo)致基因沉默。除了這種對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用外，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)mirnas失調(diào)與某些類(lèi)型的疾病有關(guān)。因此，高選擇性和高靈敏度識(shí)別mirnas對(duì)于更好地鑒定和分析基因功能具有重要意義。

4、mirna中的let-7a被認(rèn)為與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。開(kāi)發(fā)用于癌癥診斷和治療的不精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方法具有重要意義。然而，由于血清樣品濃度低，檢測(cè)let-7a仍然受到限制。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法已被用于檢測(cè)mirna，例如northern印跡、微陣列技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase?chain?reaction，pcr)等。然而，這些方法通常具有時(shí)間成本高、選擇性低或高度依賴(lài)酶等缺點(diǎn)。因此，需要開(kāi)發(fā)靈敏、低成本的mirna檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于poly?a金膠比色生物傳感器及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種比色法，通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(rca)輔助金納米顆粒(aunps)實(shí)現(xiàn)了對(duì)mirna的超靈敏和特異性檢測(cè)，本發(fā)明的檢測(cè)方法具有低成本、簡(jiǎn)單快速，rca反應(yīng)的溫和條件等優(yōu)勢(shì)，在臨床診斷分析中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，有利于進(jìn)行生物標(biāo)志物的高靈敏檢測(cè)。

2、為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種基于poly?a金膠比色生物傳感器檢測(cè)mirna的方法，所述方法包括：

4、采用含有poly?t的鎖環(huán)探針捕獲被檢測(cè)mirna，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，將滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物與納米金在高鹽濃度和/或低鹽濃度的反應(yīng)體系中進(jìn)行自組裝結(jié)合形成具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的rca-dna-aunps聚合物；通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜法測(cè)量反應(yīng)體系的吸收值；計(jì)算mirna標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中mirna的濃度；

5、所述鎖環(huán)探針中poly?t序列的堿基數(shù)為10-30nt，例如可以是10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt或29nt。

6、優(yōu)選地，所述鎖環(huán)探針中poly?t序列的堿基數(shù)為15-25nt，例如可以是15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt或25nt，進(jìn)一步優(yōu)選為20nt。

7、本發(fā)明中，對(duì)mirna進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)后，得到含有大量poly?a的rca長(zhǎng)單鏈，其中poly?a具有高吸附親和力直接組裝到aunps表面，含有大量poly?a的rca長(zhǎng)單鏈與aunps結(jié)合，形成具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的rca-dna-aunps聚合物，aunps的聚集與否可以通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜法方便地測(cè)量。

8、本發(fā)明中，由于納米金之間的距離與poly?a之間堿基個(gè)數(shù)有關(guān)，因此可以通過(guò)改變模板上poly?t的間的堿基個(gè)數(shù)來(lái)控制擴(kuò)增后poly?a之間的距離。隨著poly?a之間堿基個(gè)數(shù)的減少，溶液中納米金間的距離逐漸減小，表示在結(jié)果為a525/a610比值減小，即聚集程度增大。當(dāng)poly?a的長(zhǎng)度從10nt增加到20nt時(shí)，a525/a610比值增加，且當(dāng)poly?a數(shù)量為20nt時(shí)具有最高的信噪比，然而poly?a的長(zhǎng)度增加到30nt時(shí)，實(shí)驗(yàn)信號(hào)下降，這可能是因?yàn)檩^長(zhǎng)的dna鏈影響了poly?a與納米金的結(jié)合效率。

9、優(yōu)選地，所述吸收值為525-610nm處的吸收值。

10、優(yōu)選地，所述高鹽濃度的反應(yīng)體系中含有0.05-0.11m無(wú)機(jī)鹽，例如可以是0.05m、0.06m、0.07m、0.08m、0.09m、0.1m或0.11m等。

11、優(yōu)選地，所述低鹽濃度的反應(yīng)體系中含有0-0.01m無(wú)機(jī)鹽，例如可以是0m或0.01m等。

12、本發(fā)明中，目標(biāo)mirna存在時(shí)，mirna與掛鎖探針結(jié)合形成環(huán)形模板，從而啟動(dòng)rca。由于掛鎖探針含有連續(xù)t堿基，因此形成了具有大量poly?a的rca產(chǎn)物，基于mirna的rca產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)dna-aunps組裝形成具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的rca-dna-aunps聚合物。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同鹽濃度下的rca-dna-aunps的吸光度。其中，高鹽濃度的反應(yīng)體系的a525/a610比值，記為a2；低鹽濃度的反應(yīng)體系的a525/a610比值，記為a1。并通過(guò)a1/a2實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)mirna的檢測(cè)。該策略直接使用傳統(tǒng)rca的圓形模板，簡(jiǎn)便易合成。所設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)提高了目標(biāo)識(shí)別的特異性，且僅利用紫外分光光度計(jì)作為rca實(shí)驗(yàn)的信號(hào)輸出系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)信號(hào)的超靈敏檢測(cè)。

13、優(yōu)選地，所述含有poly?t的鎖環(huán)探針包括捕獲序列1、poly?t序列和捕獲序列2。

14、優(yōu)選地，所述捕獲序列1的堿基數(shù)為8-15nt，例如可以是8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt或15nt；所述捕獲序列1與靶標(biāo)mirna的一端互補(bǔ)配對(duì)。

15、優(yōu)選地，所述捕獲序列2的堿基數(shù)為8-15nt，例如可以是8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt或15nt；所述捕獲序列2與靶標(biāo)mirna的一端互補(bǔ)配對(duì)。

16、優(yōu)選地，所述滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)包括如下步驟：

17、采用含有poly?t的鎖環(huán)探針捕獲mirna，結(jié)合形成不完全閉合環(huán)狀寡核苷酸，在連接酶的作用下形成完全閉合的環(huán)狀掛鎖探針；進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，得到含有poly?a序列和與mirna互補(bǔ)配對(duì)的序列的滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物。

18、優(yōu)選地，所述滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)間為1.5-2.5h，例如可以是1.5h、2h或2.5h等，優(yōu)選為1.5h。

19、本發(fā)明中，滾環(huán)擴(kuò)增時(shí)間也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)重要因素，rca產(chǎn)物的量及長(zhǎng)度僅與rca時(shí)間有關(guān)，隨著rca時(shí)間的延長(zhǎng)，信號(hào)值逐漸增高，且隨著rca產(chǎn)物的增多，poly?a能夠包裹更多納米金，保護(hù)其在高鹽環(huán)境中不聚沉。在一個(gè)實(shí)施例中在擴(kuò)增時(shí)間達(dá)到1.5h時(shí)，信號(hào)值不再發(fā)生變化。

20、優(yōu)選地，所述滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物與納米金自組裝結(jié)合的反應(yīng)體系包括：納米金、bspp、無(wú)機(jī)鹽和滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物。

21、本發(fā)明中，在反應(yīng)體系中加入bspp能夠提高納米金的穩(wěn)定性，有利于后續(xù)檢測(cè)。

22、優(yōu)選地，所述反應(yīng)體系中納米金的終濃度為3-6nm，例如可以是3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm或6nm等。

23、優(yōu)選地，所述反應(yīng)體系中bspp的終濃度為0.2-0.4mg/ml，例如可以是0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml或0.4mg/ml等。

24、優(yōu)選地，所述無(wú)機(jī)鹽為nacl。

25、優(yōu)選地，所述滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物與納米金自組裝結(jié)合的反應(yīng)時(shí)間為0.5-2.5h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h或2.5h等，優(yōu)選為1-2h。

26、本發(fā)明中，自組裝結(jié)合的反應(yīng)時(shí)間在2h之后，信號(hào)趨于穩(wěn)定。

27、優(yōu)選地，所述滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物與納米金自組裝結(jié)合的反應(yīng)溫度為25-37℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃等。

28、研究人員多用冷凍法來(lái)提高poly?a與納米金之間的結(jié)合能力及效率，為了研究不同溫度條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，本發(fā)明選取了溫度為25℃、37℃以及-80℃條件下的產(chǎn)物進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，自組裝結(jié)合的反應(yīng)溫度從25℃增加到37℃時(shí)，實(shí)驗(yàn)信號(hào)增加，而溫度為-80℃時(shí)，實(shí)驗(yàn)信號(hào)降低。

29、優(yōu)選地，所述基于poly?a金膠比色生物傳感器檢測(cè)mirna的方法包括：

30、(a)采用含有poly?t的鎖環(huán)探針用于捕獲被檢測(cè)mirna，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，所述鎖環(huán)探針中poly?t序列的堿基數(shù)為10-30nt；得到含有poly?a序列和與mirna互補(bǔ)配對(duì)的序列的滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物；

31、(b)將滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物與納米金在高鹽濃度和/或低鹽濃度的反應(yīng)體系中進(jìn)行自組裝結(jié)合形成具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的rca-dna-aunps聚合物，通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜法測(cè)量反應(yīng)體系在525-610nm處的吸收值；所述高鹽濃度的反應(yīng)體系中含有0.05-0.11m無(wú)機(jī)鹽；所述低鹽濃度的反應(yīng)體系中含有0-0.01m無(wú)機(jī)鹽；

32、(c)計(jì)算低鹽濃度的反應(yīng)體系的a525/a610比值，記為a1，根據(jù)不同濃度的mirna標(biāo)準(zhǔn)溶液的a1，作mirna濃度對(duì)數(shù)-a1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的低鹽濃度的反應(yīng)體系的a1計(jì)算所含mirna的濃度；

33、或，計(jì)算高鹽濃度的反應(yīng)體系的a525/a610比值，記為a2，根據(jù)不同濃度的mirna標(biāo)準(zhǔn)溶液的a2，作mirna濃度對(duì)數(shù)-a2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的低鹽濃度的反應(yīng)體系的a2計(jì)算所含mirna的濃度；

34、或，計(jì)算a1/a2的比值，作mirna濃度對(duì)數(shù)-a1/a2的比值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的a1/a2的比值計(jì)算所含mirna的濃度。

35、本發(fā)明中，poly?a與納米金有較強(qiáng)的結(jié)合能力，因此當(dāng)大量有序間隔的poly?a存在時(shí)，可以捕獲溶液中的納米金，使其成為串珠狀，同時(shí)拉近了納米金之間的距離，而利用紫外分光光度計(jì)便可以量化這一現(xiàn)象，其中a525/a610可以反映溶液中納米金的聚集情況，比值越小也就意味著聚集程度增大。

36、本發(fā)明中，可以分別基于不同鹽濃度下反應(yīng)體系的吸收值a525/a610，建立mirna濃度對(duì)數(shù)-吸收值a525/a610的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行mirna的濃度的檢測(cè)。

37、本發(fā)明的生物傳感器在不同鹽濃度下的聚集離散程度不同，利用這兩種翻轉(zhuǎn)的現(xiàn)象實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的增強(qiáng)，將不同鹽濃度下的紫外吸收值比值來(lái)確定被檢測(cè)rna的量，且檢測(cè)過(guò)程中納米金無(wú)需格外修飾，這種方法大大提高了靈敏度，檢測(cè)限(lod)為0.42fm。

38、具體地，當(dāng)溶液中nacl濃度為0m時(shí)，隨著poly?a嵌段逐漸增多，能夠拉近納米金之間的距離，因此a525/a610呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

39、而當(dāng)溶液中nacl濃度增大時(shí)，包裹在納米金表面的poly?a能夠保護(hù)其免受鹽離子的干擾聚沉，因此當(dāng)初始投料量相同時(shí)，溶液中的預(yù)成環(huán)序列能夠利用少量的目標(biāo)物成環(huán)，在后續(xù)rca過(guò)程中產(chǎn)生大量poly?a纏繞在納米金表面，因此a525/a610比值逐漸增大。

40、基于以上的兩種信號(hào)相反的現(xiàn)象，本文利用二者比值，即a1/a2(a1為溶液中nacl濃度較低時(shí)的a525/a610，a2為nacl濃度增大時(shí)的a525/a610)進(jìn)行信號(hào)放大，從而能夠評(píng)估溶液中的目標(biāo)物濃度，進(jìn)行后續(xù)實(shí)際樣品檢測(cè)。

41、第二方面，本發(fā)明提供一種基于poly?a金膠比色生物傳感器，所述生物傳感器包括：含有poly?t的鎖環(huán)探針、納米金和被檢測(cè)mirna；

42、所述含有poly?t的鎖環(huán)探針用于捕獲被檢測(cè)mirna，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，得到含有polya序列和與mirna互補(bǔ)配對(duì)的序列的滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物；所述鎖環(huán)探針中poly?t序列的堿基數(shù)為10-30nt，例如可以是10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt或29nt；

43、所述納米金用于與滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物在高鹽濃度和/或低鹽濃度的反應(yīng)體系中進(jìn)行自組裝結(jié)合形成具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的rca-dna-aunps聚合物；所述高鹽濃度的反應(yīng)體系中含有0.05-0.11m無(wú)機(jī)鹽；所述低鹽濃度的反應(yīng)體系中含有0-0.01m無(wú)機(jī)鹽。

44、其中，0.05-0.11m無(wú)機(jī)鹽例如可以是0.05m、0.06m、0.07m、0.08m、0.09m、0.1m或0.11m等；0-0.01m無(wú)機(jī)鹽例如可以是0m或0.01m等。

45、優(yōu)選地，計(jì)算所述生物傳感器基于低鹽濃度的反應(yīng)體系的a525/a610比值a1，作mirna濃度對(duì)數(shù)-a1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣本中所含mirna的濃度；

46、或，計(jì)算所述生物傳感器基于高鹽濃度的反應(yīng)體系的a525/a610比值a2，作mirna濃度對(duì)數(shù)-a2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣本中所含mirna的濃度；

47、或，計(jì)算所述生物傳感器的a1/a2的比值，作mirna濃度對(duì)數(shù)-a1/a2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣本中所含mirna的濃度。

48、優(yōu)選地，所述滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)間為1.5-2.5h，例如可以是1.5h、2h或2.5h等，優(yōu)選為1.5h。

49、優(yōu)選地，所述含有poly?t的鎖環(huán)探針包括捕獲序列1、poly?t序列和捕獲序列2。

50、優(yōu)選地，所述捕獲序列1的堿基數(shù)為8-15nt，例如可以是8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt或15nt；所述捕獲序列1與靶標(biāo)mirna的一端互補(bǔ)配對(duì)。

51、優(yōu)選地，所述捕獲序列2的堿基數(shù)為8-15nt，例如可以是8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt或15nt；所述捕獲序列2與靶標(biāo)mirna的一端互補(bǔ)配對(duì)。

52、優(yōu)選地，所述單鏈dna大分子產(chǎn)物與納米金結(jié)合的反應(yīng)體系包括：納米金、bspp、無(wú)機(jī)鹽和單鏈dna大分子產(chǎn)物。

53、優(yōu)選地，所述反應(yīng)體系中納米金的終濃度為3-6nm，例如可以是3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm或6nm等。

54、優(yōu)選地，所述反應(yīng)體系中bspp的終濃度為0.2-0.4mg/ml，例如可以是0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml或0.4mg/ml等。

55、優(yōu)選地，所述無(wú)機(jī)鹽為nacl。

56、優(yōu)選地，所述滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物與納米金自組裝結(jié)合的反應(yīng)時(shí)間為0.5-2.5h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h或2.5h等，優(yōu)選為1-2h。

57、優(yōu)選地，所述滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物與納米金自組裝結(jié)合的反應(yīng)溫度為25-37℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃等。

58、第三方面，本發(fā)明提供一種基于poly?a金膠比色檢測(cè)mirna的試劑盒，所述試劑盒中包括第二方面所述的基于poly?a金膠比色生物傳感器。

59、第四方面，本發(fā)明提供第一方面所述的基于poly?a金膠比色生物傳感器檢測(cè)mirna的方法、第二方面所述的基于poly?a金膠比色生物傳感器或第三方面所述的基于poly?a金膠比色檢測(cè)mirna的試劑盒中任意一種或至少兩種的組合在mirna檢測(cè)中的應(yīng)用。

60、第五方面，本發(fā)明提供第二方面所述的基于poly?a金膠比色生物傳感器和/或第三方面所述的基于poly?a金膠比色檢測(cè)mirna的試劑盒在制備檢測(cè)mirna的品中的應(yīng)用。

61、本發(fā)明所述的數(shù)值范圍不僅包括上述列舉的點(diǎn)值，還包括沒(méi)有列舉出的上述數(shù)值范圍之間的任意的點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

62、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

63、本發(fā)明成功地開(kāi)發(fā)了一種利用滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行mirna比色檢測(cè)的策略，擴(kuò)增出的大量poly?a在生物傳感器中起著關(guān)鍵作用，poly?a片段與納米金顯示出優(yōu)異的吸附能力，相較于傳統(tǒng)的sh-aunps提高了組裝效率，簡(jiǎn)化組裝流程。作為一種新的mirna檢測(cè)策略，poly?a-aunps方法顯著降低了經(jīng)濟(jì)成本，并且可以通過(guò)修改探針序列來(lái)方便地?cái)U(kuò)展其功能。此外，該生物傳感器的檢測(cè)不需要特殊的儀器，是一種方便的光學(xué)檢測(cè)方法，檢測(cè)線可低至0.42fmol/l。不僅為mirna快速檢測(cè)提供了的技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)開(kāi)發(fā)多功能poly?a-aunps探針開(kāi)辟了一條新的途徑。